核酸分離純化及電泳

1、基因工程原理Introduction to genetic engineerins一、基因工程的定義：在體外對不同生物的遺傳物質（基因）進行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細菌質粒、病毒或噬菌體DNA)，轉入微生物、植物或動物細胞內進行無性繁殖，并表達出基因產物。二、基因工程誕生的理論基礎1 . DNA是遺傳物質1944年 Avery，確定了基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質。1952年Alfred Hershy和Marsha Chase進一步證明遺傳物質是DNA。2. DNA雙螺旋結構1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的

2、雙螺旋結構和半保留復制機制。3、中心法則與遺傳密碼1957年Crick又提出了遺傳信息傳遞的“中心法則” 1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等終于破譯了64個遺傳密碼在遺傳學上，把遺傳信息的流動方向叫做信息流。信息流的方向可以用科學家克里克提出的“中心法則”來表示。從“中心法則”可以看出，遺傳信息的一般流動方向（圖中紅線所示）是：遺傳信息可以從DNA流向DNA，即完成DNA的自我復制過程，也可以從DNA流向RNA，進而流向蛋白質，即完成遺傳信息的轉錄和翻譯過程 受體細胞經過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學試劑法)的處理后,

3、細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞(Compenent cells)。進入受體細胞的DNA分子通過復制,表達實現遺傳信息的轉移,使受體細胞出現新的遺傳性狀。 三、基因工程誕生的技術突破1. 限制性內切酶（restriction enzymes）1970年H.O. Smith等分離出第一種限制性核酸內切酶。2. DNA連接酶（ligase）1967年5個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現了DNA連接酶。3. 載體（vector）1972年前后使用小分子量的細菌質粒和l噬菌體作載體。在細菌細胞里的大量擴增。4. 感受態(tài)體系1970年M. Mandel和A. Higa發(fā)現經過

4、氯化鈣處理的大腸桿菌容易吸收噬菌體DNA。1972年S. Cohen發(fā)現這種處理過的細菌同樣能吸收質粒DNA。5. 瓊脂糖凝膠電泳1960s發(fā)明了瓊脂糖凝膠電泳，可將不同長度的DNA分離開。6. DNA測序技術1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert發(fā)明了DNA快速測序技術。四、基因工程的特征1. 跨物種性外源基因到另一種不同的生物細胞內進行繁殖。2. 無性擴增外源DNA在寄主細胞內可大量擴增，和高水平表達。五、基因工程的主要操作內容1. 目的基因的獲取從復雜的生物基因組中，經過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。2. 重組體的制備將目的基因

5、的DNA片斷插入到能自我復制并帶有選擇性標記（抗菌素抗性）的載體分子上。3.重組體的轉化將重組體（載體）轉入適當的受體細胞中。4.克隆鑒定挑選轉化成功的細胞克隆（含有目的基因）。5.目的基因表達使導入寄主細胞的目的基因表達出我們所需要的基因產物。第一節(jié) 分子生物學實驗室常用設備溫度控制系統n 冰箱：4 0C、-20 0C、-70 0Cn 恒溫培養(yǎng)箱：隔水式、電熱式n 鼓風干燥箱n 恒溫水浴n 低溫循環(huán)水浴n 微量加熱器n 恒溫空氣搖床n PCR熱循環(huán)儀n 制冰機n 冷庫n 高壓蒸汽滅菌器電泳設備u 瓊脂糖凝膠電泳系統u 垂直板凝膠電泳系統u 轉移電泳系統u 紫外分析儀u 凝膠成像系統離心設備u

6、 臺式高速冷凍離心機u 高速冷凍離心機u 大容量離心機u 超速離心機分光光度計722S、7200可見分光光度計紫外可見分光光度計其它n PH計n 電子天平n 旋渦振蕩器n 磁力攪拌器n 超聲波破碎儀n 超凈工作臺n 純水器第一章 基因工程的主要技術原理第一節(jié) DNA的提取與純化由于提取DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實驗條件等不同，DNA的提純有很多方法。其中最常用的是堿抽提法。一、質粒DNA的提?。ㄒ唬?、質粒載體概念 細菌質粒是獨立于宿主基因組復制、編碼抗生素抗性基因的小型環(huán)狀DNA分子、運載克隆DNA的常用載體。 質粒特點：染色體外的小型環(huán)狀分子，大小約為2200kb，通常以多拷

7、貝(可多達幾百個)形式存在于宿主細胞中。質粒含有復制起點(ori)用以保證質粒的自主復制正常復制依賴宿主細胞中的聚合酶及其他成分。質粒一般僅攜有幾個基因抗生素物質的抗性基因。最常見的抗性基因是amp+基因，編碼可以降解青霉素類抗生素如氨芐青霉素的內酰胺酶。另一種常見抗性基因是tetA基因，編碼一種可以從細胞內將四環(huán)素類抗生素排出的跨膜蛋白。pMD-18 T Vector pGEMT(二)、質粒DNA的制備小量法：堿裂解法（11分30秒）大量法：CsCl密度梯度離心法（1分30秒）試劑盒：由于質粒遠遠小于大腸桿菌染色體DNA，可以用物理化學方法將它們相分離，例如堿裂解法。1 .堿抽提法提取質粒D

8、NA（1）原理 閉合環(huán)狀的質粒DNA，在變性后不會分離，復性快；（2） 所用的試劑作用 溶菌酶能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的b-1，4糖苷鍵。 在堿性條件（pH>8）下有活性。 葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械力（震蕩）的作用而降解。EDTAMg2+、Ca 2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。NaOH-SDSNaOH：強堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。 SDS: 溶解細胞膜蛋白和細胞內蛋白，并結合成“蛋白SDS”復合物，使蛋白質（包括DNA酶）變性沉淀。 NaAc-HAc緩沖液冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調到4.8。 用來

9、中和NaOH變性液，使DNA復性。高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質、DNA、RNA等）沉淀。 乙醇用于沉淀DNA。DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。 RNase A降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 TE緩沖液DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖業(yè)），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。 酚-氯仿蛋白變性劑，進一步抽提DNA溶液中的蛋白質，使蛋白質沉淀。 但苯酚會殘留在DNA溶液中。 （現多用各種商品化的層析柱純化DNA)。（3）堿抽提

10、法提取質粒DNA的步驟 第一步：溶菌使用“溶液”溶解細菌細胞壁。Solution I 的配制：50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶， RNase A第二步：破膜，蛋白質和DNA變性溶液II 破壞細胞膜，蛋白質和DNA變性。Solution II 的配制：0.2N NaOH，1.0%SDS第三步：中和溶液III使DNA復性、并促使蛋白質-SDS復合物和染色體DNA、RNA沉淀。Solution III的配制：3M 醋酸鈉（用冰醋酸調pH至4.8）第四步：離心除去沉淀上清液中含有閉合質粒DNA。第五步：純化DNA上清液過柱或酚-

11、氯仿抽提。第六步：沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇。. 小量法：堿裂解法（11分30秒）攜有目的質粒的大腸桿菌菌株數毫升液體培養(yǎng)基（LB）增殖至穩(wěn)定期(過夜培養(yǎng))離心 菌體沉淀小量制備法提取質粒. 氯化銫梯度（1分30秒） 制備大量的質?？勺鳛槌Ｓ每寺≥d體貯備，或用作大量酶解反應的底物。此時CsCl密度梯度離心可被用來作為最終純化步驟。該步驟雖然有點費力，但卻是獲得極純的超螺旋質粒DNA的最佳方法。. 試劑盒（11分30秒） QIAGEN 等試劑盒 .一步法提取質粒DNA（16分20秒）2. 影響質粒DNA產量的因素最重要的是：菌株的遺傳背景，質粒自身的拷貝數。（1）受體菌株一般

12、要使用endA基因發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。如DH5a、JM109、XL1-Blue等。endA基因編碼核酸內切酶，在Mg2+的存在下可將雙鏈DNA消化成7bp的寡核苷酸片斷。（2）質?？截悢颠@是直接決定DNA產量的重要因素之一。質粒本身的性質所決定。（3）質粒大小分子量大的質粒，拷貝數少。二、基因組或其他DNA的提取1.細菌基因組DNA的制備一般過程及原理（1）細胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37 oC溫育。不用NaOH !（2）DNA純化CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)除去多糖，酚-氯仿-異戊醇除去蛋白。（3）沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇。2. 哺乳動物細胞基因組DNA的抽提一般過程及原理

13、：（1）組織粉碎動物組織剪成小塊，置液氮中凍結后研磨成細粉末。 組織培養(yǎng)的細胞用胰酶消化松散后直接使用。（2）細胞裂解0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC溫育。SDS是離子型去垢劑（detergent），可以使細胞膜崩解。（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質污染。（4）沉淀DNA用2倍體積的無水乙醇（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）（5）除去RNA污染用RNase。三、DNA的定量和純度測定1. 紫外光譜法原理：DNA（或 RNA）在260nm波長處有特異的紫外吸收峰。蛋白質在280nm處有吸收峰用微量比色杯（10ml）在紫外分光光度計直接測定。2. 瓊脂糖

14、凝膠電泳估計原理：溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā) 紅色熒光。與已知濃度的DNA電泳帶熒光強度對比，就可以估計出DNA含量。四、DNA分子量的估計一般使用瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA標準混合液對比得知。DNA分子量Marker有許多公司的商品，使用非常方便。如lDNA的Hind酶切物等。第二節(jié) DNA的凝膠電泳一、電泳的基本原理1. 帶電荷的分子在電場中會以一定的速率向與其電荷性質相反的電極移動，速度稱為電泳遷移率。 2. 電泳遷移率同電場的強度和分子本身所帶的凈電荷數目成正比。 3. 電泳遷移率同分子與介質的摩擦系數成反比。 4. 摩擦系數主要與分子的大小、形狀以

15、及介質的粘度有關。5. 如果電場強度一定（電壓和電極距離）、電泳介質相同（電泳液和凝膠）： 分子在電場中遷移的速度主要取決于分子本身的大小和形狀。 形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關: 分子量越大，移動越慢。相同分子量的DNA:環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快， 線性分子次之， 伸展開環(huán)狀最慢。 二 、瓊脂糖凝膠電泳1. 瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產物瓊脂中提取而來。2. 瓊脂糖凝膠瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨”。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。濃度高 空隙小3.瓊脂糖凝膠的分辨力空隙大小決定其分辨分子大小的能力?？障缎。直媛矢撸?小

16、分子較易通過，而大分子難通過； 空隙大，分辨率低： 大小分子幾乎以同等速率通過。瓊脂糖的濃度（%）分離DNA的片斷大小（bp）0.3 0.7 1.4500001000 200001000 6000300三 、聚丙烯酰胺凝膠電泳優(yōu)點是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。瓊脂糖凝膠電泳：100050000bp 聚丙烯酰胺凝膠電泳：11000bp聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）分離DNA片斷大?。╞p）4.0 10.0 20.01000100 50025 501四、凝膠染色1. 染料溴化乙錠。Ethidium bromide （EB）2. 原理EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結合。 EB在300n

17、m紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。 熒光強度與DNA含量及大小成正比。UVP全自動凝膠成像分析系統OMEGA8-LOGO全自動凝膠成像分析系統第二節(jié) DNA克隆概述一、DNA克?。?通過將生物體基因組DNA片段作為自主復制載體的一部分進行獨立復制的方式，使對該片段的分離及操作簡單化。 背景：長期以來，由于生物體內某些蛋白質或其他組分的含量稀少難以大量純化，造成對這些物質的詳盡分子分析極其困難或者幾乎不可能。 一種途徑是直接分離負責某一蛋白質表達的或某一產物形成的基因。然而每個生物體的基因組都很龐大、復雜，且任一目的基因序列通常在單個細胞中只出現一到兩次，因此標準

18、的化學或生化方法都不能被用來分離基因組中的特定區(qū)域以對其進行研究，尤其是當目的DNA序列與所有其他序列具有化學相同性時更加困難。 解決這一難題的方法是將基因組中攜有該基因或其他相關序列的較小片段連接到一段可以自主復制的DNA即載體上，形成通?？梢栽诹硪凰拗髦羞M行復制的重組DNA，這種復制是獨立于原初基因組的。帶有重組DNA的宿主細胞的增殖構成了一群具有遺傳一致性的個體，或稱為單克隆。這一系列操作過程就被稱作DNA克隆。在進行DNA克隆中，通常將以下操作、制作或生產歸為遺傳工程范疇：u DNA序列分析，以及由此派生的蛋白質序列分析u 對基因啟動子及其他調控序列的分離與分析u 通過大量正常和突變形

19、式的產物研究來了解這些蛋白質酶RNA的功 能u 突變的鑒定，例如由于基因缺陷導致形成的疾病u 生物技術，如蛋白質及其他重要生物功能的分子如人胰島素和生長素的大規(guī)模工業(yè)化生產u 工程動物、工程植物以及基因治療u 改變了特性的工程蛋白質 二、宿主和載體 基因克隆過程中的大多數常規(guī)操作中都使用大腸桿菌作為宿主細胞。 質粒和噬菌體可作為大腸桿菌的克隆載體。質粒、病毒及整個染色體的載體一直被用作外源基因導入其他原核及真核生物體內的工具。 1.環(huán)狀質粒： 染色體外(與染色體相獨立的)2. 許多噬菌體(侵染細菌的病毒)：v 噬菌體：可用來克隆較大的DNA片段，v 噬菌體M13：可以使克隆DNA以單鏈形式被提

20、取出來。v T載體：v 黏粒:質粒入噬菌體雜合體。3.酵母: 酵母質粒載體(酵母游離型質粒，yeast episomal plasmid)，對于植物一種細菌質粒(根癌農桿菌Ti質粒，Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid)4.病毒: 其他真核細胞，常用那些能自然侵染目標物種的病毒作為載體將其DNA維持在染色體外，或者是整合到宿主基因組(例如SV40、桿狀病毒、反轉錄病毒)。 三、亞克隆 是克隆實驗中最簡單的一種，即將已克隆的DNA片段從一載體向另一載體的轉移，這一過程被稱為亞克隆。 亞克隆可用來對較大的克隆片段上較短區(qū)段進行仔細研究，或是將基因轉移到能在特定物

21、種中表達的另一載體上。就大腸桿菌的質粒載體來說，最常見的亞克隆程序可分為以下步驟：含有目標克隆序列的質粒DNA的提取用限制性內切核酸酶將質粒酶切成不連續(xù)的片段經瓊脂糖凝膠電泳分離片段純化目標片段將目標片段連接在一新質粒載體上，形成新的重組分子將連接好的質粒轉入某一大腸桿菌菌株(轉化，transformation)轉化細菌的篩選重組質粒的分析四、DNA文庫由基因組或cDNA的一套隨機克隆片段構成，其中每個片段連在一個單獨的載體分子上，常用來分離未知基因。 基因組文庫是用基因組DNA的隨機片段制備成的。缺點：用基因組文庫來克隆某一基因是一種效率極低的方法，特別是對于龐大的真核生物基因組。用于鑒定未

22、知基因的克隆實驗的DNA有兩個主要來源：Ø 目的物種的基因組DNA。Ø 用來自表達目的基因細胞或組織的mRNA作為來源構建成的文庫即cDNA文庫。經反轉錄將mRNA合成cDNA(DNA拷貝)后，插入載體構建成cDNA文庫。五、篩選文庫1、 通常是用一段與目的基因序列的某一區(qū)段互補或部分互補的放射性或熒光標記的DNA探針，通過雜交來檢測出該基因。若基因的蛋白產物可獲得，則探針可以是從該蛋白產物序列推測出的一段寡核苷酸，或者探針也可以來自另一物種中的某一相關基因。制備探針越來越常用的一種方法是聚合酶鏈反應PCR。2. 另一篩選方法是基于文庫中被克隆的編碼區(qū)表達后，對其蛋白產物進

23、行活性鑒定，或是用特異抗體對其進行鑒定。六、克隆分析含有目的基因的克隆被確定，通過限制性酶切圖譜即用限制性酶切來分析DNA片段，來對其克隆的片段的結構進行更進一步的研究，以至最終對全長片段進行測序。隨后可通過將所得全長序列與數據庫中其他已知序列進行比較分析，確定出該蛋白產物的完整序列。在體外進行DNA克隆與分析要用到許多酶，其中常用酶的特性特列于表G11中，詳細描敘其應用的章節(jié)也已列于其后。 酶用途堿性磷酸酶從雙鏈或單鏈DNA，或RNA的5端移去磷酸基。DNA連接酶(來自噬菌體T4由ATP水解提供能量，將dsDNA的戊糖磷酸骨架的5磷酸與3羥基相結合。待連接的DNA末端必須是相匹配的，即平端與

24、平端，或為互補的黏性末端。DNA聚合酶I由含游離3羥基的引物起始，沿5至3的方向合成與DNA模板互補的DNA鏈。Klenow片段是DNA聚合酶I的缺失5至3外切核酸酶活性的截短部分。外切核酸酶III外切核酸酶從線性DNA的末端依次切除核苷酸。外切核酸酶只從dsDNA的3端切割。綠豆核酸酶降解單鏈核酸，留下完整的雙螺旋區(qū)段。核酸酶S1類似綠豆核酸酶，并且能夠降解對應于互補鏈缺刻對面的單鏈。多核苷酸激酶一個依賴ATP的反應，向雙鏈或單鏈DNARNA的5'-羥基末端添加磷酸基。若使用-32p ATP，則可將DNA標記上放射性同位素。限制酶在識別序列處(通常對稱)切割dsDNA的雙鏈。水解戊糖

25、磷酸骨架，使其一端為5'-磷酸基而另一端為3'羥基，形成平端或“黏”末端(5'或3'凸端)反轉錄酶依賴RNA的DNA聚合酶。由含有游離3羥基的引物起始，沿5'至3'方向合成與RNA模板互補的DNA鏈，需要dNTP。RNase A只降解RNA，而不降解DNA的核酸酶RNase H降解RNA-DNA異源雙鏈中的RNA鏈的核酸酶。T7，T3和SP6 RNA聚合酶分別由相應的噬菌體編碼的專一性RNA聚合酶。每種酶只能識別自身的噬菌體DNA的啟動子，特異地轉錄各自啟動子下游DNA序列。Taq DNA聚合酶來源于嗜熱細菌(Thermusaquatzcus)的

26、DNA聚合酶。最適溫度為72，在90以上仍相當穩(wěn)定。用于PCR。末端轉移酶可將核苷酸加到線性單鏈或雙鏈DNA或RNA的3端。如只用GTP，則僅加上多個G。工具酶聚合酶名 稱活 性主 要 用 途DNA 聚合酶I(全酶）5-3DNA聚合酶活性3-5外切酶5-3外切酶切口平移法標記3末端標記Klenow片段5-3DNA聚合酶活性3-5外切酶末端補平、末端標記cDNA第二鏈的合成T4噬菌體DNA 聚合酶外切核酸酶活性比Klenow片段活性高200倍體外誘變T7噬菌體DNA 聚合酶5-3DNA聚合酶活性3-5外切酶熱穩(wěn)定DNA依賴性的DNA聚合酶耐熱PCR反轉錄酶以RNA為模板合成DNAcDNA的合成末端轉移酶在2價陽離子存在時催化dNTP加于DNA分子的3羥基端cDNA末端加同聚尾末端標記依賴于DNA的RNA 聚合酶以DNA為模板合成RNA合成單鏈RNA做