實時熒光定量PCR實驗結(jié)果分析

1、鄧椋爻 技術(shù)支持廣州市昊洋貿(mào)易有限公司u定量分析絕對定量相對定量u定性分析SNP分析，基因掃描陰陽性判定熔解曲線分析絕對定量：How Many優(yōu)點：給出目標基因初始模板的絕對數(shù)量，數(shù)據(jù)容易處理缺點：必須有標準品，做標準曲線應(yīng)用：病毒拷貝數(shù)；轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)；轉(zhuǎn)基因成分百分含量檢測相對定量:How Much 優(yōu)點：需要/不需要標準品；使用廣泛缺點：數(shù)據(jù)理解困難應(yīng)用：差異表達分析；芯片評估14500 copies108106102104108106102104T108106102104T10105 5 copies/well copies/well1/3Blank1/31/31/31.11 ng/2

2、ul0.37 ng/2ul0.12 ng/2ul10.0 ng/2ul3.33 ng/2ulTControl CT = 21.3Sample A CT = 22.8Sample B CT = 19.3 Control CT = 21.3 = 1.5ng / tube 1Sample A CT = 22.8 = 0.5ng / tube 0.33Sample B CT = 19.3 = 6.0ng / tube 4Fold管家基因校準(Normalization Gene)得出每個細胞中的目的基因目標基因vs. 管家基因?qū)φ諛悠沸?Calibrator Sample)得出相對于某個樣品的基因表

3、達量, 1X sample.處理的vs. 未處理的，6hr vs. 0 hr, 病理vs. 正常.目標基因管家基因處理后處理前ERBB2GAPDHSampleCalibrator按比例稀釋標準品，根據(jù)標準曲線確定樣本初始模板濃度至少需要兩個標準曲線GOIreference gene標準曲線確定反應(yīng)擴增效率依據(jù)：平均相對含量% = 2 平均CT數(shù)據(jù)處理： C（t）GOI- C（t）ref= C（t） C（t）sample- C（t）calibrator= C（t）好處：不做標準曲線應(yīng)用范圍：擴增效率較高，目標基因和內(nèi)標基因擴增效率一致并且相互獨立擴增；不做標準曲線，高通量檢測（芯片評估）；不要求

4、很高的精度RNA提取RT-qPCR實驗結(jié)果分析RNA定量反轉(zhuǎn)錄(RT)設(shè)計qPCR實驗方法Aurum Total RNA kitiScript cDNA Synthesis Kit已知在50%的乳腺腫瘤樣本中，ERBB2表達異常，因此可以作為一個檢測標準選用GAPDH作為內(nèi)標基因 FAM標記的ERBB2探針 VIC標記的GAPDH探針標準品（質(zhì)粒）構(gòu)造標準曲線多重PCR反應(yīng)陰性對照 無RNA對照（空白） 無逆轉(zhuǎn)錄酶對照（監(jiān)控基因組污染）Experion RNA StdSens Chip5-500 ng/ml100-6,000 ntExperion RNA HighSens Chip0.1-5

5、ng/ml100-6,000 nt乳癌組織 RNA正常乳腺組織 RNA5 hr. at 90CIntactIntact7 hr. at 90CIntact7 hr. degradationGAPDH geneIntact5 hr. degradation在不同的反應(yīng)管中運行RT & PCR1. 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 加熱滅活反轉(zhuǎn)酶2. PCR 反應(yīng)2. PCR 反應(yīng)1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)25C 5 min42C 30 min85C 5 min 冷卻至4C iScript cDNA Synthesis Kit定性條件摸索熒光化學物質(zhì)SYBR GREEN染料Taqman探針定量PCR條件優(yōu)化單雙通道相互驗證qFam

6、標記目標基因探針qVIC標記看家基因探針動態(tài)溫度梯度動態(tài)溫度梯度5-6oC Below10oC Above預(yù)設(shè)退火溫度預(yù)設(shè)退火溫度Real annealing range 95C,15min94C,15sec60C,1minplate readgo to step 3,39 more times10C,foreverEnd 目標基因： 未知樣品 生成標準曲線： 標準品梯度 監(jiān)控系統(tǒng)故障： 陽性對照 監(jiān)控污染： 陰性對照/基因組對照 校準生物學誤差：看家基因 降低其余誤差： 重復(fù)實驗Color 2 - VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection fo

7、r ERBB2ERBB2單雙通道相互驗證的實驗結(jié)果A.Multiplex ReactionsHealthy RNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65 0.1526.80 0.32B.Singleplex reactionsHealthy RNACarcinoma28.6727.0928.7126.6828.7326.7028.70 0.0326.82 0.24樣品擴增：正常vs腫瘤PMT1-FAM detection- ERBB2PMT2-VIC detection- GAPDH腫瘤腫瘤正常HealthyRNATumorRNAGAPDHER

8、BB210951052213024929550085730136000130800Copies ng/ l Total RNAERBB2 copies / GAPDH copies1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.0122130/136000 = 0.0172492/130800 = 0.0197Healthy RNATumor RNA0.0110.0180.018/ 0.0111.63HealthyTissueCarc.TissueRelative Expression00.20.40.60.811.21.41.61.82C(t)=4.41-5.18=-0.770.182-c(t) =1.511.93結(jié)果與雙標準曲線法相近結(jié)果與雙標準曲線法相近Healthy RNABBER2GAPDHC(t)28.4023.27