沈陽藥科大學畢業(yè)論文1

1、沈 陽 藥 科 大 學本 科 畢 業(yè) 論 文 論文題目：HPLC同時測定了哥王中4種香豆素的含量 起止時間：2012年10月09日 2013年 6月10日 姓名學號： 學院專業(yè)：中藥學院中藥學專業(yè) 年級班級：2009級中藥學一班指導教師：實習單位：藥學院藥物分析教研室目 錄摘 要1Abstract2第一章 前言31.1 香豆素類化合物的基本知識31.1.1 香豆素類化合物的基本結(jié)構(gòu)31.1.2 香豆素類化合物分類31.1.3 香豆素類化合物的藥理活性41.2 研究思路與立題依據(jù)6第二章 實驗部分72.1 實驗材料72.2 溶液的配制72.2.1 對照品溶液的制備72.2.2 供試品溶液的制備8

2、2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗82.4 方法學驗證92.4.1 線性關(guān)系考察92.4.2 檢測限與定量限的確定92.4.3 精密度試驗92.4.4 穩(wěn)定性試驗102.4.5 重復性試驗102.4.6 回收率試驗102.5 樣品含量測定10第三章 結(jié)果與討論133.1 結(jié)果133.2 討論13參考文獻14致 謝16HPLC同時測定了哥王中4種香豆素的含量摘 要目的：建立HPLC同時測定了哥王中傘形花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的含量。方法：該方法采用依利特Hypersil-ODS色譜柱(200 mm×4.6 mm，5 m)，乙腈-0.1%

3、磷酸水溶液為流動相梯度洗脫，檢測波長345 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ，進樣量20 L。結(jié)果：傘形花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的質(zhì)量濃度分別在0.070 0.770 (r=0.9999)，0.1902.09 (r=0.9999)，0.7658.42 (r=0.9998)，4.0844.9 mg·L-1 (r=0.9999)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為98.0% (RSD=1.9%)，96.6% (RSD=1.2%)，96.5% (RSD=1.7%)，101.3% (RSD=1.1%)。結(jié)論：該

4、方法簡便、快速、結(jié)果準確，可作為了哥王藥材的質(zhì)量控制方法。關(guān)鍵詞：了哥王；HPLC；傘形花內(nèi)酯；西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷；triumbelletin；西瑞香素；含量測定Simultaneous determination of four coumarins in Wikstroemia indica (L.) C. A. Mey. by HPLCAbstractObjective: To establish a reversed-phase high performance liquid chromatographic method for simultaneous determinat

5、ion of 4 coumarins in Wikstroemia indica (L.) C. A. Mey. Method: The chromatographic separation was performed on an Elite Hypersil-ODS column (4.6 mm×200 mm, 5 m) with a gradient elution of acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution as the mobile phase, the UV detection wavelength was s

6、et at 345 nm, the flow rate was 1.0 mL·min-1, the column temperature was maintained at 30 and the injection volumn was 20 L. Result: All the standard compounds showed a good linearity in the relatively wide concentration range of 0.070-0.770 (r = 0.9999), 0.190-2.09 (r = 0.9999), 0.765-8.42 (r

7、= 0.9998), 4.08-44.9 mg·L-1 (r = 0.9999) for umbelliferone, daphnoretin-7-O-D-glucoside, triumbelletin and daphnoretin, respectively. Under these conditions, the average recoveries of the four coumarins were 98.0%, 96.6%, 96.5%, 101.3%, respectively and the relative standard deviations (RSD) we

8、re 1.9%, 1.2%, 1.7%, 1.1%, respectively. Conclusion: The developed method was found to be accurate, sensitive and reproducible, and could be successfully applied to the quality control of Wikstroemia indica (L.) C. A. Mey.Key words: Wikstroemia indica (L.) C. A. Mey.; HPLC; umbelliferone; daphnoreti

9、n-7-O-D-glucoside; triumbelletin; daphnoretin; content determination第一章 前言瑞香科植物在世界上約有48屬650種以上，廣泛分布于南北半球的熱帶和亞熱帶地區(qū)，多分布于非洲、大洋洲和地中海沿岸。我國有10屬100種左右，其中主要以瑞香屬和蕘花屬居多，各省均有分布，但主產(chǎn)于長江流域及以南地區(qū)。該科植物多有一定毒性，對皮膚及粘膜有強烈刺激性，可供藥用植物不多，但近年來進行了大量的化學工作，分離得到了許多重要化合物的結(jié)構(gòu)，其相關(guān)藥理實驗表明該科植物具有多種顯著的生理活性，引起了各國學者的關(guān)注。了哥王 (Wikstroemia ind

10、ica (L.) C. A. Mey.)為瑞香科蕘花屬植物，又名嶺南蕘花，分布于我國浙江、江西、福建、湖南、廣東、廣西等省區(qū)。了哥王性味苦寒、微辛、有毒，具有清熱解毒、化痰散結(jié)、消腫止痛等作用，主治風濕性關(guān)節(jié)炎、扁桃體炎、癰腫、跌打損傷等1。已知了哥王含有黃酮類、香豆素類、多糖類、木脂素類、揮發(fā)油類、甾體類、皂苷類等成分2-4。1.1 香豆素類化合物的基本知識1.1.1 香豆素類化合物的基本結(jié)構(gòu)香豆素 (Coumarin)，化學名稱為2H-1-苯并吡喃-2-酮 (2H-1-Benzopyran-2-one)，即苯并-吡喃酮。香豆素是順式-鄰羥基桂皮酸的內(nèi)酯，是一種具有芳香氣味的化合物，其化學結(jié)

11、構(gòu)式見圖1-1。圖1-1 香豆素的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1-1 Chemical structure of coumarin1.1.2 香豆素類化合物分類5香豆素類化合物主要分為以下幾類：(1) 簡單香豆素類：這類化合物是指僅在苯環(huán)有取代基的香豆素類。絕大多數(shù)香豆素在C-7位都有含氧基團存在，僅少數(shù)例外。其他C-5、C-6、C-8位也有含氧基團取代的可能，常見的含氧基團有羥基、甲氧基、亞甲二氧基。這類香豆素常見的有傘形科植物中的傘形花內(nèi)酯，瑞香中的瑞香素，蛇床子中的蛇床子素，獨活中的當歸內(nèi)酯等；(2) 呋喃香豆素類 (furocoumarins)：苯環(huán)上的異戊烯基與其鄰位的酚羥基環(huán)縮合而成的化合物

12、。成環(huán)后常伴隨著降解，失去3個碳原子，根據(jù)呋喃環(huán)的位置，此類化合物通常被分為線型 (linear)和角型 (angular)。如存在于補骨脂中的補骨脂內(nèi)酯，旱前胡中的旱前胡甲素、旱前胡乙素等；(3) 吡喃香豆素類 (pyranocoumarins)：由香豆素苯環(huán)上的異戊烯基與鄰位的酚羥基環(huán)縮合形成2,2-二甲基-吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，與呋喃香豆素類似，根據(jù)吡喃環(huán)環(huán)合的位置，也分為角型和線型兩種類型。如狹縫芹中的狹縫芹素，白花前胡中的北美芹素、白花前胡丙素等；(4) 異香豆素類 (isocoumarin)：是香豆素的異構(gòu)體，分布比較零散，局限在少數(shù)科屬中；(5) 其他香豆素類：從植物中發(fā)現(xiàn)的天然香

13、豆素類成分，還有些化合物的結(jié)構(gòu)不能歸屬于上述4種類型。常見的取代基有苯基、羥基、異戊烯基等基團，如茵陳中的茵陳素，白花丹中的白花丹精等。1.1.3 香豆素類化合物的藥理活性香豆素類物質(zhì)具有多種多樣的生理活性：對植物有雙重生理活性，在低濃度時促進植物生長，在高濃度時抑制植物生長；對人體則具有抗腫瘤、抗HIV、抗菌、抗凝血、抗氧化、消炎止痛、止咳平喘、降壓等作用，特別是某些衍生物具有抗腫瘤活性和抗HIV活性，引起了國內(nèi)外學者廣泛的關(guān)注。(1) 抗腫瘤作用通過對香豆素類化合物的抗腫瘤作用研究，發(fā)現(xiàn)許多香豆素類化合物具有抗腫瘤活性，為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了先導化合物。雙香豆素在臨床上作為凝血劑廣泛使用

14、。雙香豆素是NADPH (醌類氧化還原酶)的競爭性抑制劑，可以增加細胞內(nèi)過氧化物的生成和影響腫瘤細胞的增殖，Gonzalez-Aragon等6研究首次表明，雙香豆素可以抑制骨髓性白血病HL-60細胞內(nèi)線粒體的電子傳送，逆轉(zhuǎn)復合體II電子流方向引起過氧化物釋放，并且抑制嘧啶的生物合成；Kostova等7研究了三種雙香豆素衍生物鈰配合物的細胞毒性，實驗中使用急性骨髓性白血病HL-60細胞株和慢性骨髓性白血病 (CML)BV-17細胞株。通過凝膠電泳分析DNA來評價化合物引起程序細胞死亡的能力。此外，還闡明了程序細胞死亡的形態(tài)學特征。(2) 抗炎鎮(zhèn)痛作用Tsai等8研究發(fā)現(xiàn)白花丹屬植物中的吡喃香豆素

15、Seselin能抑制植物凝集素 (PHA)，這種植物凝集素能刺激人類周邊血液中單核細胞 (PBMC)增殖，IC50為 (53.87±0.74) M。Seselin抑制PBMC增殖并不是通過細胞毒性，而是通過抑制炎癥性細胞因子白介素2 (IL-2)和干擾素 (IFN-)。此外，Seselin能顯著抑制PBMC中IL-2和IFN-的基因表達。(3) 對心血管系統(tǒng)的作用天然香豆素類化合物對心血管系統(tǒng)的作用機制主要是基于其鈣離子拮抗劑的作用，具有心血管活性的天然香豆素可抑制鈣離子經(jīng)鈣通道進入細胞，從而產(chǎn)生降壓、抗心律失常、負性肌力等生物學作用。Dongmo等9從植物Mammea africa

16、na莖皮分離得到的4-n-propylcoumarins，4-phenylcoumarins表現(xiàn)出微弱的血管松弛作用。(4) 抗菌及抗微生物作用Ferreira等10從植物Helietta apiculata莖皮中分離得到3- (1-二甲基烯丙基)-紫花前胡醇當歸酯和敘利亞蕓香素 (-)-heliettin，在體外對利什曼原蟲的前鞭毛體形式作用溫和，IC50為450 g·mL-1；對感染亞馬遜利什曼原蟲的小鼠療效顯著。(5) 抗HIV作用Sancho等11研究發(fā)現(xiàn)歐前胡素有明顯的抗HIV-1活性。Zhou等12從五?；ò⑽焊蟹蛛x得到的水合氧化前胡素、獨活醇、氧化前胡素和甲酸氧化前胡

17、素具有明顯的抗HIV作用。Shikishima等13從Prangos tschimganica分離得到的補骨脂素能抑制H9淋巴細胞中HIV-1復制，EC50為0.1 g·mL-1；抑制未受感染的H9淋巴細胞增殖，IC50為19.1 g·mL-1，治療指數(shù)TI為191 (通常TI大于5就認為藥物有治療作用)；石當歸素和佛手內(nèi)酯也有很強的抗HIV活性，TI分別為11.7和69.9。1.1.4 香豆素類化合物的含量測定方法香豆素類化合物的含量測定方法有：高效液相色譜法、比色法、熒光法、核磁共振波譜法、紫外分光光度法、氣相色譜法、薄層掃描法、極譜法等。國外研究者還報道了幾種改進的技

18、術(shù)，如膠束電動毛細管技術(shù)、直角納米通道技術(shù)、凝膠溶膠通道技術(shù)等來檢測香豆素類物質(zhì)14。目前，應用最多的是高效液相色譜法，選用合適的色譜柱和流動相，可以很好地分離許多香豆素類物質(zhì)。顧源遠等15采用紫外分光光度法測定明黨參中總香豆素的含量，以珊瑚菜內(nèi)酯為對照品，檢測波長為268 nm，并對該方法的重復性、穩(wěn)定性、精密度及加樣回收率進行試驗，該法簡便、可靠，為有效控制明黨參藥材的質(zhì)量奠定了一定基礎(chǔ)；周興旺等16等用雙波長薄層掃描法測定了5種產(chǎn)地的地骨皮藥材中莨菪亭 (Scopoletin)的含量，以山西產(chǎn)地骨皮 (LyciumchinenseMill.)的含量最高；鄭麗容等17用高效液相色譜法測定復

19、方膽通膠囊中羥甲香豆素的含量，方法簡單、快速、準確；劉麗霞等18采用HPLC法測定了哥王中傘形花內(nèi)酯的含量，為完善了哥王藥材質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)；李艷敏等19 采用HPLC法測定了哥王中西瑞香素的含量，具有操作簡便準確，回收率好，精密度、重現(xiàn)性高，分析快速的優(yōu)點，可作為了哥王藥材的質(zhì)量控制方法。1.2 研究思路與立題依據(jù)香豆素類化合物具有抗HIV、抗癌、降壓、抗心律失常、抗骨質(zhì)疏松、鎮(zhèn)痛、平喘及抗菌等多種生物活性，具有潛在的藥用價值，其中抗腫瘤作用是一個研究熱點。因此，研究開發(fā)更多的天然植物香豆素類成分，尋找高效低毒的香豆素類化合物及其衍生物已成為當今藥物研究與開發(fā)工作的重中之重。香豆素類成分是了

20、哥王藥材中主要的抗腫瘤活性成分之一，且含量較大。目前，在了哥王中香豆素的含量測定方面，僅是關(guān)于西瑞香素和傘型花內(nèi)酯的研究，相關(guān)報道有限，不足以作為評價藥材質(zhì)量的標準。因此，有必要對了哥王香豆素類化合物的質(zhì)量控制進行深入系統(tǒng)的研究，以期提供了哥王抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，尋找了哥王中有效可控成分，完善了哥王的質(zhì)量控制標準?；谏鲜銮闆r，本文擬采用的基本研究思路如下：擬建立HPLC同時測定不同產(chǎn)地了哥王中傘形花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的含量。第二章 實驗部分2.1 實驗材料儀器LC-20A 高效液相色譜儀日本SHIMADZUSPD-20A紫外檢測器日本

21、SHIMADZULC solution 色譜工作站日本SHIMADZUTG332A分析天平湘儀天平儀器廠KQ5200B型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司QE100藥材粉碎機浙江省武義縣屹立工具有限公司試劑甲醇 (色譜純)山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠乙腈 (色譜純)山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠純凈水杭州娃哈哈集團有限公司甲醇 (分析純)天津市富宇精細化工有限公司無水乙醇 (分析純)天津市富宇精細化工有限公司磷酸 (色譜級)天津市科密歐化學試劑有限公司 藥材：了哥王藥材9批，分別購于云南、江西、四川等地，由沈陽藥科大學孫啟時教授鑒定為瑞香科蕘花屬植物了哥王Wikstroemia indica

22、 (L.) C. A. Mey.的干燥根莖；對照品：傘形花內(nèi)酯 (天津馬克生物技術(shù)有限公司，批號20120308，純度大于99.0%)、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素 (本實驗室自制，純度均大于98.5%)，4種香豆素化合物的結(jié)構(gòu)見附圖2-1。2.2 溶液的配制2.2.1 對照品溶液的制備 分別取干燥至恒重的傘型花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素對照品約適量，精密稱定，分別置25，100，25，25 mL的量瓶中，用體積分數(shù)為80%的甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為70.00，15.80，85.0，2

23、04.2 mg·L-1的傘型花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素對照品儲備液。分別精密量取上述對照品儲備液0.50，6.0，4.5，10 mL至25 mL量瓶中，用體積分數(shù)為80%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為1.400，3.792，15.30，81.68 mg·L-1的傘型花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素混合對照品儲備液，4 備用。2.2.2 供試品溶液的制備取了哥王干燥藥材細粉 (過60目篩)約0.7 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入體積分數(shù)為80%的甲醇30

24、 mL，密塞，精密稱定其重量，超聲處理45 min，放冷，再稱定其重量，用提取溶劑補足失重，搖勻，經(jīng)0.45 m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 依利特Hypersil-ODS色譜柱 (200 mm×4.6 mm，5 m)；流動相：乙腈 (A)-0.1%磷酸水溶液 (B)，梯度洗脫程序：05 min，18%A；620 min，20%A；2333 min，30%A；3439 min，50%A；3942 min，18%A；4145 min，18%A；流速1.0 mL·min-1；檢測波長345 nm；柱溫30 ；進樣量20 L。在上述色譜條件下，傘

25、形花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的理論塔板數(shù)均大于3000，與相鄰峰間的分離度均大于1.5，色譜峰對稱因子均在0.951.05。典型色譜圖見附圖2-2。 a b c d 圖2-1 傘形花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的化學結(jié)構(gòu)式Fig.2-1 Structures of umbelliferone (a), daphnoretin-7-O-D-glucoside (b), triumbelletin (c) and daphnoretin (d)BA1-umbelliferone; 2-daphnoret

26、in-7-O-D-glucoside; 3-triumbelletin; 4-daphnoretin圖2-2 混合對照溶液 (A)和供試品溶液 (B)的高效液相色譜圖Fig.2-2 HPLC chromatograms of standard solution (A) and sample solution (B)2.4 方法學驗證2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品儲備液0.5，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5 mL，分別置10 mL量瓶中，加體積分數(shù)為80%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，得傘型花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的系列標準溶液

27、。按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以對照品溶液質(zhì)量濃度 (mg·L-1)為橫坐標，峰面積 (A)為縱坐標，繪制標準曲線，得傘型花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的回歸方程，分別為：Y=8.348×104X-3.292×102 (r=0.9999)，Y=7.291×104X-2.776×103 (r=0.9999)，Y=7.203×104X+2.899×102 (r=0.9998)，Y=8.024×104X-1.620×104 (r =0.9999)。

28、結(jié)果表明傘型花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素分別在0.0700.770，0.1902.09，0.7658.42，4.0844.9 mg·L-1與峰面積呈良好線性關(guān)系。2.4.2 檢測限與定量限的確定 分別將傘型花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素對照品溶液稀釋成不同的質(zhì)量濃度進行HPLC分析，測得其檢測限 (信號S和噪音N的比值S/N=3)分別為3.5，7.9，8.5，4.1 ng·ml-1，定量限 (信號S和噪音N的比值S/N=10)分別為7.0，15.8，21.3，10.2 ng

29、3;ml-1。2.4.3 精密度試驗精密吸取“”項下系列標準溶液 (傘型花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的質(zhì)量濃度分別為0.350，0.948，3.82，20.4 mg·L-1)20 L，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果傘型花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素峰面積的RSD分別為0.88%，0.56%，1.1%，0.31%，結(jié)果表明儀器精密度良好。 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，室溫放置，按“2.3”項下色譜條件，分別在0，2，4，6，8，10，12，24 h進樣測定，記錄峰面積。傘

30、型花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素峰面積的RSD分別為1.9%，2.3%，1.9%，1.8%，結(jié)果表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。 重復性試驗取了哥王干燥藥材細粉 (過60目篩，No.3)，按“”項下方法平行制備6份供試溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定。測得傘型花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的平均含量分別為0.0108，0.0440，0.272，1.26 mg·g-1；RSD分別為1.3%，1.5%，1.2%，1.3%，結(jié)果表明方法的重復性良好。2.4.6 回收率試驗采用加樣回

31、收試驗法。取已知含量 (傘型花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的平均含量分別為0.0108，0.0440，0.272，1.26 mg·g-1)的了哥王干燥藥材細粉 (過60目篩，No.3)約0.35 g，共9份，精密稱定，分別加入低、中、高3個質(zhì)量濃度的對照品溶液 (分別相當于藥材原有含量的80%、100%、120%)，每一質(zhì)量濃度取3份，按“”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。傘型花內(nèi)酯的平均回收率為98.0%，RSD為1.9% (n=9)；西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷的平均回收率為96.6%，RS

32、D為1.2% (n=9)；triumbelletin的平均回收率為96.5%，RSD為1.7% (n=9)；西瑞香素的平均回收率為101.3%，RSD為1.1% (n=9)。結(jié)果表明回收率試驗符合要求，方法的準確度良好，計算結(jié)果見表2-1。2.5 樣品含量測定取9個產(chǎn)地的了哥王干燥藥材細粉 (過60目篩)，按“”項下方法操作 (其中No.2、No.5和No.7供試品溶液分別稀釋5倍、2.5倍和2倍后進行HPLC測定)，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，按標準曲線法計算傘型花內(nèi)酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的含量，結(jié)果見表2-2。表2-1 了哥王中4種香

33、豆素的回收率測定結(jié)果Table.2-1 Recoveries of the four coumarins in Wikstroemia indica (L.)C.A.Mey. (n=9)Marker compoudmorigin/gmadded /gmfound /gRecovery /%Average/%RSD/%umbelliferone3.7993.1506.84796.898.01.93.8053.1506.85596.83.8033.1506.94199.63.8143.8507.51996.23.7893.8507.643100.13.7993.8507.47795.53.8014

34、.5508.24097.63.7884.5508.30399.23.7944.5508.366100.5daphnoretin-7-O-D-glucoside15.4812.3227.6398.696.61.215.5012.3227.6298.415.4912.3227.3396.115.5415.3330.3096.315.4415.3330.2096.315.4815.3330.1595.715.4818.3333.1496.315.4318.3332.8995.215.4618.3333.2396.9triumbelletin95.6976.50171.699.296.51.795.8

35、376.50170.197.195.7776.50171.599.096.0495.70187.395.495.4295.70187.396.095.6995.70187.095.495.72113.2203.995.695.39113.2202.995.095.55113.2203.995.7daphnoretin443.3355.3806.1102.1101.31.1443.9355.3805.8101.9443.6355.3808.3102.6444.9439.0890.4101.5442.0439.0884.4100.8443.3439.0893.2102.5443.4526.3968

36、.499.8441.9526.3964.899.4442.6526.3972.6100.7表2-2 不同產(chǎn)地了哥王中4種香豆素的含量測定結(jié)果Table.2-2 Contents of the four coumarins in Wikstroemia indica (L.)C.A.Mey. collected from different regions (n=3)NO.Sampleumbelliferonedaphnoretin-7-O-D-glucosidetriumbelletindaphnoretinContent RSD Content RSDContent RSDContent R

37、SD /g·g-1 /%/g·g-1 /%/g·g-1 /%/g·g-1 /%1Yunnan15.8431.823.371.8-1.7889.01.52Yunnan215.551.9235.31.7169.31.615161.53Guangxi110.801.644.002.0272.00.612601.44Guangxi26.1972.067.791.7351.71.215720.75Guangxi310.281.2183.81.7-2.214621.76Sichuan6.5280.722.401.1170.82.1744.41.97Jiangxi9.

38、5470.838.601.0426.70.810580.98Hunan11.262.025.601.7234.61.314761.69Guizhou16.852.0 35.50 1.2-1.817291.9- Means not detected第三章 結(jié)論與討論3.1 結(jié)論該方法簡便、準確、重復性好，適用于中藥了哥王的質(zhì)量控制。經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)地了哥王藥材含量差異較大，可能受地域環(huán)境或氣候影響所致。3.2 討論a. 分別取適宜濃度的4種香豆素的對照品溶液在200400 nm波長作紫外掃描，結(jié)果在345 nm下4個香豆素有共同的較大紫外吸收。且作HPLC檢測時，該波長下干擾小，待測組分達到基線分

39、離，重現(xiàn)性良好。故本實驗中吸收波長選用345 nm。b. 考察甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%冰醋酸水溶液等流動相系統(tǒng)，結(jié)果顯示以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時分離度及峰形能達到較好效果，同時在流動相中加入四氫呋喃，并未明顯改善分離效果，故確定以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫。c. 分別考察了乙醇、體積分數(shù)為25%，50%，75%，80%，90%的甲醇、甲醇作為提取溶劑，采用超聲提取法提取了哥王中的4種香豆素，結(jié)果表明乙醇提取待測物的色譜峰干擾較嚴重，本底較高，故不予采用；體積分數(shù)為80%的甲醇提取待測成分的含量均較高

40、，故采用體積分數(shù)為80%的甲醇為提取溶劑。以體積分數(shù)為80%的甲醇為提取溶劑比較加熱回流提取法和超聲提取法，結(jié)果超聲提取法的提取率較高。以體積分數(shù)為80%的甲醇為提取溶劑，超聲處理30，45，60 min，結(jié)果表明超聲處理45 min樣品中的待測成分已基本提取完全，綜合考慮提取量和色譜峰的干擾情況，故本研究采用體積分數(shù)為80%的甲醇超聲處理45 min提取方法。d. 樣品測定實驗結(jié)果：了哥王中triumbelletin和西瑞香素含量明顯高于傘型花內(nèi)酯和西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷。不同產(chǎn)地的了哥王中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素含量差異較小，而西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷和triumbelletin

41、含量差異較大，其中云南產(chǎn)地 (NO.2)的西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷含量最高，四川產(chǎn)地 (NO.6)的西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷含量最低；江西產(chǎn)地 (NO.7)的triumbelletin含量最高，而云南產(chǎn)地 (NO.1)、廣西產(chǎn)地 (NO.5)和貴州產(chǎn)地 (NO.9)未測到triumbelletin。本文與參考文獻18, 20對比，了哥王中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的平均含量分別降低約10倍和3倍，說明不同的生長環(huán)境、溫度、濕度等因素都對了哥王中這2種成分的含量有影響。參考文獻1宋小妹, 等. 中藥化學成分提取分離與制備M. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2004: 48-50. 2何建芳,

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