液相色譜進(jìn)階講座之梯度洗脫

1、主題：液相色譜進(jìn)階講座之梯度洗脫簡介：通過實(shí)例詳細(xì)介紹“梯度洗脫”的意義、應(yīng)用領(lǐng)域、操作方法以及優(yōu)化，相信能夠使廣大網(wǎng)友的液相色譜技術(shù)有一些嶄新的提高歡迎參與交流和討論梯度洗脫gradient elution1 簡介通常情況下，液相色譜操作中的流動(dòng)相組成和比例是恒定的，這種洗脫化合物的方式被稱為等度洗脫；但是為了改善分析結(jié)果，某些操作需要連續(xù)改變流動(dòng)相中各溶劑組分的比例以連續(xù)改變流動(dòng)相的極性，使每個(gè)分析組分都有合適的容量因子k，并使樣品種的所有組分可在最短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)最佳分離，這種洗脫方式稱為梯度洗脫。2 梯度洗脫的應(yīng)用梯度洗脫可在下列情形中發(fā)揮重要作用：A 在等度下具有較寬k值的多種樣品分析。

2、B 大分子樣品分析。C 樣品含有強(qiáng)保留的干擾物，在目標(biāo)化合物出峰后設(shè)置梯度洗脫，將干擾物洗脫出來，以免其影響下一次分析。D 單組份化合物方法建立時(shí)，不知道其洗脫情況，使用梯度洗脫，找出其較優(yōu)的洗脫條件。(1) 多組分分析時(shí)，這些組分往往具有很寬的k值范圍。假如使用等度洗脫，這些化合物的k值無法同時(shí)落在110之間，結(jié)果就是，無法同時(shí)得到較好的分離度、較短的分離時(shí)間、較高的響應(yīng)值。圖T1、T2、T3是筆者不同條件下分析鄰苯二甲酸酯類化合物得到的色譜圖。圖T1  (等度，流動(dòng)相：80%乙腈水溶液)圖T2 (等度，流動(dòng)相：100%乙腈)圖T3 (梯度，0-5 min，乙腈由70%上

3、升到90%，5-10 min乙腈由90%上升到100%，10-18min，乙腈100%)其他色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18(2)，250*4.6 mm，5 m流速：1.0 ml/min檢測器：UV254 nm1 鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)2 鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)3 鄰苯二甲酸二正丙酯(DPrP)4 鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)5 鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)6 鄰苯二甲酸二戊酯(DPP)7 鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)8 鄰苯二甲酸二己酯(DHP)9 鄰苯二甲酸(2-乙基己基)酯(DEHP)三種洗脫方式對比條件最小分離度分析時(shí)間靈敏度等度1(T1)4100 min1-9

4、，靈敏度逐漸降低，8和9難以檢出等度2(T2)0.811 min1-9，靈敏度逐漸降低，均較高梯度(T3)325 min1-9，靈敏度相差不大，均較高由該分析案例可知，在多組分分析時(shí)，只要能夠選出合適的梯度條件，就能夠?qū)崿F(xiàn)“較好的分離度、較短的分離時(shí)間、較高的響應(yīng)值”。(2) 樣品溶液中同時(shí)含有目標(biāo)化合物和強(qiáng)保留化合物，目標(biāo)化合物流出后使用梯度洗脫將強(qiáng)保留化合物洗下來，以避免強(qiáng)保留化合物污染色譜柱或在后續(xù)的分析中流出干擾分析。T4 某分析項(xiàng)目末端梯度洗脫以洗掉過剩的衍生試劑(末端梯度：39-40 min，有機(jī)相含量由38%升高到80%，保持10 min)由T4可以看出，40 min左右，最晚出

5、峰的組分已經(jīng)被洗下來，然而卻把有機(jī)相在1 min內(nèi)由38%升高到80%，目的就是為了洗脫衍生反應(yīng)剩余的衍生試劑(50 min處的色譜峰)。前面的雜質(zhì)峰為樣品基質(zhì)中的強(qiáng)保留干擾物，末端的梯度洗脫同樣也將其洗了下來，這就避免了這些化合物在隨后的分析中緩慢流出造成的基線起伏。(3)當(dāng)遇到新的化合物需要分析，我們沒有文獻(xiàn)可以參考，只能初步圈定分析模式(反相、正相等等)，此時(shí)確定不了等度洗脫的流動(dòng)相組成和比例，只好借助梯度洗脫。3 梯度洗脫的原理(以反相色譜為例)梯度洗脫的實(shí)質(zhì)就是，樣品隨梯度起點(diǎn)的流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱入口，由于起點(diǎn)流動(dòng)相中強(qiáng)洗脫溶劑B含量較低，化合物C1(保留性適中)和化合物C2(保留較強(qiáng)

6、)因k值較高而滯留于色譜柱入口附近(幾乎未移動(dòng))。一段時(shí)間后，B增加到一定數(shù)值，C1的k值達(dá)到足夠小(比如小于10)，其在柱中的移動(dòng)速率明顯增大，并且隨著B的增加，其移動(dòng)速率愈加快速，直到tC1時(shí)流出色譜柱，被檢測器檢測到并被記錄成色譜峰C1，tC1雖然比等度時(shí)的保留時(shí)間長很多，但C1的的平均k值卻很小，因而色譜峰并未展寬，靈敏度仍處于較高水平。B持續(xù)增加，在隨后的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)，C2的k值也降到10以下，C2的移動(dòng)速率也開始變快，以與C1類似的方式于tC2被洗脫出色譜柱，其平均k值同樣很小，色譜峰亦未展寬，靈敏度處于較高水平。T5 梯度洗脫過程中的峰遷移黑色虛線代表B比例的變化(對應(yīng)左側(cè)上方縱軸

7、)紅色曲線代表化合物k值隨流動(dòng)相改變而發(fā)生的變化(對應(yīng)右側(cè)縱軸)綠色曲線代表化合物化合物在柱中的位置變化(對應(yīng)左側(cè)下方縱軸)紫色曲線為色譜圖4 梯度分離的建立梯度洗脫可以按下列步驟建立;A 選擇初始條件：色譜柱(類型和規(guī)格)、流動(dòng)相組成、流速、柱溫等等B 根據(jù)A的分析結(jié)果升高起始流動(dòng)相中的B%并降低結(jié)束流動(dòng)相中的B%，以去除色譜圖中第一個(gè)峰出現(xiàn)前的和最后一個(gè)峰出現(xiàn)后的無意義時(shí)間C 當(dāng)峰分離較差或運(yùn)行時(shí)間過長的時(shí)候，應(yīng)通過調(diào)整強(qiáng)洗脫溶劑B、B升高速率或使用分段梯度等方式予以解決D 考察不同儀器對梯度分離的影響。(1)選擇梯度條件流動(dòng)相：選擇一種強(qiáng)洗脫溶劑和一種弱洗脫溶劑，反相中常用強(qiáng)洗脫溶劑為乙

8、腈和甲醇，弱洗脫溶劑為水,(由于反相中分離的化合物許多具有解離性，所以水相往往有酸、緩沖鹽等，這些不在本講座討論范圍以內(nèi)，本講座提到的水相可能包括純水、緩沖鹽水溶液等，具體事例會(huì)明確寫出)。正相中常用的強(qiáng)洗脫溶劑為甲基叔丁基醚、異丙醇等，弱洗脫溶劑為正己烷。流速：對于4.6 mm內(nèi)徑的色譜柱一般把流速設(shè)定為1.01.5 ml/min，其他內(nèi)徑的色譜柱可以以此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行換算；柱溫：如有柱溫箱，設(shè)定柱溫3545 ºC為宜；初始變化速率：可以按下面的公式計(jì)算確定F為流速，單位為ml/min；Vm為色譜柱死體積，單位為ml；k*為期望的平均保留因子；%B為強(qiáng)洗脫溶劑的變動(dòng)值；tG為梯度時(shí)間，單

9、位為min。該公式適用于相對分子量處于50500之間的化合物。對于150*4.6 mm的色譜柱，Vm約為1.2 ml；流速通常設(shè)定為1.0 ml/min；k*為5是比較好的選擇；因此%B/tG應(yīng)為3.3，也就是B的改變速率設(shè)定為3.3%是適宜的，當(dāng)梯度范圍為5%-100%，梯度時(shí)間可以設(shè)為29 min。梯度范圍：為避免峰遺漏，初始梯度范圍最好設(shè)置為強(qiáng)洗脫溶劑變動(dòng)范圍為5%-100%，在反相中可以把乙腈的變動(dòng)范圍設(shè)置在5%-100%，如果是能夠耐受純水的色譜柱，也可以設(shè)定在0%-100%。梯度形狀：在初始梯度實(shí)驗(yàn)中，梯度可設(shè)置成線性(不分段)，在后續(xù)的調(diào)整中則可以設(shè)置分段梯度，每一段梯度的B變動(dòng)

10、斜率存在差別。(2)調(diào)整強(qiáng)洗脫溶劑B、梯度變化速率或使用分段梯度等方式以優(yōu)化梯度條件流動(dòng)相對選擇性起著至關(guān)重要的作用，流動(dòng)相組成或比例的改變均會(huì)顯著改變分離度，在梯度中亦然。反相模式梯度的初試中，強(qiáng)洗脫溶劑往往選擇乙腈，但乙腈只是在某些項(xiàng)目中具有較好的選擇性，而另一些項(xiàng)目甲醇或許更合適。乙腈、甲醇洗脫能力相近，但二者的選擇性則具有互補(bǔ)性。T6、T7、T8是PITC柱前衍生-反相液相色譜分析18種氨基酸的色譜圖。T6以乙腈作為強(qiáng)洗脫溶劑，丙氨酸和脯氨酸(7和8)分離度不足1.5；T7以甲醇作為強(qiáng)洗脫溶劑，9后面的組分分離很差。上述表明，甲醇對前面一組峰的分離較好，兒乙腈則更適合后面一組峰，因此筆

11、者把甲醇乙腈混合液作為強(qiáng)洗脫溶劑，T8證明這種混合溶劑的確能夠?qū)?8種天然氨基酸、內(nèi)標(biāo)物正亮氨酸以及NH3的的分離度達(dá)到2.0以上。T6 B為80%乙腈水溶液T7 B為80%甲醇水溶液T8 B為甲醇：乙腈：水=20:60:20其他色譜條件色譜柱：Diamonsil AAA氨基酸分析柱，250*4.6 mm，5 m；流動(dòng)相B：見譜圖上方的描述流動(dòng)相A：0.05 mol/L乙酸鈉水溶液(pH=6.5)流速：1.0 ml/min檢測器：UV 254 nm柱溫： 35 攝氏度具體化合物：1 Asp(天冬氨酸)；2 Glu(谷氨酸)；3 Ser(絲氨酸)；4 Gly(甘氨酸)；5 His(組氨酸)；6

12、Arg(精氨酸)；7 Thr(蘇氨酸)；8 Ala(丙氨酸)；9 Pro(脯氨酸)；10 NH3；11 Tyr(酪氨酸)；12 Val(纈氨酸)；13 Met(蛋氨酸)；14 Cys(胱氨酸)；15 Ile(異亮氨酸)；16 Leu(亮氨酸)；17 Nle(正亮氨酸)；18 Phe(苯丙氨酸)；19 Trp(色氨酸)；20 Lys(賴氨酸)化合物列表與T8上的峰號(hào)嚴(yán)格對應(yīng)。梯度變化速率梯度變化速率與平均保留因子k*是成反比關(guān)系的，梯度變化速率降低，k*值增加，并會(huì)產(chǎn)生如下結(jié)果：其一，各組分間的分離度R提高；其二，色譜峰的區(qū)域?qū)挾仍黾?，靈敏度下降；其三，分析時(shí)間延長。第一點(diǎn)是積極的，第二、第三點(diǎn)

13、是消極的。所以應(yīng)在分離度能滿足要求的前提下，控制梯度變化速率不要過低。下面是梯度變化速率的影響：測試項(xiàng)目為15種農(nóng)藥，唯一變量為梯度變化速率。T9  甲醇變化速率20%/min，k*=1T10  甲醇變化速率5%/min，k*=4T11  甲醇變化速率1%/min，k*=15其他色譜條件色譜柱：C18,250*4.6 mm，5 m流動(dòng)相：甲醇，水流速：1.7 ml/min柱溫：室溫由T9、T10、T11可知，隨著強(qiáng)洗脫溶劑變化速率降低，各組分的分離度逐漸增大，分析時(shí)間也逐漸延長。如果改變?nèi)軇?、調(diào)整梯度變化速率仍不能較好分離則需要改成非

14、線性梯度。下面是偶氮釋放的24種芳香胺分析：T12  偶氮釋放的24種芳香胺分析的梯度設(shè)置B為甲醇，A為0.005 mol/L 磷酸二氫銨+0.005mol/L磷酸氫二鈉水溶液T14  色譜圖結(jié)合梯度和色譜圖可知，1-6是由第一段梯度(藍(lán)色虛線)洗脫下來，B升高速率為0.5%；7-16由第二段梯度(粉色虛線)洗脫下來，B升高速率為0.27%，色譜峰寬度較大；17-24由第三段梯度(綠色虛線)洗脫下來，B升高速率為1.85%，因而峰形最為尖銳。(3) 不同儀器對梯度分析結(jié)果的影響以及消除影響的辦法與等度分析不同，梯度分析時(shí)，色譜柱入口的流動(dòng)相狀態(tài)并不能與梯

15、度曲線上的流動(dòng)相狀態(tài)在時(shí)間上準(zhǔn)確對應(yīng)。比如，0 min流動(dòng)相比例已經(jīng)開始變化了，這種變化首先由泵或比例閥做出動(dòng)作，而此刻柱入口處的流動(dòng)相組成仍是初始流動(dòng)相，變化的流動(dòng)相穿過泵或比例閥到柱頭之間的空間后才能傳達(dá)到柱入口，所以色譜柱入口的流動(dòng)相狀態(tài)始終滯后于時(shí)間程序上的流動(dòng)相狀態(tài)。滯后時(shí)間tD=VD/F，VD是泵或比例閥到柱頭之間的體積，F(xiàn)為體積流速。不論是高壓梯度還是低壓梯度，滯后體積通常處于28 mL之間，滯后體積的不同會(huì)導(dǎo)致下列現(xiàn)象：其一，在不同款式儀器上使用相同梯度，保留時(shí)間會(huì)發(fā)生變化；其二，在一種款式的儀器上開發(fā)的梯度洗脫方法換到另一款儀器上，可能會(huì)出現(xiàn)分離度下降、峰位置變化等現(xiàn)象可用用下面的辦法消除上述不利影響：在A儀器上(VD=V1)開發(fā)梯度方法，在開發(fā)的梯度程序前預(yù)先加入5 min等度洗脫(比例與初始流動(dòng)相比例相同)，并確定這5 min的等度為影響分離，這就可以作為最終的梯度條件；等換到B儀器上(VD=V2)，若V2=V1，梯度程序不需改變；若V2大于V1，那么應(yīng)把前面的等度時(shí)間調(diào)小，減小值應(yīng)為(V 2-V1)/F；若V2小于V1，那么應(yīng)把前面的等度時(shí)間調(diào)大，增加值應(yīng)為(V1-V2)/F。說到這里了，您