血清成分分析

1、 血清成分分析 血清的成分分析主要從血清中的膽固醇、清蛋白、-球蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等幾個(gè)方面來進(jìn)行研究的。我主要從實(shí)驗(yàn)的目的、原理、實(shí)驗(yàn)試劑、實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果幾個(gè)方面來進(jìn)行分析概括。1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解并掌握鄰苯二甲醛法測定血清總膽固醇的原理和方法。2. 掌握鹽析法分離提純蛋白質(zhì)的原理和方法；掌握透析法脫鹽與蛋白質(zhì)濃縮的方法； 掌握凝膠過濾層析的技術(shù)方法；掌握利用醋酸纖維素薄膜電泳法分離與鑒定血清清蛋白的原理和方法。3. 用紙層折法觀察肝臟丙轉(zhuǎn)氨酶ALT的轉(zhuǎn)氨作用；用分光光度法測定血清丙轉(zhuǎn)氨酶的活力；學(xué)習(xí)治療檢測SGPT的方法及原理；了解檢測肝損傷模型的制備及SGPT在科研中的應(yīng)用。2、 實(shí)驗(yàn)

2、原理 血清膽固醇的定量測定原理：1. 膽固醇及其酯在硫酸存在下與鄰苯二甲醛作用。產(chǎn)生紫紅色物質(zhì)，此物質(zhì)對(duì)550nm波長的光有最大吸收，可用比色法定量測定。100mL樣品中膽固醇含量在400mg之內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。本法優(yōu)點(diǎn)是操作簡便（無須將樣品中的膽固醇抽提出來或去除樣品中的蛋白質(zhì)），靈敏，穩(wěn)定。蛋白質(zhì)鹽析的實(shí)驗(yàn)原理：1. 蛋白質(zhì)分子是生物大分子，其大小恰好在膠體的范圍，且分子中親水基團(tuán)多位于分子的表面，疏水基團(tuán)多在分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部。因此，蛋白質(zhì)分子在水中能以膠體顆粒存在，形成膠體溶液。2.蛋白質(zhì)在水中形成親水膠體，親水膠體顆粒有兩個(gè)穩(wěn)定因素：（1）膠粒上的電荷；（2）水化膜。3. 蛋白質(zhì)在

3、水溶液中呈現(xiàn)兩性電離。在環(huán)境的pHpI時(shí)，蛋白質(zhì)可帶正電荷或負(fù)電荷。在某一pH條件，蛋白質(zhì)帶同種電荷，同電相斥，故可吸引水分子（水分子為極性分子），水分子排列圍繞在蛋白質(zhì)分子周圍，形成水化膜，使蛋白質(zhì)分子相互分割開來。破壞這兩個(gè)因素或其中某一個(gè)因素（破壞了蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定性），易于蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。4. 高濃度鹽溶液，在水溶液中電離，其正、負(fù)離子吸引水分子，從而奪取水化膜，還可以中和部分電荷。這樣，就不同程度地去掉了上述的兩個(gè)穩(wěn)定因素，使蛋白質(zhì)凝聚、沉淀，這就是蛋白質(zhì)的鹽析。5. 由于各種蛋白質(zhì)的顆粒大小、帶電荷多少及親水程度的不同，對(duì)于同一種中性鹽，蛋白質(zhì)鹽析所需最低濃度也不同。例如：球蛋白不

4、溶于半飽和的（NH4）2SO4溶液，-球蛋白不溶于1/3飽和度的(NH4)2SO4溶液，而清蛋白僅不溶于飽和的（NH4）2SO4溶液。因而。可以利用不同濃度的（NH4）2SO4溶液使血清或其他混合蛋白質(zhì)中的這些不同的蛋白質(zhì)分開。蛋白質(zhì)透析與濃縮的實(shí)驗(yàn)原理：1. 透析（1） 透析是利用蛋白質(zhì)等生物大分子不能通過半透膜的性質(zhì)的一類純化方法，可利用該方法分離大分子與小分子的混合物。（2） 由于NH4+和SO42-可以通過半透膜，而血清清蛋白不能，因此，可以利用透析的方法使清蛋白溶液脫鹽。2. 濃縮利用半透膜還可以進(jìn)行大分子溶液的濃縮。將盛有待濃縮的大分子溶液的透析袋放入高濃度的吸水性強(qiáng)的蔗糖固體顆粒

5、中，袋內(nèi)溶液中的水被袋外的多聚物所吸收而有效地濃縮。 凝膠層析的實(shí)驗(yàn)原理：1. 凝膠層析也稱凝膠過濾，是一類利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠的層析技術(shù)。2. 當(dāng)樣品流經(jīng)這類凝膠的固定相時(shí)，不同分子大小的各組分因進(jìn)入網(wǎng)孔受阻滯的程度不同而以不同的速度通過層析柱，從而達(dá)到分離的目的。3. 當(dāng)樣品通過層析柱時(shí)，分子量較大的物質(zhì)因?yàn)椴荒芑蜉^難通過網(wǎng)孔而進(jìn)入凝膠顆粒，而是沿著凝膠顆粒間的間隙流動(dòng)，所以流程較短，向前移動(dòng)的速度較快，即受阻滯的程度較小，最先流出層析柱；反之，分子量較小的物質(zhì)，因?yàn)轭w粒直徑小，可通過網(wǎng)孔而進(jìn)入凝膠顆粒，所以流程較長，向前移動(dòng)的速度較慢，即受阻滯的程度較大，流出較晚。醋酸纖維素薄膜

6、電泳的原理：1. 醋酸纖維素薄膜電泳法是以醋酸纖維素薄膜作為支持物的電泳方法。2. 醋酸纖維素薄膜是用二乙酸纖維素制成的，它具有均一的泡沫樣的結(jié)構(gòu)，厚度僅為120m，有強(qiáng)滲透性，對(duì)分子移動(dòng)無阻力，作為取代電泳的支持物進(jìn)行蛋白電泳有簡便、快速、樣品用量少、應(yīng)用廣泛、沒有吸附等特點(diǎn)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的鑒定（紙層析法）實(shí)驗(yàn)原理：觀察肝糜中谷丙轉(zhuǎn)氨酶所催化的氨基移換反應(yīng)。通過紙層析法檢查底物谷氨酸的減少和產(chǎn)物丙氨酸的生成。為防止丙酮酸被肝糜中的其它酶所氧化或還原，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入了抑制劑溴乙酸。血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位測定實(shí)驗(yàn)原理：本實(shí)驗(yàn)用丙氨酸和-酮戊二酸為底物，經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸與2

7、，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙，此物質(zhì)堿性條件下呈棕紅色，其顏色的深淺與丙酮酸的含量成正比，可用比色法進(jìn)行定量測定。通過與標(biāo)準(zhǔn)溶液的比較，即可計(jì)算出酶的活力單位數(shù)。三、實(shí)驗(yàn)器材和試劑1.試管1.5cm×15cm（×7）、吸管0.1mL（×3）、0.5mL（×4）、5mL（×1）、10mL（×1）、容量瓶50mL（×1）、100mL（×1）、燒杯100mL（×2）、電子分析天平、分光光度計(jì)、離心機(jī)、移液管、透析袋、鐵架臺(tái)、凝膠柱、玻璃棒、燒杯、試管、膠頭吸管、 9%NaCl溶液、 海砂、1%谷氨

8、酸溶液（1%KOH溶液中和）、%丙酮酸鈉溶液（用1%KOH溶液中和）、0.1%KHCO3溶液、0.025%一溴乙酸溶液（用1%KOH中和）、2%乙酸溶液、酚的飽和水溶液、 0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液、0.1%標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸溶液、0.1%標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸溶液、KOH溶液。2.鄰苯二甲醛試劑、90%醋酸 、混合酸、標(biāo)準(zhǔn)膽固醇貯液（1mg/mL）、標(biāo)準(zhǔn)膽固醇應(yīng)用液（0.1mg/mL）、(NH4)2SO4溶液、雙縮脲試劑、酪蛋白、蔗糖、BaCl溶液、Sephandex 4B 凝膠、生理鹽水、重鉻酸鉀 、藍(lán)葡聚糖、家雞肝臟、家雞和烏雞血清、1/15 mol/L pH=7.4的磷酸緩沖液、GPT基質(zhì)液、1mmo

9、l/L2，4-二硝基苯肼、2mol/mL丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液、0.4mol/LNaOH溶液四實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析1.血清膽固醇的定量測定（鄰苯二甲醛法）操作：1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2、樣品的測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：編號(hào)試劑編號(hào)編號(hào)編號(hào)編號(hào)編號(hào)01234標(biāo)準(zhǔn)膽固醇應(yīng)用液/mL00.10.20.30.4醋酸/mL0.40.30.20.10鄰苯二甲醛試劑/mL0.20.20.20.20.2蒸餾水/mL0.010.010.010.010.01混合酸/mL4.04.04.04.04.0100mL血清中總膽固醇含量/mg0100200300400A550nm00.2180.4250.6150.764 樣品的測定：

10、試管試劑對(duì)照樣品醋酸/mL0.40.4血清/mL0.010.01鄰苯二甲醛試劑/mL00.2無水乙醇/mL0.20混合酸/mL*4.04.0A550nm（家雞）00.019A550nm（烏雞）00.004結(jié)果分析：由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得：100ml血清中總膽固醇的含量為20mg,烏雞中有2mg，可得實(shí)驗(yàn)結(jié)果為家雞相同含量的血清中總膽固醇的含量高于烏雞。實(shí)驗(yàn)可能存在的誤差為：1. 血清取得量較少，并且在取烏雞的血清時(shí)有部分滴在試管壁的上方，沒有溶解在溶液中；2. 比色時(shí)沒有混勻或時(shí)間過長，比色的效果不明顯，影響了光吸收值；3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制存在一定的誤差。2. 血清清蛋白與-球蛋白的分離與鑒定操作：血

11、清清蛋白與-球蛋白的鹽析實(shí)驗(yàn)步驟：血清清蛋白與-球蛋白的鹽析實(shí)驗(yàn)步驟取離心管一支，加入2mL血清加入2mLPBS（稀釋血清），搖勻逐滴加入pH=7.2的（NH4）2SO4溶液2mL，邊加邊搖靜止30min，離心20min（v=3000rpm）上清液（主要含有清蛋白）沉  淀（主要含有-球蛋白）加入3.132g(NH4)2SO4，使上清液飽和加1mLPBS溶解靜止30min逐滴加入飽和（NH4）2SO4溶液0.5mL（相當(dāng)于33%飽和（NH4）2SO4溶液）離心、沉淀加1mLPBS溶解沉淀放置30min放入透析袋離心20min（v=3000rpm）*放棄離心后的上清液（主要是、球蛋白）

12、，沉淀即為初步純化的-球蛋白蛋白質(zhì)透析與濃縮的實(shí)驗(yàn)步驟：1. 取玻璃紙（15cm×15cm）兩張，折成袋狀。將前面第一次鹽析得到的含有清蛋白的上清液和-球蛋白分別倒入兩個(gè)透析袋中，用線繩系緊上口。2. 用玻璃棒懸掛在盛有半杯蒸餾水的100mL燒杯中，使透析袋下半部浸入水中，將燒杯放在微量振蕩器上振蕩1h（中間換水1-2次）。3. 將透析袋取下，小心將線繩解開，用滴管吸收袋內(nèi)的液體放入干凈的試管中。4. 用雙縮脲法分別檢查袋內(nèi)外液體蛋白質(zhì)。在用BaCl溶液檢查燒液體的NH4+和SO42-。記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，觀察透析法除鹽的結(jié)果。5. 將兩透析袋取出，埋入蔗糖中濃縮。凝膠層析的實(shí)驗(yàn)步驟過程名

13、稱實(shí)驗(yàn)步驟凝膠預(yù)處理4g葡萄糖膠G-25放入100mL燒杯中50mL蒸餾水小火煮沸1h靜止、冷卻、傾棄蒸餾水加入PBS10mL輕輕攪拌至凝膠懸起傾入10cm×1.0cm層析柱（用玻璃棉堵住下口，下口套一橡皮管）裝柱    將全部凝膠都傾入柱內(nèi)，且液面接近凝膠面時(shí)，用螺旋夾將橡膠管夾緊，在將柱內(nèi)凝膠面上平鋪一張小圓濾紙片，然后小心放松螺旋夾，使液體緩慢流出，到液體剛好流入凝膠面時(shí)，將螺旋夾再夾緊，裝柱工作完成。加樣    用膠頭吸管將濾紙上方清液吸出，加入重鉻酸鉀和藍(lán)葡聚糖混合溶液，用膠塞封住上口，安裝生理鹽水加入裝置。洗脫&

14、#160;   用生理鹽水洗脫液進(jìn)行洗脫。打開螺旋夾，使液體的流速達(dá)到6-7dpm。收集混合液在凝膠柱中分離，藍(lán)色的藍(lán)葡聚糖在下方，黃色的重鉻酸鉀在上方。用試管收集流出藍(lán)、黃色液體，比色并畫出洗脫曲線。醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)步驟浸泡    將醋酸纖維素薄膜在緩沖溶液中浸泡20min，取出識(shí)別光面和麻面。點(diǎn)樣    用鑷子將薄膜置于濾紙上，吸收多余的液體，用鉛筆在薄膜麻面一端2cm處畫一細(xì)線，利用載玻片一側(cè)蘸取樣品，于細(xì)線處點(diǎn)樣。電泳    將薄膜麻面朝下，平懸于電泳槽支架的濾紙橋上，點(diǎn)

15、樣一端靠近負(fù)極；通電后先使U=80V，待10min后，使U=120V電泳40min。染色    將薄膜取出后，置于氨基黑10B染色劑重，染色10min。漂洗    將薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至無蛋白區(qū)無藍(lán)黑色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果分析：1. 凝膠層析的結(jié)果如上圖所示，混合液在凝膠柱中分離，藍(lán)色的藍(lán)聚糖在下方，黃色的重鉻酸鉀在上方，用試管收集流出的液體，觀察液體的顏色以及不同顏色的液體的含量。2. 全血清、-球蛋白、血清清蛋白的薄膜電泳圖。全血清中有三條線，其中有一條最粗，另外兩條較模糊，-球蛋白和血清清蛋白中只能看到一條淡淡的

16、線，造成這種現(xiàn)象的原因可能是：1.點(diǎn)樣的時(shí)候點(diǎn)的較少、不均勻；2.操作不當(dāng)導(dǎo)致-球蛋白和謝清清蛋白受到了損失，含量減少。3.谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的鑒定及活力單位的測定操作： 谷丙轉(zhuǎn)氨酶提取液制備：谷丙轉(zhuǎn)氨酶提取液制備方法2g肝臟+0.9%NaCl6mL+海砂200mg在低溫下，研磨成漿用脫脂棉過濾，得提取液（濾液不清）試    劑對(duì)照管測試管0.1moL/L谷氨酸0.500.500.1moL/L丙酮酸鈉0.500.500.1%KHCO30.500.500.025%一溴乙酸0.250.25煮沸的酶液0.50酶液0.50加脫脂棉塞，45水浴，1.5h，時(shí)時(shí)振蕩內(nèi)容物2%乙酸

17、6滴6滴沸水浴2min，使蛋白質(zhì)完全沉下，過濾，作層析紙層析方法取圓形層析濾紙1張，在圓心處用圓規(guī)繪出直徑為3cm的同心圓通過中心將濾紙繪成四等分扇形，用毛細(xì)管點(diǎn)樣2-4次（直徑不超過2mm）在濾紙的圓心上剪一小孔，直徑約1-2mm取一小濾紙條，將下端剪成刷狀，在卷成燈芯插入圓形小孔，不能使燈芯突出紙面將圓形濾紙平放在盛有層析液（水飽和酚）培養(yǎng)皿上，使燈芯向下與溶劑接觸用大小相同的培養(yǎng)皿蓋在濾紙上溶劑通過燈芯上升到濾紙上向四周展層，直到溶劑前沿移至距濾紙邊緣約1cm處時(shí)停止（展層時(shí)間為1h）80-100烘箱干燥，噴灑水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100顯色 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位測定:1. 標(biāo)

18、準(zhǔn)曲線的繪制2. 酶活力的測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果：試     劑試管號(hào)012345丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液（mL）0.050.100.150.200.25GPT基質(zhì)液（mL）0.500.450.400.350.300.25pH7.4磷酸緩沖液（mL）0.100.100.100.100.100.10充分搖勻后，置于37水浴，保溫10min2，4-二硝基苯肼（mL）0.500.500.500.500.500.50充分搖勻后，置于37水浴，保溫20min0.4mol/LNaOH（mL）5.005.005.005.005.005.00充分搖勻，室溫靜置10min后，以0號(hào)管為空白，

19、520nm波長下比色A520nm值00.1510.2670.4210.5110.632各管所含丙酮酸量（mol）0.100.200.300.400.50各管相當(dāng)GPT單位數(shù)100200300400500以酶的活力單位數(shù)為橫坐標(biāo)，以光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制A520nm與對(duì)應(yīng)的酶活力單位數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。（1）丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液mL數(shù)×摩爾濃度（2mol/mL）；（2）GPT活力單位為：每mL血清在37與pH=7.4的基質(zhì)液作用60min，生成1mol丙酮酸為一個(gè)單位（U）。本實(shí)驗(yàn)（臨床檢驗(yàn)）取血清量為0.1mL，報(bào)告數(shù)據(jù)以100mL血清計(jì)算，因此將實(shí)際測得結(jié)果×1000即可。試