植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)

1、2.1.1植物細(xì)胞工程教學(xué)目標(biāo)1、簡(jiǎn)述植物組織培養(yǎng)和植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2、列舉植物細(xì)胞工程的實(shí)際應(yīng)用3、嘗試進(jìn)行植物組織培養(yǎng)教學(xué)重點(diǎn)1、植物組織培養(yǎng)的原理和過程2、植物體細(xì)胞雜交的原理3、植物細(xì)胞工程應(yīng)用的實(shí)例教學(xué)難點(diǎn)植物組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程復(fù)習(xí)：細(xì)胞分化：1、概念：在個(gè)體發(fā)育過程中，由一種或一個(gè)細(xì)胞通過增殖產(chǎn)生的后代，在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異的過程注意：不改變細(xì)胞數(shù)目，不改變遺傳，增加了細(xì)胞種類2、原因：相同的基因在特定的時(shí)間和空間內(nèi)進(jìn)行選擇性表達(dá)的結(jié)果3、特點(diǎn)：普遍性：?jiǎn)渭?xì)胞生物沒有細(xì)胞分化持久性：細(xì)胞分化存在于生物體的整個(gè)生命進(jìn)程中，但在胚胎時(shí)期達(dá)到最大限度不可逆性：分化

2、的細(xì)胞要維持分化后的狀態(tài)直到死亡4、結(jié)果：產(chǎn)生了不同的組織和器官5、意義：個(gè)體發(fā)育的基礎(chǔ)（包括細(xì)胞分裂和細(xì)胞分化）細(xì)胞全能性：1、概念：已經(jīng)分化的細(xì)胞，仍然具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能（起點(diǎn)：細(xì)胞、組織、器官；終點(diǎn)：完整個(gè)體）舉例：壁虎斷尾后再生（X）;皮膚燒傷后再生（X）;種子長(zhǎng)成幼苗（，）；植物托插（，）受精卵發(fā)育成嬰兒（，）；2、物質(zhì)基礎(chǔ)：每個(gè)細(xì)胞里有該種生物全套的遺傳信息（所以單個(gè)卵細(xì)胞或精子也可發(fā)育成完整個(gè)體，體現(xiàn)全能性）3、條件：離體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外界條件4、發(fā)揮順序植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞,受精卵生殖細(xì)胞（卵精子）體細(xì)胞體細(xì)胞：分裂能力強(qiáng)的細(xì)胞分裂能力弱的細(xì)胞（分化程度低分化程度高）注意：受精卵是

3、未分化的細(xì)胞，所以全能性最高生殖細(xì)胞是分化程度高，全能性也高（特例）細(xì)胞工程：是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的原理和方法，通過細(xì)胞水平或細(xì)胞器水平上的操作，按照人們的意愿來(lái)改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品的一門綜合科學(xué)技術(shù)。分類：植物細(xì)胞工程和動(dòng)物細(xì)胞工程一、植物組織培養(yǎng)1、理論基礎(chǔ)：植物細(xì)胞全能性2、流程：離體的植物細(xì)胞、脫分化再分化愈傷組織IM根：芽或胚狀體M試管苗Hx未分化已分化相關(guān)知識(shí)點(diǎn)：取材：根尖、莖尖、芽尖等分生組織，分裂能力強(qiáng)，全能性易發(fā)揮脫分化（誘導(dǎo)培養(yǎng)基）實(shí)質(zhì)：使細(xì)胞恢復(fù)分裂能力a.概念：讓已經(jīng)分化的細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)后，失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變成未分化的細(xì)胞的過程形式：固體

4、b.培養(yǎng)基,.無(wú)機(jī)物水、無(wú)機(jī)鹽成分I有機(jī)物：氨基酸、維生素、蔗糖植物激素：生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素注：培養(yǎng)基中加入蔗糖的目的是提供營(yíng)養(yǎng)和調(diào)節(jié)滲透壓另外，脫分化培養(yǎng)基上可加入2,4-D,促進(jìn)愈傷組織的產(chǎn)生和生長(zhǎng)c.條件：黑暗（因?yàn)樵诠庹諚l件下容易分化成維管組織，不利于產(chǎn)生大量的愈傷組織）無(wú)菌（一旦污染，迅速生長(zhǎng)的各種雜菌不僅會(huì)與培養(yǎng)物爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)，而且雜菌會(huì)產(chǎn)生大量對(duì)培養(yǎng)物有害的物質(zhì)，導(dǎo)致培養(yǎng)物死亡）消毒和滅菌的區(qū)別第一，兩者要求達(dá)到的處理水平不同。消毒只要求殺滅或清除致病微生物，使其數(shù)量減少到不再能引起人發(fā)病。滅菌不僅要求殺滅或/和清除致病微生物，還要求將所有微生物全部殺滅或/和清除掉，包括非致腐微生物

5、?？傊局灰髨?chǎng)所與物品達(dá)到無(wú)害化水平，而滅菌則要求達(dá)到?jīng)]有一個(gè)活菌存在。第二，兩者選用的處理方法不同。滅菌與消毒相比，要求更高，處理更難。滅菌必須選用能殺滅抵抗力最強(qiáng)的微生物（細(xì)菌芽抱）的物理方法或化學(xué)滅菌劑，而消毒只需選用具有一定殺菌效力的物理方法、化愈傷組織：排列疏松，高度液泡化的無(wú)定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。（分化程度低，全能性高）再分化（分化培養(yǎng)基）實(shí)質(zhì)：基因的選擇性表達(dá)a.概念：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)又可以重新分化成根或芽等器官的過程b.培養(yǎng)基:同脫分化培養(yǎng)基c.條件：光照（有利于誘導(dǎo)形成葉綠素）植物激素的使用對(duì)植物組織培養(yǎng)的影響“主.高一有利于根的形成生長(zhǎng)素.：a.使用比例：低

6、一有利于芽的分化適中一促進(jìn)愈傷組織的形成先生長(zhǎng)素后細(xì)胞分裂素：有利于細(xì)胞分裂，但不分化b.使用順序先細(xì)胞分裂素后生長(zhǎng)素：細(xì)胞既分裂又分化同時(shí)使用兩種激素：分化頻率提高3、概念：在無(wú)菌和人工控制條件下，將離體的植物器官、組織或細(xì)胞，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織、叢芽，最終形成完整植株。二、植物體細(xì)胞雜交1、理論基礎(chǔ)：植物原生質(zhì)體融合：生物膜具有一定的流動(dòng)性植物組織培養(yǎng)：植物細(xì)胞的全能性2、流程：植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B植物的原生質(zhì)體融合II-去掉細(xì)胞壁，分離出有活力的原生質(zhì)體原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B雜種原生質(zhì)體AB再生出L田胞壁雜種細(xì)胞植物組織培養(yǎng)3脫分化愈傷組織3再

7、分化雜種植株相關(guān)知識(shí)點(diǎn)：去壁原因：細(xì)胞壁阻礙了原生質(zhì)體的融合去壁方法：酶解法（纖維酶和果膠酶）誘導(dǎo)融合的方法物理：離心、振動(dòng)、電激等化學(xué)：聚乙二醇（PEG融合的實(shí)質(zhì)：核融合融合完成的標(biāo)志：雜種細(xì)胞再生出細(xì)胞壁再生細(xì)胞壁涉及到的細(xì)胞器：高爾基體、線粒體注意：進(jìn)行雜交的細(xì)胞是不同種生物的細(xì)胞，因?yàn)椴煌锓N之間存在生殖隔離，用雜交的方式不能獲得雜種植株體細(xì)胞內(nèi)的染色體組數(shù)是融合前兩細(xì)胞內(nèi)染色體組數(shù)之和雜種植株是否可育取決于融合前植株的育性原因：減數(shù)分裂（不）正常，（不）能形成正常配子雜種植株融合過程中細(xì)胞中遺傳物質(zhì)的傳遞不遵循孟德爾遺傳規(guī)律3、概念：將不同種的植物體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，

8、并把雜種細(xì)胞培育成新的植物體的技術(shù)4、優(yōu)點(diǎn)：克服不同生物遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙拓展：植物體細(xì)胞雜交尚存在一些問題親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，染色體排斥丟失的現(xiàn)象越嚴(yán)重由于是兩個(gè)物種的全部遺傳物質(zhì)的合并，各種基因都在其中，選擇符合需要的個(gè)體的難度大有時(shí)缺乏選擇雜種細(xì)胞的有效方法因此目前整體對(duì)稱融合的工作比較少，而是采用非對(duì)稱融合，即一方親本包括了全部遺傳物質(zhì)，另一方親本只取一部分遺傳物質(zhì)，如用不具有細(xì)胞核的原生質(zhì)體與之進(jìn)行融合小知識(shí)：植物細(xì)胞是如何吸收蔗糖的1、植物細(xì)胞是如何吸收蔗糖的在植物組織培養(yǎng)初期，由于植物組織或細(xì)胞不能進(jìn)行光合作用，因此需要供給碳源和能源。由于受教材中質(zhì)壁分離和復(fù)原實(shí)驗(yàn)的影響，人們會(huì)認(rèn)為蔗

9、糖不能被植物細(xì)胞吸收，其實(shí)它是可以進(jìn)入的。在培養(yǎng)基中蔗糖濃度較低，蔗糖以被動(dòng)運(yùn)輸?shù)男问竭M(jìn)入細(xì)胞，植物細(xì)胞內(nèi)有蔗糖轉(zhuǎn)化酶，在高等植物蔗糖代謝中起著很重要的作用。培養(yǎng)基中添加蔗糖而不是葡萄糖，是以大量實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的，實(shí)驗(yàn)表明蔗糖能支持絕大多數(shù)植物離體培養(yǎng)物的旺盛生長(zhǎng)，原因可能有：同樣作為碳源和能源物質(zhì)，蔗糖較葡萄能更好地維持培養(yǎng)基內(nèi)的低滲環(huán)境。防止微生物的污染，微生物生長(zhǎng)所需的碳源最適合的是葡萄糖。相同的物質(zhì)的量濃度下，蔗糖比葡萄糖提供的能量多。當(dāng)然，不同植物對(duì)不同糖類的反應(yīng)是不完全的。2、疑問：植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基為什么只用蔗糖而不用葡萄糖植物與動(dòng)物的最大差別就是植物是自養(yǎng)型的（光合作用），而動(dòng)物是異養(yǎng)型的（外部吸收代謝）。植物光合產(chǎn)物是多糖（二碳糖以上，包括蔗糖），貯藏產(chǎn)物形式是淀粉，而淀粉的合成前體就是蔗糖。蔗糖=葡萄糖+果糖，所以蔗糖的合成必須同時(shí)要有葡萄糖和果糖，其實(shí)植物也只能吸收葡萄糖和果糖。在組織培養(yǎng)中加入蔗糖，經(jīng)熬煮和高壓滅菌后就會(huì)分解成植物能夠吸收的葡萄糖和果糖形式。其實(shí)這樣看來(lái)在組培中，植物也有部