丹參酮IIA對血管性癡呆小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制初探

1、丹參酮IIA對血管性癡呆小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制初探 【摘要】 目的初步探討丹參酮主要成分丹參酮IIA對血管性癡呆小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。方法雙側(cè)頸總動脈反復(fù)缺血/再灌注合并尾部放血降壓方法建立血管性癡呆小鼠模型。動物隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血模型組、丹參酮IIA低、高劑量（4 mg/kg.d，8 mg/kg.d ） 治療 組。手術(shù)20 d后開始運用Morris水迷宮觀測各組的學(xué)習(xí)記憶功能，然后斷頭取腦，分離皮層和海馬，分光光度法測定丙二醛(malondialdehyde, MDA) 含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性

2、的變化；運用高效液相色譜法測定不同組小鼠皮層和海馬組織內(nèi)谷氨酸和-氨基丁酸的含量。結(jié)果丹參酮IIA可以改善血管性癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能； 丹參酮IIA可減少MDA的生成, 增加SOD、GSH-Px活性; 小鼠手術(shù)20 d后，小鼠皮層和海馬組織谷氨酸和-氨基丁酸的含量減低，丹參酮IIA可增加血管性癡呆小鼠皮層和海馬組織內(nèi)谷氨酸和-氨基丁酸的含量。結(jié)論丹參酮IIA在血管性癡呆小鼠可發(fā)揮抗氧化作用并調(diào)節(jié)興奮性氨基酸和抑制性氨基酸的含量。 【關(guān)鍵詞】 丹參酮IIA; 谷氨酸; -氨基丁酸； 血管性癡呆Abstract：ObjectiveTo investigate the underlying neu

3、roprotective mechanisms of Tanshinone IIA (TSA) on mouse cerebral ischemia in vivo.MethodsMale mice were divided into four groups sham-operated, ischemic and treated groups (lower dose and higher dose). The mice were subjected for ischemia-reperfusion three times on bilateral common carotid arteries

4、 by knots to establish models of vascular dementia. After ischemia-reperfusion impairment, TSA (4 mg/kg.d, 8 mg/kg.d) was administered by i.p. for 20 days in treated group. 1. We used morris water maze to investigate the learning and memory； 2. Levels of malondialdehyde (MDA), activity of superoxide

5、 dismetase (SOD) and glutathione peroxidase (GPX) in brain tissue were detected by spectrophotometer; 3. High-performance liquid chromatography(HPLC) with fluorescence detection was applied to measure the contents of glutamate and gamma-aminobutyric acid (GABA) in cortex and hippocampus.ResultsTSA c

6、an improve learning and memory deficits in vascular dementia; An elevation of SOD and GPX activity and decrease of MDA level were shown in TSA treated group after brain ischemia; Decreased glutamate and gamma-aminobutyric acid induced by chronic brain ischemia were markedly inhibited by TSA pretreat

7、ment. ConclusionThe neuroprotective effect of TSA are partly due to its functions as follow: anti-free radical injury; regulating the content of glutamate and gamma-aminobutyric acid.Key words： Tanshinone IIA; Glutamate; GABA; Vascular dementia血管性癡呆(vascular dementia,VD)是指由各種腦血管疾病引起的腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害

8、綜合征,為一種慢性進(jìn)行性疾病,其病理改變主要是以廣泛性腦動脈硬化和腦梗塞為特征, 隨著當(dāng)今世界人口老齡化日益嚴(yán)重,其發(fā)病率日趨增高1。我國中藥資源豐富, 從祖國傳統(tǒng)中草藥中尋找有效成分治療血管性癡呆不失為一條可以探索的道路, 研究者們已經(jīng)在這方面做出了一些卓有成效的。丹參是我國傳統(tǒng)中藥, 丹參酮是丹參脂溶性成分的代表物質(zhì), 具有清除氧自由基、改善微循環(huán)、鈣拮抗、抑制中性粒細(xì)胞的游走、抗癌及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等廣泛的藥理作用, 現(xiàn)已成為研究的2，3。目前已發(fā)現(xiàn)它有十多種單體, 其中丹參酮IIA(TSA)的研究最多, 已有報道指出丹參酮IIA能顯著降低心肌缺血再灌注后組織中MDA的生成和減少心肌肌酸

9、激酶的釋放, 認(rèn)為它直接清除氧自由基是防治家兔心肌缺血再灌注損傷的機(jī)理之一4, 5。另有報道丹參酮對中風(fēng)模型大鼠有一定的神經(jīng)保護(hù)作用3，但有關(guān)其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制目前仍然不甚清楚，相關(guān)研究工作開展較少, 本課題對這方面進(jìn)行了初步的探索, 利用小鼠血管性癡呆模型觀察丹參酮IIA對其是否有治療作用, 并探討丹參酮IIA對血管性癡呆小鼠是否有抗氧化作用以及對皮層和海馬組織興奮性氨基酸和抑制性氨基酸的影響。 1 材料與儀器 丹參酮IIA（紅色結(jié)晶粉末， 純度98），購于西安冠宇生物技術(shù)有限公司；谷氨酸和-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品均購自 Sigma 公司(St. Louis, MO, USA); -巰基乙醇購自 AMR

10、ESCO Inc. (Ohio, USA); 鄰苯二甲醛(O-phthaldialdehyde, OPA) 購自Sigma (St. Louis, MO, USA); 甲醇(色譜純)購自Fisher Scientific (USA); 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硼酸鈉均為國產(chǎn)分析純，實驗前用四蒸水配成所需濃度；MDA, SOD,GSH-Px以及蛋白定量試劑盒（考馬斯亮蘭法）購自南京建成生物 工程公司（南京， 中國 ）。 VARIAN Prostar高效液相色譜儀；VARIAN 363型熒光檢測器；依利特ODS C18反相色譜柱(4.6 mm250 mm, 5 m)。 清潔級雄性昆明種小鼠, 體質(zhì)

11、量1827 g, 由華中科技大學(xué)同濟(jì)院實驗動物中心提供。 2 方法 2.1 動物分組和模型制備方法將實驗小鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組；血管性癡呆組；丹參酮IIA低劑量治療組；丹參酮A高劑量治療組。癡呆動物模型的制備：將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后, 參照 文獻(xiàn) 6行雙側(cè)頸總動脈反復(fù)缺血/再灌注合并尾部放血降壓方法建立VD小鼠模型。術(shù)前 12 h 禁食不禁水。用水合氯醛以350 mg/kg的濃度腹腔注射麻醉后, 將小鼠仰臥固定于手術(shù)臺上。消毒后沿頸正中切口, 分離雙側(cè)頸總動脈 （CCA）, 絲線結(jié)扎阻斷 CCA, 20 min后再灌注 10 min, 如此反復(fù)兩次 , 第 1次缺血時在距小鼠尾尖 1 c

12、m處剪斷放血約 0.3 ml。術(shù)中保持動物肛溫在 （37 0.5） 。其中假手術(shù)組只分離CCA, 套絲扣, 但不阻斷血流, 尾部不放血, 觀察時間與其他組相同。丹參酮IIA治療組，術(shù)后第2天開始腹腔注射給藥，給予丹參酮IIA 4 mg/kg（低劑量組）或8 mg/kg（高劑量組）, 共20 d。2.2 學(xué)習(xí)記憶功能測定利用Morris水迷宮對各組動物學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測, Morris水迷宮實驗系統(tǒng)由中國醫(yī)學(xué) 科學(xué) 院藥物研究所研制?；痉椒▍⒄瘴墨I(xiàn)7。各組均于造模30 d后開始進(jìn)行，每組取710只動物進(jìn)行測試。數(shù)據(jù)由水迷宮實驗系統(tǒng)獲得, 實驗數(shù)據(jù)以 s表示, 各組數(shù)據(jù)用SPSS 12.0軟件

13、處理, 采用重復(fù)測量方差分析結(jié)合Tukeys 檢驗, P 0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。2.3 MDA含量，SOD及GPX活性的測定方法操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。2.4 高效液相色譜法測定海馬組織內(nèi)氨基酸含量2.5 統(tǒng)計分析采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以 s表示。多組間均數(shù)比較采用one-way analysis of variance (ANOVA)及Fisher LSD test (Least-significant difference)。P0.05 有統(tǒng)計學(xué)差異。 3 結(jié)果 3.1 丹參酮IIA對血管性癡呆小鼠認(rèn)知功能障礙的作用3.2 丹參酮IIA對血管性癡呆小鼠MDA含

14、量、SOD和GSH-Px的影響與假手術(shù)組相比，缺血性腦損傷30 d后，小鼠皮層和海馬MDA含量均顯著增加（P0.01），丹參酮A明顯降低缺血性腦損傷后MDA的產(chǎn)生（圖3）,而且丹參酮IIA作用呈劑量依賴性。 與假手術(shù)組相比，缺血性腦損傷30 d后，小鼠皮層和海馬GSH-Px活性均顯著降低（P0.05），丹參酮IIA明顯增加缺血性腦損傷后GSH-Px的活性（4）, 而且丹參酮IIA作用呈劑量依賴性。與假手術(shù)組相比，缺血性腦損傷30 d后，小鼠皮層和海馬SOD活性均顯著降低（P0.05），丹參酮IIA明顯增加缺血性腦損傷后SOD的活性（圖5）, 而且丹參酮IIA作用呈劑量依賴性。3.3 丹參酮II

15、A對血管性癡呆小鼠皮層和海馬谷氨酸和-氨基丁酸含量的影響如圖6所示，血管性癡呆小鼠皮層谷氨酸和-氨基丁酸的含量均明顯低于假手術(shù)組（P0.05）；而丹參酮IIA組小鼠谷氨酸和-氨基丁酸含量與血管性癡呆組比較，均明顯增加，具有學(xué)意義（P0.05）。如圖7所示，血管性癡呆小鼠海馬谷氨酸和-氨基丁酸的含量均明顯低于假手術(shù)組（P0.05）；而丹參酮IIA組小鼠谷氨酸和-氨基丁酸含量與血管性癡呆組比較，均明顯增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 4 討論 本實驗行為學(xué)結(jié)果顯示, 術(shù)后30 d模型組出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶功能障礙, 表現(xiàn)為逃離潛伏期的延長和在目標(biāo)象限中游泳時間的縮短, 而丹參酮IIA 治療 組則

16、學(xué)習(xí)記憶成績明顯好于模型組, 表明丹參酮IIA能改善學(xué)習(xí)記憶能力。大量研究表明, 氧化應(yīng)激損傷在多種神經(jīng)退行性病變包括神經(jīng)元缺血性損傷中亦起關(guān)鍵作用8。腦缺血和再灌流期間產(chǎn)生大量的自由基, 使MDA含量升高, 并消耗SOD而使其活性下降, 而且自由基的大量產(chǎn)生是遲發(fā)性神經(jīng)元損害的主要原因。一方面由于反復(fù)腦缺血再灌流, 使缺血組織不斷得到大量新的氧供, 結(jié)果大量激活黃嘌呤氧化酶, 產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基并廣泛攻擊富含不飽和脂肪酸雙鍵的神經(jīng)元膜和微血管, 引發(fā)脂質(zhì)過氧化“瀑布狀”連鎖反應(yīng)和微循環(huán)障礙,致使大量神經(jīng)元損害；另一方面又使缺血期間因氧耗竭而停滯的烷自由基向脂質(zhì)過氧化物自由基轉(zhuǎn)化得以延續(xù)

17、, 造成新的惡性循環(huán)。此時, 體內(nèi)抗氧化劑被自由基大量消耗, 而反應(yīng)所產(chǎn)生的自由基又超過了體內(nèi)清除能力, 缺血組織中自由基急速蓄積, 必然進(jìn)一步攻擊其他細(xì)胞的生物膜結(jié)構(gòu), 造成更多的細(xì)胞壞死,半暗帶區(qū)進(jìn)一步惡化, 梗塞范圍迅速擴(kuò)展9。已有報道指出丹參酮IIA在心肌缺血再灌注后組織中表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化作用2，本實驗亦表明丹參酮IIA降低缺血小鼠腦內(nèi)MDA含量，增加GSH-Px和SOD活性，對慢性腦缺血動物表現(xiàn)出良好的抗氧化作用，故推測丹參酮IIA的抗氧化作用可能是其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。 目前均認(rèn)為, 缺血性腦損傷與興奮性氨基酸的毒性作用有關(guān), 較多報道均指出腦缺血急性期神經(jīng)細(xì)胞外液主要的

18、興奮性氨基酸谷氨酸水平都有較明顯升高, 但隨著缺血時間的延長, 其水平逐漸恢復(fù)到正常水平10。關(guān)于較長時間的慢性低灌注導(dǎo)致的小鼠不完全性腦缺血后腦組織內(nèi)氨基酸水平如何變化目前國外報道并不多見, 國內(nèi)較多報道均認(rèn)為血管性癡呆模型小鼠腦組織內(nèi)興奮性氨基酸水平升高11。但本實驗發(fā)現(xiàn)血管性癡呆模型小鼠皮層和海馬組織內(nèi)谷氨酸和-氨基丁酸含量均較假手術(shù)組小鼠腦內(nèi)氨基酸含量低, 且有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05), 而丹參酮IIA治療組的小鼠腦內(nèi)谷氨酸和-氨基丁酸含量則均高于血管性癡呆模型組。血管性癡呆模型小鼠谷氨酸和-氨基丁酸含量降低是否可以這樣理解:缺血初期, 由于能量障礙, 大量興奮性氨基酸釋放, 觸發(fā)興奮

19、性毒性作用, 而較長時間大腦供血不足后, 腦細(xì)胞代謝障礙, 使各種氨基酸吸收和合成障礙, 故而谷氨酸和-氨基丁酸含量均減少低于正常水平。本實驗結(jié)果表明, 長期慢性腦缺血可使小鼠腦組織內(nèi)谷氨酸和-氨基丁酸含量均降低, 而谷氨酸和-氨基丁酸為中樞神經(jīng)活動必需氨基酸，丹參酮A通過提高腦組織內(nèi)谷氨酸和-氨基丁酸含量, 改善血管性癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能, 加強(qiáng)神經(jīng)電生理活動, 這一作用對血管性癡呆病人的治療可能有一定益處。總之，丹參酮IIA在血管性癡呆模型小鼠可改善其學(xué)習(xí)記憶，表現(xiàn)出較強(qiáng)抗氧化作用，同時能夠調(diào)節(jié)興奮性氨基酸和抑制性氨基酸的含量。除了上述兩種作用機(jī)制之外，筆者推測亦有可能有其他機(jī)制參與

20、其神經(jīng)保護(hù)作用，尚需要進(jìn)一步的研究，從而闡明丹參酮的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為上更好的利用丹參酮治療腦缺血性病人提供理論依據(jù)?！?參考 文獻(xiàn) 】 1Myron DG. Neuroprotection for ischemicstroke: Past, present and futureJ. Neuropharmacology, 2008,55: 363.2Han JY, Fan JY, Horie Y, et al. Ameliorating effects of compounds derived from Salvia miltiorrhiza root extract on microcir

21、culatory disturbance and target organ injury by ischemia and reperfusionJ. Pharmacol Ther. 2008,117(2): 280.3Yu XY, Lin SG, Zhou ZW, et al. Tanshinone IIB, a primary active constituent from Salvia miltiorrhza, exhibits neuro-protective activity in experimentally stroked rats J. Neurosci Lett. 2007, 417(3): 261.4鐘先陽, 羅仁, 魏 華，等. 丹參酮IIA對大鼠出血性休克再灌注腎損傷的保護(hù)作用 J. 中國 中西醫(yī)結(jié)