炎癥反應的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠降解

1、炎癥反應產(chǎn)生交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠降解Nobuhiko Yui. Tenio Okano and Yasuhisa Sakurai 本女子醫(yī)學院生物 1：程研究所摘要 制備可降解的二縮水甘油基酸(glycidyether)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠，研究體內(nèi)炎癥和離 體羥基自由基降解交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。離體是由HAh and FeSO反應產(chǎn)生羥基誘導迅速 但有限制的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠降解。降解樣式符合假定適合于凝膠表而降解的理論方程。 由于阻止透明質(zhì)酸酶進入交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠內(nèi)部，離體交聯(lián)透明質(zhì)酸酶的降解作用很小。 交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉基質(zhì)中摻入微球藥物。在交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉基質(zhì)降解過程中藥物被釋放。在體 移植實驗

2、揭示了炎癥應答過程交中聯(lián)透明質(zhì)酸鈉基質(zhì)的降解。因此交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠可以 可以作為能降解的移植藥物載體。前言藥物經(jīng)由多聚體基質(zhì)的降解、釋放、分散和溶解，多聚體基質(zhì)表而降解已經(jīng)得到廣泛研究。 過去，酯鍵的水解經(jīng)常作為多聚體基質(zhì)降解的機制。具有疏水鍵聚酯像多聚乙醇酸、多聚乳 酸得到深入研究。經(jīng)由表面侵蝕藥物傳輸?shù)纳锝到舛嗑垠w優(yōu)于經(jīng)由體積降解藥物的降解基 質(zhì)?；旧希@些多聚體的降解貫穿整個多聚體，可導致即突發(fā)的作用和摻入藥物無活性。 因此，藥物的擴散發(fā)生在多聚體基質(zhì)降解之前是有意義的。由此，生物降解的藥物釋放時必 須被預言。因此，表面降解多聚體發(fā)展給與更多關注。最近，為了獲得藥物傳輸體系研究了幾

3、種多聚體。這些體系的可以使用磁的、電的、超聲的、 溫度、PH值多聚體。這些多聚體可以與酶底物反應以及藥物PH敏感的溶解能力相結合。使 用了作為藥物緩釋作用的多聚物侵蝕率的比率的多聚體，例如1,1,1-三乙氧基乙烷 poly(orthiesters),多聚乙縮醛(polyacetals) and 聚酸酎(polyanhydrides) 這些多聚體的 表面侵蝕率(降解)通過疏水多聚體不穩(wěn)定的鏈的水化發(fā)生的。由摻入敏感PH的不穩(wěn)定的 鍵完成刺激反應多聚體的侵蝕。酶底物反應產(chǎn)生局部PH變化用來改變多聚體的侵蝕率。不 管怎么說，經(jīng)由PH敏感多聚體的侵蝕率調(diào)節(jié)藥物的釋放率是相當困難。為了實現(xiàn)自動反饋 藥物

4、傳輸系統(tǒng)“生物降解多聚體”，這個多聚體將被設計成有特殊的內(nèi)部信號，保證適合藥 物傳輸?shù)淖銐蜷L的周期降解。透明質(zhì)酸鈉是由氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸二糖單位重復構成的線性粘多糖。當溶解在水溶液 中時透明質(zhì)酸通常為高粘度液體，可以被修飾成生理性關節(jié)滑液、玻璃體和身體其他液體。 眾所周知HA在機體有多種重要生理功能，包括控制細胞滲透樂、細胞分化、炎癥過程的羥 基的清除，血管生成。最近，通過微生物發(fā)酵實現(xiàn)了大量HA商業(yè)化。HA已經(jīng)在眼外科、關 節(jié)外科作為治療因子得到使用。在活體HA的降解主要通過兩個途徑實現(xiàn)。一是經(jīng)由透明質(zhì)酸酶途徑，二是作為活性氧來源 的羥基途徑。在正常身體狀態(tài)下皮膚和皮下組織中酶的活性很低

5、，皮下注射透明質(zhì)酸酶降解 生理鹽水透明質(zhì)酸鈉凝膠要好幾天時間。然而，倘若透明質(zhì)酸鈉凝膠注射在一個部位，在這 個部位就有炎癥發(fā)生，羥基降解透明質(zhì)酸鈉凝膠速率比酶迅速和明顯。在炎癥的初始階段增 加了毛細血管的滲透性可以使細胞因子和吞噬細胞在炎癥部位聚集。吞噬細胞可以被免疫復 合體和炎癥復合體激活產(chǎn)生殺菌因子羥基(0H)。不管怎樣，宿主的保護性反應產(chǎn)生過多 羥基可導致結締組織損傷。羥基涉及到了器官和組織損傷和包括透明質(zhì)酸鈉大分子降解。透 明質(zhì)酸在炎癥的急性期的降解機制是羥基(0H)在關W炎的滑液中得到了證據(jù)。滑液的粘 性下降和HA溶解發(fā)生在離體產(chǎn)生酶觸超氧發(fā)生之后，這已經(jīng)使用單管粘度計證實了。從那

6、時起，許多作者在離體和在體實驗中羥基解聚了大分子。刺激生物降解敏感的藥物傳輸體系的發(fā)展中，應用了羥基降解HA。例如：具有關行病的患 者治療注射了母體激素和HA液體。從這一點來看，交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠正面對著一個藥物 移植的炎癥反應降解新家族。這樣，抗炎藥物的結合，像給體激素和交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠依 賴炎癥作為藥物傳輸。在這篇文章中，描述了交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠制備，研究由羥基降解交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。離 體檢測了炎癥應答反應中交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的降解。交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠降解特性提示設 計一個新的在體炎癥調(diào)節(jié)降解凝膠是可能的。材料和方法交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠制備分子量8.7x 10透明質(zhì)酸鈉購自Shiseid

7、o Co., Tokyo, Japan.乙二醇二縮水甘油基酷 Ethyleneglycol diglycidylether （EGDGE） and多聚縮水甘油基酸Polyglycerol polyglycidylether （PGPGE）由Nippon Oil & Fats, Co., Tokyo, Japan,和 Nagage Chemical Industry Co.,提供。透 明質(zhì)酸PGPGE和EGDGE化學結構在圖1中顯示，聚苯乙烯乳膠，直徑購自Sekisui 化學公司。.交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠按下面方法制備1N的氫氧化鈉溶液中放入透明質(zhì)酸鈉20wt%溶解，在乙醇中溶解的EGDGE加入HA

8、液中（氫 氧化鈉液/乙醉9;1）旋轉(zhuǎn)混勻。當含HA的微球被制備的時候，EGDGE加之前，多聚乳膠加 入透明質(zhì)酸鈉溶液。當PGPGE作為交聯(lián)劑時，PGPGE溶入1N氫氧化鈉溶液中，加入HA溶液 （如表）。混合物放入直徑10mm、高3mm的玻璃小皿中，并在60反應15分鐘。獲得凝 膠放入過量水/乙醇（1:1）皿中并用1N鹽酸PH值至中性。凝膠被過量水/乙醇（1:1）沖洗若 干遍。最后，在實驗室實施前凝膠中乙醉被水取代。 CH ?CH EGDGE CH2-O-(CHI2-Cii-CH2*O-GM2-CH-CH2-O)-CM2-GH-CM OZk2 弋一CKPQPaE、c/圖1透明質(zhì)酸PGPGE和EG

9、DGE化學結構表1由PGPGE和EGDGE制備交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠編號EGDGE摩爾水含量溶脹率微球數(shù)/mlHA10.599.856.9 X104-HA21.099.764.2 X104-HA31.599.481.9X104一HA41.099.512.0 X1049.0 X105HA51.099.542.1 X104-交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠性質(zhì)在蒸僧水中（25C）檢測交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠水溶脹。冷凍干燥后，用掃描電鏡觀察了干燥 交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠在體外降解由硫酸鐵和過氧化氫反應產(chǎn)生羥基降解交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。該過程是眾所周知過程。除了 另由注釋，按下例方法實施。7 mmx7 mm7

10、mm方形交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠浸泡在5 mM FeS04溶液中（100 ml） 2天。為了形成HA-Fe?+復合體。然后，交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠最初降解浸 泡凝膠進入不同濃度的H9? （100 ml）中。H2O2濃度由液體分光光度法（二甲氧苯胺反應 500nm產(chǎn)生紅顏色）檢測。除了另有說明，降解交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠（HPLC）分析。在預測試 的基礎上，HPLC分析了 1ml的降解產(chǎn)物，HPLC （X-8010. Tosoh Co., Japan）0使用恢復相柱 （Pak ODS-2201-N.64）X 200 mm. Senshu Sci., Tokyo, Japan）o 使用的溶劑是水，35C流動 速

11、度Iml/min。降解產(chǎn)物保留時間1.5-3.5min。相差顯微鏡下（0.100mm, 1 /400mm2）用血球 計數(shù)器記數(shù)微球釋放數(shù)量估算微球釋放透明質(zhì)酸鈉凝膠量。在體炎癥反應交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠降解在下列實驗前，20X10X1.8 mm凝膠平板用高壓鍋火菌30分鐘。確認高壓滅菌沒有改變平 板凝膠內(nèi)容，表明通過高壓凝膠沒有降解。外科移植凝膠平板在5周Waster大鼠（平均體重 110g）背部皮下（實驗用鼠46只）。切口4cm長，用5號絲線縫合，然后消毒。移植后14和28天， 為了產(chǎn)生初始炎癥反應，背部切口4cm長傷口作為傷口愈合實驗。預定的周期后，用過量麻 醉劑殺死大鼠，然后移植HA凝膠和局

12、部組織一起取出。傷口愈合實驗7天后殺死大鼠。殘留 HA用咔哇法定量分析葡萄糖醛酸。沒有移植（對照組）交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的大鼠背部組 織葡萄糖醛酸幾近陰性。結果和討論前面文獻和專利已經(jīng)報道交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠制備和在體沒有毒性。HA與商業(yè)化的交聯(lián)劑 反應，使用的交聯(lián)劑例如雙環(huán)氧化合物和二乙烯颯（bisepoxy compounds, divinyl sulfone.） o最適合的交聯(lián)劑是通過HA分子的羥基基團形成醛鍵的多功能環(huán)氧化 合物。本實驗使用的EGDGEandPGPGE分別具有兩個或四個環(huán)氧基團，它們被 認為制備穩(wěn)定的、親水的交聯(lián)HA凝膠是充分的夠用。在本實驗中，催化是使用 的氫氧化鈉。文獻

13、報道HA長時間暴露在高PH值中導致HA解聚作用，通常，該 過程室溫條件下幾個小時內(nèi)完成，本實驗使用了相似濃度氫氧化鈉液體。為了減 少HA的解聚，反應15分鐘后停止交聯(lián)反應。用不同的摩爾濃度EGDGE或 PGPGE/ HA制備交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的結果顯示在表1。盡管，交聯(lián)劑的含量 相當?shù)母?，每一個交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠都含有較高的水（95%）。交聯(lián)劑的摩爾 濃度和透明質(zhì)酸鈉是變化的0.5-1.5, EGDGE交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉凝膠在潮濕的狀 態(tài)下是有點脆，不適合在體皮下移植。這結果表明：HA凝膠交聯(lián)密度相對較低。 這可以由于EGDGE與HA反應過低，（a） EGDGE具有水不相混性（b） HA溶 液具

14、有高的粘性。在降解試驗中，使用方形EGDGE交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠是容易處理。 圖2顯示了掃描電鏡交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的橫斷而。觀察了覆蓋致密的皮膚大孔海綿樣結構。 當HA凝膠含水超過95%冷凍干燥樣品形成大孔。由于交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠制備后切除方形 平面，冷凍干燥致密的皮膚也將呈現(xiàn)。x300011 5.0kV 1mm佟12交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠凝膠冰凍干燥樣品掃描電鏡圖為了在體試驗中使用更好的機械性能的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠，測試了PGPGE交聯(lián)的透明質(zhì) 酸鈉凝膠。PGPGE作為交聯(lián)劑有兩個好處第一溶于水，第二每個分子具有更多的環(huán)氧基團。 盡管它有更高的水溶脹值，PGPGE交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠有好的機械性能，

15、可以板樣結構移 植。圖3表明：在羥基存在的情況下交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的降解結果。在這個例子中，方形交聯(lián) 透明質(zhì)酸鈉凝膠浸入含H?。2的液體中，然后加入確定量的FeSOg靠測量殘留凝膠重量評價 降解。盡管在H?Ch中是穩(wěn)定的，加入FeSO液體后交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠迅速降解。在圖2圖 像顯示降解依賴于FeSO4液體加入的限制。一段時間凝膠達到恒定重量后迅速降解是由于 比。2產(chǎn)生了H。氧化Fe?+到Fe3+0以前，羥基水溶液中HA凝膠的解聚作用己經(jīng)被廣泛研究。 H202和FeSO4結合經(jīng)常被使用產(chǎn)生羥基。這芬頓反應表示為下式：Fe2+H2O2 f Fe3+OH +OH關于由羥基降解HA并且形成其降解產(chǎn)物

16、的機制，電子順磁共振觀察到了證據(jù)。HA與羥基反應 是首先在碳抽出氫到葡萄糖醛酸竣基，引起糖昔的裂解。羥基被認為是最重要的活性組分, 這具有在活性氧中最短的生命周期。例如報道：1 uM羥基生命周期200 n so我們的結果 表明：在其它氧化反應因子存在的情況下產(chǎn)生羥基降解了交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠并且降解以脈 沖方式發(fā)生。在這個實驗體系中，據(jù)認為由于當FeSO溶解在比02的液體中速率與發(fā)生羥基 速率相同，即使H2O2已經(jīng)滲透到凝膠內(nèi)部，羥基的產(chǎn)生發(fā)生在交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠表面。HA gol; 02955gSmM soln.: 100ml020 40 60 80 100 12Q 140TlnMfmln)圖

17、3當FeS04溶解在HQ的液體中羥基交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的降解TirMfiftlh)圖4當FeSOq溶解在不同濃度H2O2的液體中羥基交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的降解因此，正像圖3顯示交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的降解發(fā)生在正而。它也表明由于羥基短的生命周 期大多數(shù)快速消失。為了控制藥物傳輸釋放以滿足患者的生物需求，當生物需求結束時具有 局部藥的多聚體基質(zhì)連續(xù)降解是可能的。從這一點看，交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠降解特性原理上 使它適合于自反饋藥物傳輸體系的應用。羥基的短生命周期使他很難檢測交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉降解動力學。文獻報道HA能與金屬離子形 成復合體像Qi?*和Fe2+,3。?存在條件下該復合體引起位點特殊的氧化反應。這

18、個系統(tǒng) 的特性是Fe?+似乎束縛于HA,阻止沒有液體情況下產(chǎn)生羥基，若非在透明質(zhì)酸特殊位點產(chǎn)生 羥基。在本研究中為了產(chǎn)生羥基，形成HA-Fe?+復合體，交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠首先進入FeSO 液體中，然后移到H2O2液體。圖4顯示在不同H2O2條件下交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠降解時間進程。 這些交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉降解時間從幾分鐘到若干小時即依賴于羥基的產(chǎn)生又依賴于凝膠交聯(lián) 條件。通常，假設多聚體降解有三個可能的方法：（I）優(yōu)先于表面（2）均勻貫穿多聚體基質(zhì)（3） 靠上述機制結合。在這個體系中，可以預料是具有Fe的凝膠表面的H2O2反應產(chǎn)生羥基導致 交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠降解。可以推測，沒有透明質(zhì)酸鈉凝膠凝膠表面特

19、殊位點Fe2+, H2O2不 能侵入就沒有透明質(zhì)酸鈉凝膠的降解。當然，理論上預測交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠降解動力學以表面降解為基礎。如果Mt是從方形表 而任一時間t基質(zhì)降解的量，那么方形樣品塊保留可表示為下式。（1M1/dt=B p A=6Bp （h-2Bt）2（1）B是單位長度/時間表面降解速率，p為多聚體密度,A為方塊表而積，h為方塊初始長度，方塊 表示Mx =p/3(2)替代為h =2Btx(3)J是全部降解的時間，方程(l)能夠與方程(2)、(3)整合表達部分多聚體降解相對時 間。Mt/M 1-1 -(t/foc)3 (4)所有資料表明在圖4方程4為降解周期基礎的理論曲線，方程可以由下式表達

20、。Mt/Mg m 個二外(5)以圖4得到的方程5是顯示在圖5的線性關系。M 8040*041.0圖5 H濃度(50-500 uM)得到的方程5是顯示在圖5的線性關系。 表2編號重量gH2O2 u mFe2+降解率時間(min)降解率 cm/SHA10.35505.0100501.4X10-4HA10.325005.010078.1 X10-4HA30.37505.01001803.3X1O5HA30.335005.0100451.3X10-4HA40.1555.0100902.2X104HA40.15505.01003.41.4X1O420408080Tlme(rnin)1OOBOM 如201

21、 usapffBtp 求圖6微球羥基自由基降解透明質(zhì)酸鈉凝膠一83;37 二二圖7凝膠降解和微球釋放速率這些結果表明羥基降解交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠發(fā)生由表而機制控制。前而報道的易受侵蝕表面的多聚體，定義侵蝕過程前而兩個相對運動術語水的侵入速率為 匕，多聚體侵蝕速率以。當匕遠大于匕時表面侵蝕過程發(fā)生，由多聚體攝入水的速率完全 決定侵蝕速率。交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠表面降解被定義兩個反應的相對速率：V3幺任。2侵入 速率，匕為羥基降解交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠速率。在這體系中，僅當匕大于時完成表面降解。 在研究中使用H92濃度(50-500 uM)是遠低于凝膠中Fe?+ (5mM)的濃度。一旦H2O2面臨 透明質(zhì)酸鈉

22、凝膠表而，比。2將與Fe?+迅速反應產(chǎn)生羥基。因為HA與Fe?+形成復合體防止H2O2進一步侵入凝膠。由于羥基的生命周期很短-羥基將迅速消失-透明質(zhì)酸與羥基反 應羥基反應相當迅速。佟15提示該體系匕是優(yōu)7V3。計算交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠降解圖總結在 表2。交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠降解率由方程3估算為IO,到lO-cm/s。本研究的實驗條件下， 102-104 nmol H2O2.在凝膠中電+僅是2.5 nmol,細胞吞噬過程中O白細胞釋放0.554).65 nmolH.Oz, min。假設局部炎癥發(fā)生24小時內(nèi)H2O2全部的量被預期在e-enmol,因此，在這研究中制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠被降解與在體炎

23、癥發(fā)生的降解具有相似速率。 發(fā)現(xiàn)激發(fā)誘導交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠降解快于酶降解c例如，盡管每克透明質(zhì)酸用lot 105單 位透明質(zhì)酸酶，幾分鐘內(nèi)降解透明質(zhì)酸，用相同的酶濃度花了幾個月時間降解交聯(lián)透明質(zhì)酸 鈉凝膠。這些詳盡的研究資料將在以后文章中報告。在這種情況，降解的輪廓遵循表面控制 機制，評估降解率是用10工io-8cm/s.這結果表明因為在活體透明質(zhì)酸鈉酶濃度是低于離體 實驗，移植后勿略不計酶降解交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。在生理PH值條件下透明質(zhì)酸羥基是陰 電荷。假定靠靜電排斥力或空間阻隔透明質(zhì)酸酶侵入凝膠受到限制，說明對透明質(zhì)酸鈉凝膠 由酶降解率很低。對維持藥物維持侵入凝膠保持藥物活性，來自交聯(lián)透明

24、質(zhì)酸鈉凝膠的物質(zhì) 的空間排斥是有用的。由于蛋白質(zhì)不能滲入凝膠，例如透明質(zhì)酸酶摻近凝膠的藥物活力能被 維持直到該藥物被降解。無論怎樣，為了建立藥物釋放與高水溶交聯(lián)透明質(zhì)酸表面成降解比 例，人們考慮要求藥物分隔貯存。關于藥物參入交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠，提出降解的透明質(zhì)酸 鈉基質(zhì)內(nèi)作為有用的一個異質(zhì)藥物微貯存結構。依據(jù)這一道理，若干個與生物相容性好的微 顆粒例如脂微球白蛋白微球和其他微球引起了注意。在這研究中為了證實異質(zhì)結構微球控 制降解釋放藥物的可行性，聚苯乙烯被用來制備含有交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的微球。圖6顯示 靠羥基降解交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠及微球順序釋放的結果。圖8羥基應答交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠臺階式降解403*1201KO. Diy10000晚 9 知 *圖9在體炎癥應答交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠降解 從這圖上：可以結論基質(zhì)降解的速率與微球釋放速率一致。如果St是任何時間I從方塊表面 微球釋