中藥千里光不同劑量及其配伍后毒副作用的... - 上海中

1、中藥千里光不同劑量及其配伍后毒副作用的觀察張超群 孫莉 孔祥蕾 楊瀅瑤 李倩倩指導(dǎo)老師：方肇勤 盧文麗上海中醫(yī)藥大學(xué)2004級(jí)中醫(yī)臨床七年制、2007級(jí)中醫(yī)，201203 摘要 目的：觀察不同劑量中藥千里光，及其配伍后對(duì)小鼠肝臟可能存在的毒副作用。方法：將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、千里光小劑量組、中劑量組、大劑量組、千里光配伍組及配伍藥組共6組，灌胃7天后檢測(cè)肝臟指數(shù)、肝臟生化指標(biāo)ALT、AST及肝臟形態(tài)學(xué)等指標(biāo)，分別于實(shí)驗(yàn)的1、4、7天檢測(cè)體重。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)中正常對(duì)照組意外死亡小鼠1只、千里光大劑量組意外死亡小鼠2只；與正常對(duì)照組比較，各組體重指數(shù)、肝臟指數(shù)以及生化指標(biāo)AST差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

2、>0.05）；千里光中劑量組及配伍組生化指標(biāo)ALT明顯升高，千里光小劑量組生化指標(biāo)ALT明顯降低（P<0.05）。結(jié)論：大、中、小劑量千里光、千里光配伍后，以及配伍藥物未見(jiàn)顯著的肝臟毒副作用。關(guān)鍵詞 千里光；肝毒性；ALT；AST；病理近年來(lái)，中藥的毒副作用已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)。而一些中藥，如千里光的毒副作用報(bào)道，最早可以追溯到1920。迄今已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了千里光屬所引起嚴(yán)重肝損害并伴有死亡的臨床案例，其死亡率甚至高達(dá)271！千里光在中醫(yī)臨床上處方不是很多，但是以其組方的中成藥品種卻數(shù)量較多。臨床劑量的千里光是否具有肝臟急性損傷的毒副作用、配伍后作用如何？本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察檢測(cè)

3、不同劑量的千里光對(duì)小鼠肝功能和病理的影響等研究，初步明確千里光及配伍后是否具有顯著的毒副作用。1材料與方法1.1 材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，雌性，72只，1924g，清潔級(jí)儀器及設(shè)備養(yǎng)生鍋、電子秤、DK-S22型電子恒溫水浴鍋、722光柵分光度計(jì)、雙面刀片、眼科鑷、組織鑷、眼科剪、解剖剪、染色架、染色缸、廣口瓶、恒溫水浴鍋、生物切片、恒溫箱、電子天平、脫水藍(lán)、顯微鏡、NIKON數(shù)碼相機(jī)藥物與試劑千里光（上海青浦產(chǎn)）、白菊花、石決明、甘草10%福爾馬林、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯、蘇木精、甘油蛋白 、鹽酸酒精、伊紅丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（國(guó)食藥監(jiān)械（試）字2

4、004第3060018號(hào)）、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（國(guó)食藥監(jiān)械（試）字2004第3060020號(hào)） 藥物及其劑量（1）千里光小、中、大劑量組。千里光分別為20g、40g、80g。（2）千里光配伍組。千里光、白菊花、石決明、甘草各20g，合計(jì)80g（相當(dāng)于千里光大劑量的用藥量）。（3）配伍藥組。白菊花、石決明、甘草各26.7g，合計(jì)80g（相當(dāng)于千里光大劑量的用藥量）。 1.2方法生藥鑒定：向我校生藥教研室崔亞君老師請(qǐng)教。動(dòng)物分組及處理將小鼠隨機(jī)分成六組：空白對(duì)照組、千里光小劑量組、千里光中劑量組、千里光大劑量組、千里光配伍組、配伍藥組，每組12只。（1）空白對(duì)照組：第17天，每天次

5、灌胃自來(lái)水0.5ml/只。（2）千里光小劑量組。第17天每天1次灌胃相應(yīng)中藥水煎液0.5ml/只（0.1g生藥）。以人60kg，30g/日，及小鼠體重20g計(jì)，為成人公斤體重的10倍。（3）千里光中劑量組。第17天每天1次灌胃相應(yīng)中藥水煎液0.5ml/只（0.2g生藥）。為成人公斤體重的20倍。（4）千里光大劑量組。第17天每天1次灌胃相應(yīng)中藥水煎液0.5ml/只（0.4g生藥）。為成人公斤體重的40倍。（5）千里光配伍組。第17天每天1次灌胃相應(yīng)中藥水煎液0.5ml/只（總藥量0.4g生藥）。（6）配伍藥組。第17天每天1次灌胃相應(yīng)中藥水煎液0.5ml/只（總藥量0.4g生藥）。指標(biāo)觀測(cè)（1

6、）一般情況 包括第1、4、7天動(dòng)物體重、死亡情況等等。（2）生化指標(biāo) 最后一次給藥后禁食16小時(shí)，眼球采血收集和分離小鼠血清，測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）。（3）肝臟指數(shù) 第8天取小鼠完整肝臟拍照、稱(chēng)重，計(jì)算肝臟指數(shù)。（4）肝臟病理切片觀察 病理切片制作方法（1）固定與修塊取小鼠肝臟塊投入10甲醛溶液，固定適當(dāng)時(shí)間后予以修快成4mm³大小方形，繼續(xù)固定約24h，入75乙醇。（2）脫水與透明75乙醇過(guò)夜85乙醇60min 95乙醇（）30min95乙醇（）30min100乙醇（）30min 100乙醇（）30min 1/2二甲苯（乙醇與二甲苯等體積）20

7、min 二甲苯（）20min 二甲苯（）20min（3）浸蠟、包埋與修塊浸蠟： 60恒溫箱放置120min。包埋：采用紙盒。包埋時(shí)將60的石蠟倒入紙盒內(nèi)，然后用小鑷子將各組織塊按一定的順序排列好，使切面朝下。修蠟塊：待紙盒內(nèi)蠟?zāi)毯蟆⑾瀴K取出，用刀片將其修成梯形，組織塊與蠟塊邊緣之間的距離不得小于2mm。（4）切片切片厚約5m，將切片在50左右水浴中展開(kāi)。用涂有甘油蛋白的載玻片從水浴中撈取切片，每個(gè)組織塊撈片2張。放入37烘箱中過(guò)夜。過(guò)夜后，將載玻片置于玻片架上，預(yù)備染色。（5）染色二甲苯（）15min二甲苯（）15min100乙醇2min95乙醇（）1min95乙醇（）1min75乙醇2m

8、in蒸餾水浸洗1min蘇木精30s自來(lái)水沖洗1min。伊紅（著色即可）蒸餾水浸洗 1min75乙醇 2min95乙醇（）1min95乙醇（）1min100乙醇2min二甲苯（）2min二甲苯（）35min中性樹(shù)膠封片 數(shù)據(jù)處理方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1生藥鑒定結(jié)果經(jīng)生藥教研室崔亞君老師鑒定，確認(rèn)所購(gòu)中藥千里光飲片為菊科植物千里光。2.2 一般情況實(shí)驗(yàn)中，正常組意外死亡1只，千里光大劑量組意外死亡2只在體重方面，與正常對(duì)照組比較，3個(gè)檢測(cè)點(diǎn)各組別體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。提示各組藥物對(duì)小鼠體重沒(méi)有顯著的影

9、響。見(jiàn)表1和圖1：表1 各組體重變化及比較（±S，g）組別1d4d7d正常組（n=11）21.1 ±1.225.8 ±2.526.1 ±3.2千里光小劑量組（n=13）21.4 ±1.426.3 ±1.825.8 ±2.3千里光中劑量組（n=13）21.3 ±1.526.1 ±1.928.0 ±1.8千里光大劑量組（n=11）21.7 ±1.426.2 ±2.326.2 ±3.5千里光配伍組（n=12）21.5 ±1.426.2 ±1.526.6

10、 ±2.5配伍藥組（n=12）21.3 ±1.726.6 ±2.027.3 ±2.6圖1 各組小鼠體重變化* 圖中小、中、大劑量分別代表千里光小、中、大劑量組，配伍組代表千里光配伍組，配藥組代表配伍藥組。下同。2.3 肝臟指數(shù)與正常組比較，各組肝臟指數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。提示各組藥物對(duì)小鼠肝臟沒(méi)有顯著的影響。見(jiàn)表2和圖2：表2 各組肝臟指數(shù)（±S）組別肝臟指數(shù)正常組（n=11）0.054 ±0.005千里光小劑量組（n=13）0.057 ±0.006千里光中劑量組（n=13）0.053 ±0.00

11、5千里光大劑量組（n=11）0.058 ±0.004千里光配伍組（n=12）0.053 ±0.008配伍藥組（n=12）0.059 ±0.009圖2 各組小鼠肝臟指數(shù)2.4 肝臟生化指標(biāo)表3 各組生化指標(biāo)ALT、AST結(jié)果（±S）組別ALT（U/L）AST（U/L）正常組（n=11）16.8 ±4.28.3 ±4.0千里光小劑量組（n=13）9.8 ±3.0*8.9 ±4.7千里光中劑量組（n=13）29.9 ±6.2*6.6 ±4.2千里光大劑量組（n=11）16.6 ±4.310.

12、6±2.5千里光配伍組（n=12）25.5 ±6.8*8.3 ±4.4配伍藥組（n=12）19.9 ±7.59.7 ±4.5* 與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）圖3 各組肝臟生化指標(biāo)ALT結(jié)果 圖4 各組肝臟生化指標(biāo)AST結(jié)果由上表3及圖3、圖4可知，ALT中劑量組、小劑量組、配伍組與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），而AST各組與正常組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。但是，與體重和肝臟指數(shù)比較，之間沒(méi)有相關(guān)性。提示其差異可能與試劑盒檢測(cè)操作誤差有關(guān)。2.5肝臟病理學(xué)結(jié)果 圖5 正常組肝臟（HE 

13、5;400） 圖6 千里光小劑量組肝臟（HE ×400） 圖7 千里光中劑量組肝臟（HE ×400） 圖8 千里光大劑量組肝臟（HE ×400） 圖9 千里光配伍組肝臟（HE ×400） 圖10 配伍藥組肝臟（HE ×400）各組肝臟從肉眼上觀察，色澤未見(jiàn)明顯變化。組織形態(tài)學(xué)方面，從病理切片圖5圖10可知，正常對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)正常，排列有序，可見(jiàn)單核或雙核，肝竇可見(jiàn)肝巨噬細(xì)胞；千里光小劑量組、中劑量組肝細(xì)胞排列略顯疏松和不整，千里光配伍組似乎無(wú)明顯變化；而千里光大劑量組和配伍藥組內(nèi)，部分個(gè)體出現(xiàn)肝細(xì)胞排列疏松，體積增大，核仍局中，肝竇結(jié)構(gòu)受壓，

14、部分個(gè)體尚可?？傮w而言，千里光大劑量組和配伍藥物肝臟無(wú)明顯的炎性及壞死等病理變化。3分析與討論3.1 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析關(guān)于千里光的毒性，千里光性味苦、寒，歸肝、腎二經(jīng)（1977版中國(guó)藥典（一部），中藥大辭典）。本草拾遺稱(chēng)其：“味苦，平，小毒?！苯陙?lái)發(fā)現(xiàn)，千里光2屬中有多種植物都含有肝毒吡咯里西啶類(lèi)生物堿（Hepatotoxic Pyrrolizidine Alkaloids，PA），對(duì)人及家畜肝臟有毒性，可引起肝硬化及蔓延性肝靜脈內(nèi)膜炎，長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致肝靜脈閉塞，出現(xiàn)黃疸和腹水。鑒于文獻(xiàn)報(bào)道，該藥物毒性作用主要在肝臟，因而本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)觀察肝臟的毒性作用。目前血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和

15、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）是臨床應(yīng)用最廣、診斷效率最高的血清酶3,4。當(dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)，肝細(xì)胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)的ALT與AST釋放入血漿，致使血清ALT與AST的酶活性升高5。故本實(shí)驗(yàn)采用ALT和AST作為檢測(cè)肝功能的生化指標(biāo)。同步的觀察了肝臟的病理和肝臟指數(shù)。中藥復(fù)方配伍是中藥的特色，中藥復(fù)方配伍的目的之一是減毒。研究藥物配伍后各藥味之間、主要成分之間的相互作用，探討配伍與毒性的關(guān)系，尋找能夠有效地制約毒性的配伍條件，對(duì)于臨床安全用藥具有指導(dǎo)意義。故我們選用千里光的常見(jiàn)配伍：菊花、石決明和甘草，主要用于清熱解毒，清肝明目。想通過(guò)試驗(yàn)觀察我國(guó)有關(guān)千里光的肝損害現(xiàn)象較少是否與千里光的復(fù)方配伍

16、有關(guān)。關(guān)于藥物的劑量。本實(shí)驗(yàn)大劑量千里光，按小鼠用藥為成人公斤體重10倍計(jì)，相當(dāng)于成人用藥120克。遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了一般成藥配伍所采用的劑量，即使臨床用藥，也很少會(huì)用至30克。在如此大的劑量下，未見(jiàn)到明顯的毒副作用，提示一些報(bào)道的千里光的毒性，可能與其品種有關(guān)，而不是本實(shí)驗(yàn)采用產(chǎn)自上海地區(qū)的品種。對(duì)照用復(fù)方，在總劑量上，與千里光大劑量相似，以觀察可能出現(xiàn)的毒副作用，是否與總用藥量有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，各組體重差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），肝臟指數(shù)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），以及生化指標(biāo)AST差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在生化指標(biāo)ALT方面，與正常對(duì)照組相比，千里光小劑量組ALT下降，千里光中劑量組和千里光配伍組（其中千里光為小劑量用量）ALT升高，其改變不存在與千里光的量效關(guān)系；而病理結(jié)果顯示，千里光大劑量組和配伍藥物肝臟出現(xiàn)一定的病理改變，與ALT升高的改變也不存在相關(guān)性。因此，綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考慮到生化指標(biāo)與病理形態(tài)學(xué)指標(biāo)的不一致性，提示這些改變主要系實(shí)