植物中紫杉二烯合酶基因的功能分析及進(jìn)化探究

1、植物中紫杉二烯合酶基因的功能分析及進(jìn)化探究紫杉-4(5),11(12)-二烯合酶(Taxa-4(5),11(12)-dienesynthease,TS)是紫杉醇生物合成中關(guān)鍵的限速酶,可以催化牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸(geranylgeranylpyrophosphate,GGPP)環(huán)化成紫杉烷類化合物的基本骨架紫杉-4(5),11(12)-二烯。紫杉二烯合酶基因TS在植物中的存在是該種植物能夠合成紫杉醇的分子層面的最好證據(jù)。本研究利用高通量測序技術(shù)測得報(bào)道檢測到紫杉醇的植物白豆杉(Pseudotaxuschienii)、穗花杉(Amentotaxusargotaenia)、香榧(Torreya

2、grandis)轉(zhuǎn)錄組,通過對(duì)這些植物和平榛(CorylusheterophyllaFisch)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行TS基因的預(yù)測，并利用體外表達(dá)體系對(duì)其進(jìn)行功能鑒定。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，我們篩選的TS候選基因中只有白豆杉中表達(dá)的PchTSM有紫杉二烯合酶的功能。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)粗才匪的CsTSLff究發(fā)現(xiàn)其能夠催化GGPPI到verticiol,而在本研究中發(fā)現(xiàn)白豆杉中的PchTS能夠催化GGPPI到紫杉二烯。此結(jié)果是否說明存在紫杉二烯合酶基因在不同植物中的進(jìn)化現(xiàn)象?通過活性位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉(Taxuschinensis(Pilger)Rehd)中的TchTS和粗才匪中的CsTSL之間存在兩個(gè)活性位點(diǎn)

3、的不同，這兩個(gè)位點(diǎn)都存在于具有結(jié)合及催化活性的a結(jié)構(gòu)域內(nèi)。我們進(jìn)一步用TchTS的a結(jié)構(gòu)域換掉CsTSL的a結(jié)構(gòu)域，看能否實(shí)現(xiàn)其TS功能的回補(bǔ)。但是，粗才1CsTSL的a結(jié)構(gòu)域置換實(shí)驗(yàn)并未達(dá)到CsTSL回補(bǔ)TS功能的效果。本研究通過對(duì)這些TS候選基因分析發(fā)現(xiàn)古老的二菇合酶TS可能在植物中不是普遍存在的。本文主要研究結(jié)果如下:1.對(duì)白豆杉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,并對(duì)預(yù)測的TS候選基因進(jìn)行功能驗(yàn)證首先對(duì)白豆杉轉(zhuǎn)錄組測序，共得到約8.60Gb的Cleandata,組裝得到78,192條Unigene。通過對(duì)白豆杉的轉(zhuǎn)錄組注釋分析發(fā)現(xiàn)42,465條Unigene至少被注釋到一個(gè)數(shù)據(jù)庫。KEGGi釋發(fā)現(xiàn)有63條

4、Unigene被注釋到菇類骨架生物合成中，有19條Unigene注釋到了二萜生物合成途徑中。我們利用已知的紫杉醇合成途徑基因序列信息,通過對(duì)白豆杉轉(zhuǎn)錄組的分析預(yù)測得到了3個(gè)紫杉二烯合酶同源基因、6個(gè)羥基化酶同源基因、4個(gè)?；D(zhuǎn)移酶同源基因、3個(gè)苯丙氨酸氨基變位酶基因同源基因和5個(gè)R-B-苯丙氨酸輔酶A連接酶。然后，克隆得到與TchTS基因同源卜t最高的PchTSS因，并對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)PchTS具有紫杉二烯合酶的功能。最后，我們對(duì)白豆杉樹皮的化學(xué)成分分析，并未檢測到紫杉醇。這有可能是白豆杉中紫杉醇合成途徑下游的某個(gè)酶功能缺失或沉默造成的。2. 對(duì)穗花杉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,并對(duì)預(yù)測的ts候選基因

5、進(jìn)行功能驗(yàn)證。首先對(duì)穗花杉轉(zhuǎn)錄組測序,共得到8.14gb的cleandata,組裝得到82,884條unigene。其中,有27,495條unigene至少得到一個(gè)數(shù)據(jù)庫的注釋。kegg注釋發(fā)現(xiàn)有43條unigene被注釋到菇類骨架生物合成中，有20條unigene注釋到了二萜生物合成途徑中。同時(shí),kegg注釋得到5個(gè)ggps基因。利用tchts蛋白質(zhì)序列對(duì)穗花杉的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,預(yù)測得到13個(gè)紫杉二烯合酶同源基因。然后,利用race技術(shù)克隆了穗花杉中同源性最高的基因aartsl1的全長克隆,并對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)aartsl1不具有紫杉二烯合酶的功能。最后,我們對(duì)穗花杉樹皮的化學(xué)成分分析,

6、并未檢測到紫杉醇。這說明穗花杉可能不具有合成紫杉醇的能力。3. 對(duì)香榧進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,并對(duì)預(yù)測的ts候選基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。首先對(duì)香榧轉(zhuǎn)錄組測序,共得到7.68gb的cleandata,組裝得到85,984條unigene。其中有29,418條unigene得到至少一個(gè)數(shù)據(jù)庫的注釋。kegg注釋發(fā)現(xiàn)共有5,893個(gè)unigene得到注釋。利用blast技術(shù)對(duì)香榧轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,其中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)紫杉二烯合酶同源基因。然后,克隆得到與tchts基因同源性最高的tgrtsl1基因,并對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)tgrtsl1不具有紫杉二烯合酶的功能。最后,我們對(duì)香榧樹皮的化學(xué)成分分析,并未檢測到紫杉醇。這說明

7、香榧可能不具有合成紫杉醇的能力。4. 對(duì)平榛(c.heterophylla)中的tsl基因進(jìn)行功能研究。首先,通過分析平榛轉(zhuǎn)錄組得到一個(gè)ts基因候選unigene。然后利用race-pcr技術(shù)克隆得到基因全長,并命名為chetsl。然后,利用原核表達(dá)體系對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)chetsl不具有紫杉二烯合酶的功能。但是,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該基因是一個(gè)貝殼杉烯合酶(kaurenesynthase,ks)基因。目前,仍然沒有人能夠從榛屬植物中克隆得到ts基因,所以榛屬植物中紫杉醇的來源仍然是一個(gè)迷。5. 對(duì)tchts、pchts和cstsl蛋白進(jìn)行活性位點(diǎn)研究。首先,利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)紫杉二烯合酶具有活性的a結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，分析上述三個(gè)蛋白的a結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn),從中找出它們之間存在差異的活性位點(diǎn)。通過用2-氟代牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸與 tchts 、 pchts 和 cstsl 蛋白進(jìn)行(2-fluorogeranylgeranyldiphosphate,fgp)分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)紅豆杉中TchTS與白豆杉中PchTS的活性位點(diǎn)完全一樣。然而,粗棍中CsTSL與紅豆杉中的TS之間有2個(gè)活性位點(diǎn)的差異，分別是TchTS的VAL610與CsTSL的PHE637和TchTS的PHE834fCsTSL的ILE860。分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)具有差異的活性位點(diǎn)恰好都位于a結(jié)構(gòu)域內(nèi)。因此，我們進(jìn)一步