下呼吸道細菌學(xué)檢驗操作規(guī)范(討論稿)

1、下呼吸道細菌學(xué)檢驗操作規(guī)范（討論稿）鐘 橋蘇州市立醫(yī)院本部前 言 口咽部正常菌群 常見的肺部感染機制： 吸入性：定植菌吸入肺部 呼入性：呼吸機、氣溶膠等 血播性：見于靜脈吸毒或血透患者分析前下呼吸道標(biāo)本檢驗 標(biāo)本采集咳痰誘導(dǎo)痰（高滲鹽水誘導(dǎo)3%NaCl 20-30ml）氣管和內(nèi)鏡吸出物（氣管插管24h，就有定植菌，僅有臨床癥狀時，否則切勿培養(yǎng)氣管吸出物）氣管鏡標(biāo)本（由肺科醫(yī)生或受訓(xùn)后醫(yī)生采集）支氣管肺泡灌洗液（BAL）支氣管灌洗液，保護性毛刷標(biāo)本（PSB），支氣管穿刺活檢標(biāo)本支氣管灌洗液-BAL-PSB-穿刺活檢標(biāo)本標(biāo)本運送無菌杯條碼12h內(nèi)送檢 超時，苛養(yǎng)菌如肺炎鏈球菌減少，口咽部正常菌群將

2、過度生長標(biāo)本拒收規(guī)則 不接受48h內(nèi)重復(fù)送檢培養(yǎng)的標(biāo)本 拒收以下標(biāo)本申請做下呼吸道感染診斷：u24h內(nèi)采集的痰標(biāo)本u口水u誘導(dǎo)痰u鼻沖洗液和分泌物或鼻孔拭子 標(biāo)本延遲2h且未冷藏，應(yīng)報告中注明標(biāo)本延誤送檢，可能對培養(yǎng)結(jié)果造成影響u咽部標(biāo)本u厭氧培養(yǎng)標(biāo)本u支氣管刷培養(yǎng)，只能用保護性毛刷u支氣管灌洗液，氣道分泌物。污染痰標(biāo)本和氣管內(nèi)標(biāo)本革蘭染色拒收條件的評價（痰涂片 2040/LP；氣管吸出物低倍鏡和油鏡下都要檢測） 不合格標(biāo)本有：不合格標(biāo)本有：痰標(biāo)本 = 10個上皮細胞/低倍視野 但如果WBC數(shù)是上皮細胞數(shù)的10倍，單一形態(tài)的細菌量達到3+至4+，可接受標(biāo)本進行培養(yǎng)成年人支氣管吸出物：10SEC

3、s/LPF或未見細菌患兒支氣管吸出物：未見細菌 如WBC 4+，并可見纖維細胞，但未見細菌，最好重新涂片做吖啶橙染色，用熒光顯微鏡觀察彈性纖維上是否有細菌，假單胞菌和嗜血桿菌可能會在這類涂片中漏檢； 還可以見軍團菌，此類感染中常缺少白細胞。 門診接受到大量膿性標(biāo)本，應(yīng)立即接種，不必等待涂片結(jié)果。 拒收培養(yǎng)標(biāo)本報告方式拒收培養(yǎng)標(biāo)本報告方式： “涂片所見：每低倍鏡視野含10個扁平上皮細胞，提示標(biāo)本質(zhì)量差，不做培養(yǎng)；如果有臨床指征請重新采集標(biāo)本” “涂片檢查40個視野，未見細菌，不做培養(yǎng)；如果臨床指征請與實驗室聯(lián)系” 不能拒收標(biāo)本 送檢軍團菌培養(yǎng)、抗酸染色痰標(biāo)本、氣管吸出物和來自囊性纖維化患者的痰標(biāo)

4、本分析中下呼吸道標(biāo)本檢驗接種接種 II級生物安全柜內(nèi)進行盡快處理挑取最膿或血色最淺標(biāo)本支氣管鏡標(biāo)本，做細菌定量培養(yǎng)的BAL和或PSB標(biāo)本切勿離心。涂片，革蘭染色標(biāo)本接種血平板、巧克力平板和麥康凱（或中國藍/伊紅美蘭）以下步驟可選擇一項或多項： 在接種后的巧克力平板上貼桿菌肽紙片（10IU），用于抑制上呼吸道微生物菌群，提高流血嗜血桿菌檢出率 用金葡ATCC25923點種接種后的血平板，便于直接觀察嗜血桿菌的衛(wèi)星現(xiàn)象 血平板的第二個1/4區(qū)貼奧普托辛(OP)紙片，可在原始平板上直接檢測抑制肺炎鏈球菌的生長。不推薦常規(guī)使用，如有大量社區(qū)感染肺炎患者標(biāo)本時可考慮使用培養(yǎng)3537、5%CO2條件培養(yǎng)4

5、8h，最好至72h；侵入性方法采集的肺標(biāo)本，培養(yǎng)延長至4天直接試驗革蘭染色 注明細胞、細菌量以及評價結(jié)果 見表3膽汁溶菌試驗 革蘭陽性雙球菌表3 痰涂片革蘭染色結(jié)果解釋指征解釋每個低倍鏡視野發(fā)現(xiàn)10個鱗狀上皮細胞標(biāo)本含有唾液和上呼吸道分泌物，報告“10個扁平上皮細胞/低倍視野，提示標(biāo)本被唾液污染，將不再進行培養(yǎng)”每低倍鏡視野發(fā)現(xiàn)10個扁平上皮細胞，大量多形核白細胞，存在肺泡巨噬細胞和柱狀上皮細胞提示是一個良好的深部痰標(biāo)本大量多形核白細胞胞內(nèi)細菌彈性蛋白或膠原纖維提示感染Curschmanns螺旋纖維提示感染淀粉樣小體壞死白細胞提示感染粉色絮狀物提示呼吸道疾病治療產(chǎn)生的霧狀高滲水Charcot-

6、Leyden結(jié)晶提示過敏性肺曲霉病大量多形核白細胞，主要見革蘭陽性球菌成對或成短鏈排列可疑肺炎鏈球菌。電話通知臨床醫(yī)生指征解釋大量多形核白細胞，主要見革蘭陽性球菌成堆排列可疑金黃色葡萄球菌。電話通知臨床醫(yī)生大量多形核白細胞，主要見革蘭陰性雙球菌可疑卡他莫拉局限性肺炎菌。電話通知臨床醫(yī)生大量多形核白細胞，主要見小的革蘭陰性球桿菌可疑流感嗜血桿菌。電話通知臨床醫(yī)生大量多形核白細胞，主要見大而胖的革蘭陰性桿菌可疑克雷伯菌或其他腸桿菌科菌引起的肺炎大量多形核白細胞，大量小的革蘭陰性桿菌，球桿菌，革蘭陽性球菌成鏈排列以及其他不同形態(tài)的細菌提示吸入性肺炎。這需要在報告中特別提示，因為培養(yǎng)結(jié)果會顯示正常菌叢

7、生長。電話通知臨床醫(yī)生出芽酵母樣孢子和假菌絲通常提示鵝口瘡或上呼吸道酵母菌感染，不是肺炎，僅當(dāng)其為主要所見菌時報告其他異常結(jié)構(gòu)，如真菌，分枝的革蘭陽性絲狀桿菌或奇特形狀的細菌（可能抗生素治療的結(jié)果）請高級醫(yī)師進行確認，可能需要補充實驗如改良的抗酸染色培養(yǎng)結(jié)果檢查觀察24h后平板繼續(xù)培養(yǎng)平板2448h，為檢出霉菌、慢生長菌、苛養(yǎng)的革蘭陰性桿菌如博德特菌屬革蘭染色結(jié)果解釋培養(yǎng)結(jié)果l炎性細胞和細菌來決定對培養(yǎng)物下一步處理l如培養(yǎng)與涂片不符，重新讀片l按照表4報告l鑒定以下有臨床意義的可疑致病菌，排除正常菌群常見呼吸道重要致病菌鏈球菌苛養(yǎng)革蘭陰性菌革蘭陰性雙球菌革蘭陰性桿菌葡萄球菌革蘭陽性桿菌鏈球菌鏈

8、球菌Beta-溶血、觸酶陰性呈鏈狀或成對排列的球菌l化膿鏈球菌（PYR+）任何數(shù)量都要報告l患兒標(biāo)本患兒標(biāo)本檢查有小溶血環(huán)并鑒定B群-溶血鏈球菌，任何數(shù)量都要報告l優(yōu)勢菌時，有意義數(shù)量的Beta-溶血鏈球菌l不要報告不要報告小菌落的beta-溶血鏈球菌或F群鏈球菌，因為這些菌是上呼吸道正常菌群鏈球菌鏈球菌Alpha-溶血鏈球菌lOptochin敏感實驗l膽汁溶菌實驗（聯(lián)合上述兩個實驗進行鑒定）藥敏實驗，貼OP紙片確認純度以檢查藥敏結(jié)果是否有污染苛養(yǎng)革蘭陰性桿菌苛養(yǎng)革蘭陰性桿菌流感嗜血桿菌，衛(wèi)星現(xiàn)象，ALA實驗確認鑒定并作beta-內(nèi)酰胺酶試驗。百日咳博德特菌 觸酶和尿素酶陽性，培養(yǎng)48h出現(xiàn)肉

9、眼可見菌落巴斯德菌 吲哚和氧化酶陽性，動物口腔正常菌群侵蝕艾肯菌 上呼吸道正常菌群，無需鑒定革蘭陰性雙球菌革蘭陰性雙球菌卡他莫拉菌 G-雙球菌，氧化酶陽性，血平板上可推動，丁酸鹽試驗陽性淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌？ 需檢驗并報告，不需做藥敏試驗u當(dāng)培養(yǎng)達到有意義數(shù)量時，即使不是優(yōu)勢菌，當(dāng)培養(yǎng)達到有意義數(shù)量時，即使不是優(yōu)勢菌，也報告也報告（表（表4 4）在麥康凱或伊紅美蘭平板生長良好的革蘭陰性桿菌在麥康凱或伊紅美蘭平板生長良好的革蘭陰性桿菌革蘭陰性桿菌 鑒定和藥敏試驗對于住院患者，不管是否有其他病原菌，檢查有意義數(shù)量的銅綠假單胞菌、不動桿菌、博克霍爾德菌和嗜麥芽菌u囊性纖維化患者標(biāo)本有特殊要求囊性

10、纖維化患者標(biāo)本操作規(guī)范菌名鑒定特殊處理絲狀真菌任何數(shù)量鑒定到種水平腸桿菌科優(yōu)勢菌做藥敏實驗金黃色葡萄球菌任何數(shù)量做藥敏實驗，做苯唑西林篩選流感嗜血桿菌優(yōu)勢菌做beta-內(nèi)酰胺實驗肺炎鏈球菌優(yōu)勢菌用苯唑西林紙片做青霉素耐藥篩選。若需要做青霉素E-test銅綠假單胞菌，洋蔥克雷伯，其他非發(fā)酵菌任何數(shù)量做藥敏實驗快速生長分枝桿菌任何數(shù)量鑒定到種水平葡萄球菌葡萄球菌痰涂片顯示有優(yōu)勢的呈堆球菌并與白細胞相關(guān)，沒有其他致病菌時，鑒定有意義菌量的金黃色葡萄球菌住院患者，鑒定并作苯唑西林耐藥僅當(dāng)菌量達到90%純培養(yǎng)時，鑒定凝固酶陰性葡萄球菌，無需鑒定到種水平，無需做藥敏腸球菌腸球菌不要報告腸球菌，除非達到90

11、%純培養(yǎng) 很多革蘭陽性球菌都是呼吸道正常菌群革蘭陽性桿菌革蘭陽性桿菌排除任何數(shù)量來自免疫抑制患者的奴卡菌和馬紅球菌（粘液樣并尿素酶陽性） 馬、豬等動物致病菌，可條件致病，可以導(dǎo)致免疫抑制患者的肺炎大芽孢革蘭陽性菌，則需排除炭疽芽孢桿菌和臘樣芽孢桿菌快速尿素酶陽性（假白喉棒狀桿菌），或標(biāo)本來自ICU插管患者時，鑒定大量優(yōu)勢的棒狀桿菌其他革蘭陽性桿菌不會引起肺炎，無需鑒定其他革蘭陽性桿菌不會引起肺炎，無需鑒定霉菌霉菌念珠菌不能引起肺炎，除非腫瘤患者、肺移植患者或新生兒。酵母菌是口腔正常菌群。如果如果涂片時見到細菌但培養(yǎng)不生長，擴大培養(yǎng)，可能存在軍團菌、百日咳博德特菌和分枝桿菌。表4 下呼吸道培養(yǎng)致

12、病菌報告指南表6 常見可疑菌落形態(tài)及快速經(jīng)典方法初步鑒定檢測病原菌檢驗并報告化膿鏈球菌B群beta-溶血鏈球菌（兒童）博德特菌屬，特別是支氣管博德特菌奴卡菌新型隱球菌淋病奈瑟菌弗朗西斯吐拉菌（高致病菌）鼠疫耶爾森菌（高致病菌）炭疽芽孢桿菌（高致病菌）霉菌，排除腐生菌污染當(dāng)培養(yǎng)少量，涂片也見到時報告肺炎鏈球菌，報告藥敏流感嗜血桿菌，報告beta-內(nèi)酰胺酶當(dāng)培養(yǎng)達到有意義數(shù)量時，即使不是優(yōu)勢菌，也報告卡他莫拉菌腦膜炎奈瑟菌只對住院患者報告：銅綠假單胞菌，報告藥敏嗜麥芽窄食單胞菌不動桿菌，報告藥敏伯克霍德菌，報告藥敏檢測病原菌當(dāng)培養(yǎng)達到有意義數(shù)量，并且是優(yōu)勢菌，特別是涂片提示多形核白細胞與培養(yǎng)一致，

13、報告金黃色葡萄球菌，報告藥敏B群beta-溶血鏈球菌（成人），C、G群單一形態(tài)革蘭陰性桿菌（肺克）報告藥敏苛養(yǎng)革蘭陰性桿菌，報告beta-內(nèi)酰胺酶尿素陽性棒狀桿菌或來自ICU來自免疫抑制患者，馬紅球菌報告“腸道革蘭陰性桿菌”在麥康凱平板上生長1種以上革蘭陰性桿菌，氧化酶陰性，吲哚陽性，乳糖陽性或蔓延生長報告“非發(fā)酵革蘭陰性桿菌”在麥康凱平板上生長1種以上革蘭陰性桿菌，氧化酶陽性，三糖鐵上不發(fā)酵葡萄糖報告“分離到上呼吸道細菌”，注如果只存在腸球菌和凝固酶陰性葡萄球菌（有或沒有酵母菌），報告“混合有革蘭陽性微生物細菌，或如果90%是培養(yǎng)物，則做少量鑒定列出”草鏈和或非致病的奈瑟菌，類白喉菌、凝固酶

14、陰性葡萄球菌、Rothia羅思氏菌、F群鏈球菌，厭氧菌，嗜血桿菌屬（非流感），艾肯菌，放線桿菌嗜二氧化碳菌，莫拉菌，腸球菌，酵母菌和有意義數(shù)量的金黃色葡萄球菌，革蘭陰性桿菌和腦膜炎奈瑟菌分析后下呼吸道標(biāo)本報告分析后報告結(jié)果l革蘭染色不要報告涂片中所見的少量菌（1/20視野）；如果未分離到涂片中所見細菌，在報告中注明。l如果任何平板上都沒有細菌生長，報告“無致病菌生長或正常上呼吸道微生物”，注意抗生素抑制生長l陽性報告參照表4指南報告結(jié)果和藥敏；藥敏結(jié)果依據(jù)CLSIl結(jié)果解釋陽性注意假陽性（攜帶菌）；陰性不能排除感染局限性l常規(guī)培養(yǎng)方法不生長l假陰性培養(yǎng)可能由正常菌群污染或事先使用了抗生素l假陽性結(jié)果可能會對培養(yǎng)結(jié)果過度解釋參考文獻 Susan E.Sharp, Ann Robinson and Michael Saubolle, etc.2004. Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbi