通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲提取澤瀉中多糖以及測定其抗氧化性

1、通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲提取澤瀉中多糖以及測定其抗氧化性趙展翼a，張強(qiáng)b，李亞芳a，董路路a ,*，劉淑林a,c,*a哈爾濱醫(yī)藥大學(xué)藥劑學(xué)學(xué)院，哈爾濱150081，中國b哈爾濱醫(yī)藥大學(xué)圖書館，哈爾濱150081，中國c哈爾濱醫(yī)藥大學(xué)基因組學(xué)研究中心，哈爾濱150081，中國關(guān)鍵詞：澤瀉，多糖，超聲提取，響應(yīng)面分析法，抗氧化性摘要：據(jù)報(bào)道澤瀉（東方澤瀉的根狀莖）中的多糖（RAP）有許多重要的生物活性。然而，RAP的有效提取問題仍尚未解決，在此次研究中，筆者使用超聲波對(duì)RAP進(jìn)行高產(chǎn)量提取，并使用響應(yīng)面分析法（RSM）優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的多元回歸分析，我們應(yīng)用3-D響應(yīng)面和等高線圖來確定優(yōu)

2、化條件，優(yōu)化條件為超聲波在76.1保持75.2分鐘，水料比為 30.1ml/g。在這樣的條件下，產(chǎn)量為6.9%，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的熱水提取的產(chǎn)量（3.41%）。逐步乙醇沉淀的RAPs 表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化性。結(jié)果表明超聲提取是一種非常高效的提取RAP的方法，并且多糖可以作為一種用于醫(yī)藥以及功能保健食品的潛在的抗氧化劑來研究。引言澤瀉(RA)是東方澤瀉(Sam)的根狀莖。Juzep屬于澤瀉科，主要分布于中國，日本和印度（Han et al.,2013；Wu ,2005）。在古代中國的第一部藥學(xué)著作神農(nóng)本草經(jīng)中，RA作為一種優(yōu)質(zhì)藥材被記載（Gu ,2007)。作為一種民間藥物，它用于治療高血壓，高血脂

3、和糖尿?。–hina, 2005; Li & Qu, 2012; Wu, 2005），并且作為傳統(tǒng)中草藥之一包含在藥典之中（China ,2005)。最近，對(duì)RA的研究興趣日漸高漲。因?yàn)閾?jù)報(bào)道，它的許多成分比如三萜烯，澤瀉醇B，特別是多糖具有重要的生物活性，包括抗HCV，抗炎，降血糖以及免疫效應(yīng)（Han et al., 2013; Jiang et al.,2006; Lee et al., 2013; Li & Qu, 2012; Shimizu, Ohtsu, Tomoda,Gonda, & Ohara, 1994; Tomoda, Gonda, Shimizu,

4、& Ohara, 1994)。RAP因其對(duì)脂質(zhì)的抗氧化有抑制作用而被記錄，后者對(duì)人體健康具有潛在的重要性。然而，幾乎沒有關(guān)于有效提取RAP的研究。常見的方法比如通過熱水，浸入以及索氏提取法，往往既費(fèi)時(shí)又昂貴，而且所獲得的RAP量極低，甚至?xí)斐赡承┧幚韺W(xué)作用的喪失(Li, Ding, & Ding,2007; Wang, Cheng, Mao, Fan, & Wu, 2009)。超聲提取技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn)，比如相當(dāng)高的提取量，溫和的溶解環(huán)境，相對(duì)短的提取時(shí)間，等等，因此，已經(jīng)被用于從植物材料中提取優(yōu)質(zhì)生物活性的多糖(Hromadkova &Ebringerova,

5、 2003; Hromadkova, Ebringerova, & Valachovic, 2002;Pan et al., 2010; Ying, Han, & Li, 2011 )。所以，超聲提取技術(shù)被用來提高RAP的提取量而產(chǎn)生對(duì)生物活性最小的影響。為了將這種技術(shù)應(yīng)用于RAP，我們用響應(yīng)面分析法對(duì)提取環(huán)境和步驟進(jìn)行了優(yōu)化，響應(yīng)面分析法是當(dāng)多種因素和反應(yīng)可能對(duì)提取量產(chǎn)生影響時(shí)優(yōu)化反應(yīng)過程的一個(gè)高效手段(Box & Wilson, 1951; PrakashMaran, Manikandan, Thirugnanasambandham, Vigna Nivetha,

6、&Dinesh, 2013)。響應(yīng)面分析法的主要優(yōu)勢在于相當(dāng)程度得減少了評(píng)價(jià)多元變量和它們之間反應(yīng)可能需要的試驗(yàn)的次數(shù)，使得優(yōu)化過程比其他方法更加簡化。在此次研究中，基于單因子實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，三個(gè)主要的影響因子（超聲提取時(shí)間，水料比，超聲提取溫度）被用來優(yōu)化超聲提取RAP的實(shí)驗(yàn)條件。根據(jù)不同分子量的多糖在乙醇中有不同的溶解度，我們用逐步乙醇沉淀法獲得了兩種主要的多糖，它們都表現(xiàn)出強(qiáng)抗氧化性。1、 材料和方法2.1、材料 從黑龍江省采集的澤瀉，從西格瑪化工有限公司購買的DPPH，從西格瑪-奧德里奇購買的葡萄糖，超純水。2.2、RAP的提取和產(chǎn)量的確定 將干燥的RA用研磨機(jī)研磨成粉末(WND-

7、200, Weinengda Instrument Co., Ltd., Zhejiang, China),然后根據(jù)我們之前的工作，在60下用85%乙醇抽提三次，每次五個(gè)小時(shí)，去除脂質(zhì)，色素，氨基酸，單糖和寡糖(Zhao, Xu, Ye, &Dong, 2013)。未溶解的部分通過過濾和干燥從溶劑中分離出來(60 C, 24 h)。接著在一個(gè)特定的超聲提取時(shí)間，水料比和提取溫度下，通過超聲清除器利用經(jīng)過最小程度修改的Zhao et al. (2013) 和 Prakash Maran et al. (2013)的方法將多糖從預(yù)先處理的干燥粉末中抽提出來。 上清液通過真空過濾從未溶解的殘

8、留物中分離出來，接著用謝瓦格法處理(Jia et al.,2014; Sevag, Lackman, & Smolens, 1938)三次以去除蛋白質(zhì) ，然后集中透析兩天去掉蒸餾水(cut-off Mw 3500 Da)。形成的溶液加入無水乙醇產(chǎn)生沉淀，最終濃度為80%，置于4下過夜。通過離心赫爾凍干將沉淀物收集起來獲得RAP。用硫酸苯酚比色法以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)測量糖含量(Balavigneswaran,Sujin Jeba Kumar,Moses Packiaraj,Veeraraj, & Prakash, 2013; Dubois, Gilles, Hamilton, Rebe

9、rs, &Smith, 1951 )。RAP的百分含量可以通過下列公式計(jì)算出來：含量（%）= ×100 (1)WP指的是多糖的質(zhì)量，Wr 指的是原材料的質(zhì)量2.3、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、采用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化提取條 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(Fig. S1)，接下來的實(shí)驗(yàn)將選擇三個(gè)主要的影響因子（超聲提取時(shí)間，水料比，超聲提取溫度）。上述三個(gè)因子對(duì)RAP超聲提取含量的影響通過單因子實(shí)驗(yàn)來研究，詳細(xì)說，就是在一個(gè)特定的超聲提取時(shí)間（從30到90分鐘），水料比（從10到50ml/g ），以及超聲提取溫度（從50到80）下進(jìn)行單因子實(shí)驗(yàn)。在每個(gè)試驗(yàn)中一個(gè)因子改變而其他因子保持不變。通過確定RAP的提取

10、含量來衡量每個(gè)因子的效應(yīng)。件 在單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定了每個(gè)因子的范圍，一個(gè)具有三個(gè)變量（X1超聲提取時(shí)間；X2水料比；X3超聲提取溫度）三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)被用來評(píng)價(jià)RAP提取的最佳條件。對(duì)于數(shù)據(jù)計(jì)算，上述三個(gè)值按照下述等式計(jì)算： i=1,2,3 (2)是變量的編碼值，Xi 是變量的實(shí)際值，X0是Xi 在中心點(diǎn)的實(shí)際值，X是變化值。表1是單獨(dú)變量的范圍和水平。表2是BBD的實(shí)驗(yàn)序列。除了五個(gè)中心點(diǎn)外，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行都是三個(gè)重復(fù)，最后取多糖含量的平均值作為最終值。 為了預(yù)測優(yōu)化條件，二次多項(xiàng)式適用于將獨(dú)立變量和結(jié)果（多糖含量）的關(guān)系聯(lián)系起來。 （3）表2 響應(yīng)面優(yōu)化法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和澤瀉多糖提

11、取量的結(jié)果操作編碼的變量水平含糖量（%）aX1X2X31-1-103.9821-104.183-1104.8041103.555-10-14.75610-13.347-1015.0981015.4990-1-13.421001-13.26110-115.93120115.94130006.82140006.70150006.77160006.73170006.76a每個(gè)值都是三組測量值的平均值Y是預(yù)測值，Xi和Xj是自變量的編碼值，0、i、ii、ij分別是攔截、線性、二次和交互的回歸系數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得到的值都服從多元非線性回歸，這是用設(shè)計(jì)軟件專家繪制的響應(yīng)面圖表。進(jìn)行方差表的分析并確定了線

12、性、二元、交互的效果以及回歸系數(shù)。模型的R2和調(diào)整后的R2值用來檢測模型的準(zhǔn)確性。后來在優(yōu)化條件中進(jìn)行額外的確定實(shí)驗(yàn)用來證明統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的有效性。認(rèn)為當(dāng)P值小于0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.4 與傳統(tǒng)熱水提取的對(duì)比基于預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，預(yù)處理的干燥粉末在水浴中回流提取兩次，提取時(shí)間120分鐘，水料比30ml/g，提取溫度75。根據(jù)2.2描述的步驟，可以獲得RAP并確定提取量。為了研究不同提取方式造成的結(jié)構(gòu)改變，F(xiàn)TIR分光光度計(jì)記錄了兩種方法（超聲提取和熱水提取）提取樣本的傅里葉變換紅外光譜。干燥的樣品與溴化鉀粉末研磨，壓制成顆粒來進(jìn)行頻率范圍從4000-400的 分辨率 最大源孔徑 的光譜測量。

13、2.5 RAP的制備和分餾 通過上述2.2提及的方法對(duì)澤瀉的經(jīng)過前處理的干燥粉末進(jìn)行提取，再通過初步乙醇沉淀的方法進(jìn)行分餾，分餾的步驟如下所示：將無水乙醇緩慢加入提取溶液中使乙醇濃度在40%?；旌先芤涸?下過夜，通過離心和凍干收集沉淀(RAP)。隨后將上清液加入乙醇使最終濃度為80%來沉淀(RAP)第二部分多糖。2.6 RAP的紅外光譜和分子量 天然RAP、RAP和RAP的特征吸收峰可以由FTIR光譜辨別。天然RAP的粉末和它的純化片段與溴化鉀相混合、研磨并壓制進(jìn)行FTIR檢測。步驟與2.4描述的相同。RAP、RAP和RAP的分子量由粘度計(jì)來測定。2.7 抗氧化活性的確定DPPH自由基清除活性

14、的測定 將前面所述的方法進(jìn)行微小的修飾來測量DPPH自由基的清除活性。簡言之，準(zhǔn)備甲醇保存的0.1mM的DPPH溶液，取1ml該溶液加入3ml不同濃度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg/ml）的多糖水溶液。將混合物重復(fù)混勻，在25下于暗處孵育30min。然后在517nm處測量吸光值。反應(yīng)混合物的吸光值越低表明自由基清除活性越高。清除百分比可以由以下公式進(jìn)行計(jì)算：清除活性（%）=A0-(A1-A2)/A0*100 (4)A0是空白對(duì)照（水而不是樣本溶液）的吸光值，A1是樣本的吸光值，A2是樣本在與A1相同的條件下以水代替DPPH溶液的吸光值。自由基清除活性的測定 根據(jù)之前描述的芬頓法

15、，經(jīng)過最小限度的改進(jìn)來測定羥基自由基的清除活性。將樣本溶解于蒸餾水中形成最終的濃度梯度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg/ml），并與9.0mMFeSO4(1.0ml),0.3%H2O2(1.0ml)以及0.5ml的水楊酸乙醇溶液共同孵育（37,30min）。每管混合物的總體積通過加入一定量的蒸餾水而達(dá)到10ml。以空白管作對(duì)照在510nm讀混合物的吸光值。羥基自由基的清除活性可以通過以下公式計(jì)算：清除活性（%）=(A0-A1)/A0*100 （5）A0 和A1代表空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在510nm的吸光值。 超氧陰離子自由基清除活性的測定在弱堿性條件下，超氧陰離子自由基在鄰苯三酚自氧

16、化過程中產(chǎn)生。對(duì)先前所述的方法進(jìn)行微小改進(jìn)來測量超氧陰離子自由基的清除效應(yīng)。簡單來說，就是將不同濃度的樣本（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg/ml）與50mMTris-HCl緩沖液在25下共同孵育20min，然后在相同溫度下加入25mM鄰苯三酚，使反應(yīng)進(jìn)行5分鐘，隨后快速加入1ml8mMHCl終止反應(yīng)。在299nm測量其吸光值。超氧陰離子自由基的清除活性可以通過以下公式計(jì)算：清除活性（%）=（A0-A1）/A0*100 (6)A0是不加樣本的吸光值，A1是加樣本的吸光值。溶血抑制活性的測定本實(shí)驗(yàn)通過將實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行微小的修改來進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)中，我們遵循美國國立醫(yī)學(xué)網(wǎng)站和哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)

17、物倫理委員會(huì)出版的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保健和使用指南這本書的指導(dǎo)。體重在150-200g之間的成年雄性大鼠來自隸屬于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)的哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究中心。環(huán)境溫度控制在22-24之間，50%的相對(duì)濕度和12小時(shí)的光暗周期，給所有大鼠都提供食物和水。簡言之，就是從健康大鼠體內(nèi)提取2.0ml血液裝進(jìn)含有肝素的離心管中，立即在2500轉(zhuǎn)下離心5min以獲得紅細(xì)胞。在4下將紅細(xì)胞在生理鹽水中清洗三次，再在生理鹽水中重懸以獲得2%的紅細(xì)胞懸浮物。將不同濃度的實(shí)驗(yàn)樣本（0.1、0.5mg/ml）與紅細(xì)胞和雙氧水（7.5mM）在37和5%CO2存在下共同孵育三個(gè)小時(shí)，空白對(duì)照（生理鹽水代替樣本溶液）以同樣的方

18、式處理。孵育結(jié)束后，取出0.2ml的孵育混合液用4.0ml的生理鹽水溶解，并在2500轉(zhuǎn)下離心5min。用熒光分光光度計(jì)在540nm處測量上清液的吸光值（A）。取相同體積的混合液加入4.0ml冰冷的蒸餾水以獲得完整的溶血反應(yīng)，并在相同的波長下讀取吸光值（B）。紅細(xì)胞溶血率可以通過(A/B)*100計(jì)算。2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)都做了三個(gè)重復(fù)，顯示的數(shù)據(jù)是這些獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。使用設(shè)計(jì)專家軟件對(duì)響應(yīng)面法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于多重比較可以使用方差分析的方法，當(dāng)p值<0.05時(shí)，認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 結(jié)果和討論3.1 單因子實(shí)驗(yàn) 在這部分，我們分別研究了超聲提取時(shí)間，水料比和提取溫度。單因子

19、實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖一所示。時(shí)間對(duì)多糖產(chǎn)量的影響超聲提取時(shí)間是多糖提取的一個(gè)重要參數(shù)。在本實(shí)驗(yàn)中，分別設(shè)置提取時(shí)間為30,45,60,75和90min來研究當(dāng)其他參數(shù)相同時(shí)時(shí)間對(duì)多糖產(chǎn)量的影響，其他參數(shù)的設(shè)置如下：水料比為30ml/g，提取溫度為70。根據(jù)圖1a,多糖產(chǎn)量隨著提取時(shí)間的增加而提高。這個(gè)結(jié)果表明較長的超聲提取時(shí)間對(duì)RAP產(chǎn)量具有積極的影響。這可能是因?yàn)楸┞禦AP到能使液體穿透原材料的釋放介質(zhì)中，溶解RAP并最終使RAP從原材料中擴(kuò)散出來的時(shí)間要求的原因。75min后，超聲提取時(shí)間越長，多糖產(chǎn)量的增加越緩慢，這意味著隨著提取時(shí)間的增加多糖產(chǎn)量將保持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。這可能是因?yàn)橹参锛?xì)胞中的多

20、糖已經(jīng)被充分提取了。對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 許多研究表明不同水料比將顯著影響多糖產(chǎn)量。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)其他參數(shù)相同時(shí)水料比分別設(shè)置為10,20,30,40和50ml/g，其他參數(shù)的設(shè)置如下：超聲提取時(shí)間為60min，提取溫度為70.如圖1b所示，多糖產(chǎn)量隨著水料比的增加而增加，當(dāng)水料比為30ml/g時(shí)達(dá)到最大值。這是因?yàn)樗媳仍酱笾参锛?xì)胞內(nèi)外溶劑的濃度差越大，并導(dǎo)致多糖大量運(yùn)輸?shù)膭?dòng)力增加。但是在30ml/g之后曲線趨于平緩，這意味著水料比再增加都不會(huì)提高多糖的提取量。這可能是較高的水料比延長了擴(kuò)散到組織內(nèi)部的距離的原因，對(duì)產(chǎn)物收集造成了很大損失。提取溫度對(duì)多糖產(chǎn)量的影響如圖1c所示，研究了超聲提取溫度

21、對(duì)多糖產(chǎn)量的影響。提取過程分別設(shè)置溫度為40,50,60,70和80，其他參數(shù)設(shè)置如下：提取時(shí)間為60min，水料比為30ml/g。圖1c表明當(dāng)溫度從40增加到70時(shí)產(chǎn)量顯著提高，并達(dá)到頂峰（5.30%）。超聲提取溫度的積極影響可以用多糖在溶劑中較高的溶解度，較高的擴(kuò)散率以及高溫促進(jìn)運(yùn)輸來解釋。當(dāng)溫度繼續(xù)上升時(shí)RAP產(chǎn)量開始減少。一種可能的解釋是高溫下多糖可能被水解。這個(gè)趨勢與其他之前的研究有很好的吻合。根據(jù)單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們調(diào)整RSM實(shí)驗(yàn)超聲提取時(shí)間為60-90min，水料比為20-40ml/g，超聲提取溫度為60-80。3.2 通過BBD進(jìn)行提取條件的優(yōu)化 如表2 所示，完成了設(shè)計(jì)矩陣中

22、的每個(gè)實(shí)驗(yàn)并得到了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。利用設(shè)計(jì)專家軟件通過多元回歸分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到了下列多項(xiàng)式方程：Y=6.760-0.258X1+0.005X2+0.960X3-0.363X1X2+0.453X1X3+0.043X2X3-1.301X12-1.331X22-0.791X32 (7) F檢驗(yàn)和p值被用來衡量表3所示的模型和結(jié)果的回歸系數(shù)的顯著性。如果絕對(duì)F值越大p值越小，則相關(guān)變量越顯著。二元回歸模型的方差分析表明該模型極顯著（p=0.0002），結(jié)果顯示該模型適用于預(yù)測范圍之內(nèi)使用的變量。同時(shí)可以看到對(duì)RAP產(chǎn)量具有顯著效應(yīng)的變量是線性的（X3），二次的(X1*X1，X2*X2,X3*X3)以及

23、X1和X3的交互。如表3所示，決定系數(shù)（R2）和變異系數(shù)分別是0.9966和3.53%，這表明多項(xiàng)式模型方程具有高的配合等級(jí)，好的精度和可靠性。通過設(shè)計(jì)專家軟件繪制響應(yīng)面來解釋變量之間的相互作用并確定每個(gè)變量獲得最大響應(yīng)頻率的最優(yōu)水平。如圖2和圖3所示是三維響應(yīng)面和二維等高線。每個(gè)數(shù)字都表示當(dāng)另一個(gè)因子處在零水平時(shí)其他兩個(gè)因子對(duì)多糖產(chǎn)量的效應(yīng)。圖2a和圖3a的3-D圖和等高線圖設(shè)置超聲溫度為零水平，圖顯示在最初階段隨著超聲提取時(shí)間和水料比的增加多糖產(chǎn)量液隨之提高，隨后緩慢降低。圖2b和3b是在不同的提取時(shí)間和提取溫度下的3-D圖和等高線圖。從這些數(shù)字可以看出多糖產(chǎn)量隨著提取溫度和提取時(shí)間的增加

24、而提高，但是當(dāng)提取溫度繼續(xù)增加時(shí)多糖產(chǎn)量不會(huì)隨之提高。結(jié)果與單因子實(shí)驗(yàn)和方差分析一致。當(dāng)提取時(shí)間處于零水平時(shí)，自變量水料比和提取溫度為基礎(chǔ)的3-D圖和等高線圖如圖2c和3c所示。水料比和提取溫度的引起的多糖產(chǎn)量的變化趨勢與上面提及的相似。用設(shè)計(jì)專家軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析來確定最優(yōu)提取條件。最優(yōu)提取條件分別是超聲提取時(shí)間為75.2min，水料比為30.1ml/g，超聲提取溫度為76.1，RAP的最大預(yù)測產(chǎn)量是7.05%。3.3 模型檢驗(yàn) 使用挑選的最優(yōu)條件來檢驗(yàn)預(yù)測最優(yōu)響應(yīng)值的模型方程的適用性。在優(yōu)條件下，實(shí)際實(shí)驗(yàn)的得到的均值為6.90%，證明了提取模型的驗(yàn)證。這些結(jié)果之間好的相關(guān)性印證了該模型足夠

25、反映期望的最優(yōu)化條件。3.4 與傳統(tǒng)熱水提取的對(duì)比與傳統(tǒng)熱水提取相比較，超聲提取的應(yīng)用積極地影響了RAP的產(chǎn)量（表4）。與熱水提取相比提取時(shí)間極大地縮短。這是因?yàn)槌暡ㄝ椛淇梢源龠M(jìn)提取進(jìn)程，可能促進(jìn)生物活性物質(zhì)的提取。超聲提取應(yīng)該是一項(xiàng)合適且高效的從澤瀉中提取多糖的技術(shù)，這一點(diǎn)是確定的。為了證明超聲提取和熱水提取對(duì)多糖官能團(tuán)的影響，記錄了兩種方法提取的紅外光譜。如圖4a和d所示，在3435cm處有一個(gè)寬且強(qiáng)烈的由兩種不同方法提取的多糖吸收峰，這歸因于羥基。在2900-3000處出現(xiàn)了一個(gè)微弱的-CH拉伸峰。1600-1700處的強(qiáng)烈吸收峰歸因于羰基。1400處的峰是羧基出現(xiàn)的跡象。根據(jù)紅外光譜

26、分析，由兩種方法提取的多糖官能團(tuán)基本是相同的。3.5 RAP的紅外光譜和分子量 圖4a-c可以看到，RAP,RAP和RAP的紅外光譜基本上是沒有區(qū)別的，僅僅在帶的亮度上有一些差異。在3600-3200,3000-2800，1250-1000范圍內(nèi)的吸收帶是多糖的特征吸收峰，這同樣可以在葡聚糖的紅外光譜中看到。這些結(jié)果說明RAP與葡聚糖具有相同的主要結(jié)構(gòu)和相似的典型官能團(tuán)。在3435左右的強(qiáng)烈吸收峰屬于羥基的伸縮振動(dòng)。2980和1390左右的微弱峰是C-H鍵不對(duì)稱振動(dòng)造成的。1630處的帶是C=O雙鍵不對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰。在1000-1200區(qū)域有一個(gè)強(qiáng)烈的廣泛吸收峰，是因?yàn)樵诠庾V中觀察到了C-

27、O-C和C-OH側(cè)鏈基團(tuán)。另外，850的特征帶是由于型糖苷鍵的原因。RAP,RAP和RAP的分子量分別是118.92kDa，140.39 kDa，103.13 kDa。3.6 RAP的抗氧化活性自由基的清除活性DPPH自由基是一種比較穩(wěn)定的自由基，在抗氧化劑存在時(shí)接受電子或氫而被清除，被廣泛用來評(píng)價(jià)抗氧化劑的自由基清除活性。圖5a描述了不同濃度的多糖樣本的DPPH清除能力。所有樣本的DPPH清除活性均表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。但是當(dāng)樣本濃度高于0.4mg/ml時(shí)，清除能力沒有明顯的增加。RAP比其他樣本表現(xiàn)出了更強(qiáng)的DPPH清除能力，RAP和RAP的DPPH清除能力沒有明顯的差別。許多因素影響抗

28、氧化劑對(duì)DPPH的清除效應(yīng)，一些文章報(bào)道單糖單元的羥基能貢獻(xiàn)質(zhì)子來結(jié)合DPPH的未配對(duì)電子，以形成非基DPPH-H。自由基的清除活性羥自由基是危害最大的活性氧之一，它能夠輕易地穿過細(xì)胞膜與包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及指導(dǎo)細(xì)胞凋亡的DNA在內(nèi)的生物分子發(fā)生反應(yīng)。因此清除羥自由基對(duì)于保護(hù)生命系統(tǒng)非常重要。羥自由基的清楚活性如圖5b所示。在相對(duì)低的濃度條件下（<0.2mg/ml）清除效應(yīng)隨著樣本濃度的增大而增高。這個(gè)結(jié)果證明所有RAP樣本都具有潛在的清除羥自由基的抗氧化能力。當(dāng)清除能力達(dá)到平臺(tái)期，RAP的清除能力最低，RAP和RAP的清除能力相似?？寡趸瘎?duì)羥自由基的清除效應(yīng)可能是由于存在于多糖中的羥基，它能夠貢獻(xiàn)出氫原子來結(jié)合羥自由基以達(dá)到清除效果。陰離子自由基的清除活性超氧化物陰離子自由基是一種弱氧化劑，但是它能夠持續(xù)降解而形成其他活躍的