BrdU標(biāo)記在大鼠睪丸支持細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用

1、BrdU標(biāo)記在大鼠睪丸支持細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用        【摘要】  目的: 探討大鼠睪丸支持細(xì)胞原代培養(yǎng)5溴2脫氧尿苷（BrdU）的最佳標(biāo)記時(shí)間、 劑量。方法: 大鼠睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行體外原代培養(yǎng); 以終濃度分別為5、 10、 15、 20 mol/L的BrdU檢測(cè)睪丸支持細(xì)胞的最佳標(biāo)記劑量; 在細(xì)胞培養(yǎng)的12、 24、 36、 48 h摻入BrdU, 使終濃度為15 mol/L, 測(cè)定BrdU的最佳標(biāo)記時(shí)間; 免疫細(xì)胞化學(xué)法跟蹤觀察大鼠睪丸支持細(xì)胞在體外培養(yǎng)中的分化發(fā)育情況和BrdU標(biāo)記率。結(jié)果:

2、免疫組化檢查提示最終濃度為15 mol/L和孵育36 h BrdU標(biāo)記率均>90%, 并且連續(xù)傳3代均可檢測(cè)到。結(jié)論: 終濃度15 mol/L及孵育36 h為BrdU標(biāo)記睪丸支持細(xì)胞的最佳劑量及時(shí)間, 表明BrdU 標(biāo)記可用于睪丸支持細(xì)胞體內(nèi)后的存活、 生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)觀察。 【關(guān)鍵詞】  睪丸支持細(xì)胞 體外培養(yǎng) BrdU    5溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記法作為一種簡(jiǎn)便、 敏感、 特異的檢測(cè)方法, 在醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。BrdU摻入合成的強(qiáng)度可直接顯示細(xì)胞增殖的能力, 同時(shí)能避免以往應(yīng)用3HTdR檢測(cè)對(duì)細(xì)胞的放射性損害1。睪丸支持細(xì)胞缺

3、乏有效的標(biāo)記方法, 因此本實(shí)驗(yàn)的目的是應(yīng)用BrdU體外標(biāo)記原代大鼠睪丸支持細(xì)胞（sertoli cell）, 觀察最佳標(biāo)記時(shí)間及標(biāo)記量, 從而為追蹤BrdU標(biāo)記的睪丸支持細(xì)胞移植入體內(nèi)后的存活、 生長(zhǎng)及分化的動(dòng)態(tài)變化過程打下基礎(chǔ)。1  材料和方法1.1  材料 SD雄性大鼠（體質(zhì)量約100 g, 1722 日齡）購于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心;  DMEMF12培養(yǎng)基、 優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自Gibco公司, 膠原酶、 胰酶、 BrdU購自Sigma公司; 抗 BrdU抗體及SABC試劑盒均購自武漢博士德公司。1.2  方法取大鼠睪丸, 剝除被膜, 收

4、集睪丸實(shí)質(zhì)于50 mL離心管中, 4 900 r/min離心4 min, 傾去上清。按每克睪丸組織加8 mL 2.5 g/L胰蛋白酶, 32 210 r/min振蕩、 消化30 min。加入培養(yǎng)液終止消化, 待組織沉降后, 棄去上清。重復(fù)此步驟3次。再以每克睪丸組織加6 mL1 g/L 型膠原酶, 34 210 r/min振蕩, 消化30 min。用100目鋼篩過慮收集細(xì)胞, 900 r/min離心10 min, 收集細(xì)胞, 用含100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液洗3次（900 r/min, 3 min）, 稀釋細(xì)胞至1.5×109/L, 接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶。34、 CO2培

5、養(yǎng)箱中50 mL/LCO2培養(yǎng)48 h, 于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況（圖1）, 吸去培養(yǎng)液后加入20 mmol/L, pH7.4的TrisHCl緩沖液低滲處理3 min后, 用培養(yǎng)液洗滌2次, 洗去大部分生精細(xì)胞。加入含100 mL/L胎牛血清的DMEMF12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng), 逐日更換培養(yǎng)液并進(jìn)行觀察。將培養(yǎng)的支持細(xì)胞用2.5 g/L胰酶消化并洗滌后, 接種到1個(gè)6孔板中, 并在6孔板中各孔加入1塊經(jīng)多聚賴氨酸包被的蓋玻片, 將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng), 待細(xì)胞生長(zhǎng)于載玻片后, 將載玻片取出, 在Carnoy中固定12 min。950 mL/L、 700 mL/L乙醇、 蒸餾水及鹽酸分步漂

6、洗; 置于60的1 mmol/L HCl 12 min后在冷鹽酸中漂洗; chiff試劑內(nèi)2 h; 入100  mL/L偏重亞硫酸鈉溶液除去非特異染色后, 經(jīng)自來水、 蒸餾水、 700 mL/L、 950 mL/L及1000 mL/L乙醇分步洗滌, 固綠染色; 顯微鏡下觀察并攝片（圖1）。收集培養(yǎng)68 d的支持細(xì)胞, 在25 g/L戊二醛固定液中預(yù)固定, 經(jīng)鋨酸后固定、 脫水、 包埋、 半薄切片定位、 超薄切片等步驟后, 在JEOL JEM1220透射顯微鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)。每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況, 繪制大鼠睪丸支持細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。以1×105/L將睪丸支持細(xì)胞接種于爬片處理的

7、6孔板中, 并以終濃度分別為5、 10、 15、 20 mol/L的BrdU檢測(cè)睪丸支持細(xì)胞的最佳標(biāo)記劑量; 在細(xì)胞培養(yǎng)的12、 24、 36、 48 h摻入BrdU, 使終濃度為15 mol/L, 測(cè)定BrdU的最佳標(biāo)記時(shí)間; 設(shè)定正常對(duì)照組觀察BrdU有無細(xì)胞毒性。隨機(jī)數(shù)取10個(gè)非重疊視野（×100）, BrdU 陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。具體步驟如下: （1）PBS清洗標(biāo)本3 次各1 min; （2）40 g/L多聚甲醛固定30 min, PBS沖洗5 min, 3次; （3）30 mL/L H2O2于室溫封閉內(nèi)源性過氧化氫酶30 min, PBS沖洗5 min, 3次; （4

8、）2N HCl于室溫下變性3045 min, 使其雙螺旋打開暴露BrdU標(biāo)記部位。（5）120正常山羊血清封閉20 min, 甩去多余的液體不洗; （6）抗BrdU 一抗（130） 4濕盒中過夜、 PBS沖洗5 min, 3次; （7）山羊抗小鼠cy3孵育45 min, PBS漂洗3次, 每次3 min; （8）DAPI復(fù)染, 熒光倒置顯微鏡觀察（圖1）。以上每步間必須用PBS緩沖液充分振洗后方可繼續(xù)下一步驟。陽性對(duì)照為BrdU標(biāo)記的睪丸支持細(xì)胞, 陰性對(duì)照為未經(jīng)BrdU標(biāo)記的睪丸支持細(xì)胞, 空白對(duì)照以PBS替代一抗。各組BrdU 標(biāo)記率的比較采用2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

9、2  結(jié)果2.1  睪丸支持細(xì)胞的傳代、 擴(kuò)增與純化 單個(gè)睪丸支持細(xì)胞懸液接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶,支持細(xì)胞貼壁性比較強(qiáng), 培養(yǎng)24 h之后, 大多數(shù)細(xì)胞開始貼壁, 培養(yǎng)液中漂浮著較多生精細(xì)胞。培養(yǎng)48 h之后, 胞質(zhì)逐漸增多, 折光性減弱。34 d后支持細(xì)胞胞質(zhì)鋪展, 細(xì)胞間隙變小。46 d后胞質(zhì)完全鋪開, 細(xì)胞相互連接, 鋪展成膜狀單層。吸去培養(yǎng)液后加入20 mmol/L, pH7.4的TrisHCl緩沖液低滲處理3 min后, 用培養(yǎng)液洗滌2次, 洗去大部分生精細(xì)胞。加入含50 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng), 逐日更換培養(yǎng)液并進(jìn)行觀察。經(jīng)胰酶消化后1

10、2傳代, 培養(yǎng)48 h后, 支持細(xì)胞胞體進(jìn)一步增大, 呈膜狀鋪在培養(yǎng)瓶壁上。細(xì)胞核圓形或橢圓形, 居中或稍偏位, 核仁清晰, 胞質(zhì)中可見較多的顆粒狀物質(zhì)或空泡, 突起進(jìn)一步增多, 并密集交織在一起(圖1), 仍有少量的生精細(xì)胞存在; 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), 培養(yǎng)到第34天后, 支持細(xì)胞融合成片, 折光性減弱。根據(jù)Moss等形態(tài)學(xué)及胞內(nèi)空泡的檢測(cè), 支持細(xì)胞約占細(xì)胞總量的90%以上。Sertoli細(xì)胞在體外培養(yǎng)增殖旺盛, 培養(yǎng)至20 d細(xì)胞仍存活良好。2.2  Feulgen染色和透射電鏡觀察 對(duì)培養(yǎng)8 d的Sertoli細(xì)胞進(jìn)行Feulgen染色（圖1）, 胞質(zhì)不著色, 核內(nèi)

11、淡染, 核內(nèi)有著色的顆粒, 為核仁周圍的衛(wèi)星核小體。透射電鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)可見很多線粒體、 溶酶體、 脂滴、 糖原顆粒、 滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。Sertoli細(xì)胞的核呈不規(guī)則形, 核膜具有較多的皺褶, 核染色質(zhì)稀疏, 染色淺, 核仁明顯, 核仁周圍有衛(wèi)星核小體。國外學(xué)者多強(qiáng)調(diào)觀察到核仁兩側(cè)的衛(wèi)星核小體, 可確定是支持細(xì)胞。Feulgen染色和電鏡都觀察到了衛(wèi)星核小體, 證實(shí)了確實(shí)為Sertoli細(xì)胞。1         2.3  BrdU標(biāo)記率 以不同濃度標(biāo)記發(fā)現(xiàn), 15 mol/L的Brd

12、U標(biāo)記率>90%, 與20 mol/L的BrdU無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）, 與10 mol/L(LI約70%)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LI約75%, P<0.05）。不同孵育時(shí)間標(biāo)記發(fā)現(xiàn),  孵育12 h即可見BrdU陽性染色細(xì)胞, 標(biāo)記率約為12%; 隨著標(biāo)記時(shí)間延長(zhǎng)陽性細(xì)胞數(shù)增多, 標(biāo)記36 h細(xì)胞陽率>90%。但標(biāo)記時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目無明顯增多, 標(biāo)記36 h組與48 h組之間的陽性細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。為此, 我們發(fā)現(xiàn)選用標(biāo)記36 h、 終濃度為15 mol/L作為標(biāo)記時(shí)間, 完全能夠滿足移植細(xì)胞的標(biāo)記需要, 連續(xù)傳代3次后仍可見BrdU免疫染色

13、陽性。在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)、 生長(zhǎng)、 增殖與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3  討論    睪丸支持細(xì)胞是睪丸生精上皮中惟一的非生殖細(xì)胞, 對(duì)生精細(xì)胞起支持和營(yíng)養(yǎng)作用2。近年來研究表明, 支持細(xì)胞還能分泌多種物質(zhì), 包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 調(diào)節(jié)蛋白, 生長(zhǎng)因子, 類固醇及其他一些活性物質(zhì), 這些物質(zhì)在精子發(fā)生過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。另外對(duì)支持細(xì)胞生物特性的研究還揭示, 支持細(xì)胞表達(dá)一種特殊的表面分子FasL, 它可以與免疫細(xì)胞表面的Fas受體結(jié)合, 誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的凋亡2, 故可利用睪丸支持細(xì)胞作為各種免疫豁免細(xì)胞來源, 可植入體內(nèi)發(fā)揮其免疫豁免作用, 但是體

14、內(nèi)細(xì)胞移植的眾多問題之一是如何簡(jiǎn)便有效的標(biāo)記移植細(xì)胞并跟蹤其在體內(nèi)的存活、 生長(zhǎng)和分化過程3。細(xì)胞標(biāo)記的方法有多種方法4, 當(dāng) BrdU存在于細(xì)胞DNA合成期的時(shí)候, BrdU就會(huì)摻入到新合成的DNA中, 這種存留是永久性的, 經(jīng)免疫組織化學(xué)染色可觀察在摻入細(xì)胞中的BrdU, 故BrdU標(biāo)記和檢測(cè)是反映細(xì)胞增殖及跟蹤檢測(cè)移植細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的理想指標(biāo)3。研究表明, BrdU標(biāo)記結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和 3HTDR放射自顯影技術(shù)2種方法的結(jié)果十分相似5。本試驗(yàn)首次采用BrdU標(biāo)記大鼠睪丸支持細(xì)胞, 并用抗BrdU mAb進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色, 研究結(jié)果表明使用BrdU進(jìn)行標(biāo)記不會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、 增殖

15、及分化, 故應(yīng)用BrdU標(biāo)記細(xì)胞較為安全可靠。BrdU標(biāo)記細(xì)胞48 h, 終濃度為15 mol/L, 時(shí)標(biāo)記率>90%, 且傳代細(xì)胞可連續(xù)標(biāo)記, 提示移植細(xì)胞可在體內(nèi)連續(xù)追蹤觀察。為我們進(jìn)一步追蹤睪丸支持細(xì)胞植入體內(nèi)后的生長(zhǎng)分化提供了理論指導(dǎo)。    通過本試驗(yàn)我們BrdU標(biāo)記大鼠睪丸支持細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是6: （1）簡(jiǎn)單、 快速、 安全檢測(cè)敏感性好; （2）BrdU即可用于活體標(biāo)記, 亦可用于細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定; （3）BrdU標(biāo)記是一種快速、 簡(jiǎn)便、 可靠的方法, 并可選擇適合的雙標(biāo)記或多標(biāo)記方法, 同時(shí)顯示2種以上的標(biāo)記物質(zhì); （4）短時(shí)間內(nèi)可對(duì)批量試驗(yàn)動(dòng)物

16、的標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè); （5）使用BrdU對(duì)標(biāo)記細(xì)胞、 活體細(xì)胞無毒副作用, 為動(dòng)態(tài)觀察移植細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的生存、 生長(zhǎng)和分化過程提供了理論依據(jù)。 【】  1 李春暉, 焦保華, 康春生, 等. 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)、 鑒定及標(biāo)記的初步研究J. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2006, 22(05): 601-602.2 于 磊, 王 禾. 睪丸支持細(xì)胞(sertoli細(xì)胞)與器官移植J. 國外醫(yī)學(xué)·泌尿系統(tǒng)分冊(cè), 2001, 21（6）: 245-247.3 Kaminker P, Plachot C, Kim SH, et al. Higherorder nuclear

17、 organization in growth arrest of human mammary epithelial cells: a novel role for telomereassociated protein TIN2J. J Cell Sci, 2005, 118(3): 1321-1330.4 Staub C, Hue D, Nicolle JC, et al. The whole meiotic pocess can occur in vitro in untransformed rat spermatogenic cellsJ. Exp Cell Res, 2000, 260(1): 85-95.5 Kadiyala