豬瘟疫苗研究進(jìn)展及我國傳統(tǒng)疫苗的研究現(xiàn)狀.docx

1、豬瘟疫苗研究進(jìn)展及我國傳統(tǒng)疫苗的研究現(xiàn)狀杜軍I,舒常永2,張劍揚(yáng)(1.河南南陽農(nóng)業(yè)學(xué)校，河南南陽423003；2.河南省安陽縣安豐鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，河南安陽455143；3.河南羅山縣中等職業(yè)學(xué)校，河南羅山464200)中圖分類號：S859.79+7文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-3111(2009)03-0016-04豬瘟是由豬由病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)|起的一種高度接觸性傳染病，也是世界糧農(nóng)組織和各國政府密切關(guān)注的主要傳染病之一，0IE國際委員會國際衛(wèi)生法典(2002版)中，豬瘟被列為A類15種法定傳染病之一。在我國也被列為一類傳染病。最近該病在美

2、洲、亞洲、歐洲等國家和地區(qū)呈現(xiàn)散發(fā)的趨勢，一些宣布已消滅豬瘟的國家如法國、荷蘭、德國、比利時等又見豬瘟笈發(fā)的報(bào)道。近年來，我國因各種疾病死亡的生豬占飼養(yǎng)總數(shù)的8%10%,其中1/3由豬瘟致死，每年的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億元，造成了巨大的人力和資源浪費(fèi)。針對我國畜牧業(yè)生產(chǎn)現(xiàn)狀，采取疫苗防制仍是預(yù)防豬瘟的主要措施，因而研制開發(fā)安全、高效、穩(wěn)定的豬瘟疫苗仍是當(dāng)前獸醫(yī)科研工作的重點(diǎn)。1傳統(tǒng)疫苗自1903年DeSehweinitz和Dorset首次證明CSFV是一種濾過性病毒以來，人們采用各種免疫方法預(yù)防和控制豬痕。1908年匈牙利HutyraK-oves制成豬瘟高免血清后，人們一直用高免血清一血毒同時肌注

3、來免疫豬群。但由于高免血清昂貴，獲取困難，加之血毒有散毒的危險，因此各國學(xué)者在以后的60年間相繼研制出許多滅活疫苗。其中福爾馬林和結(jié)晶紫滅活苗曾被廣泛應(yīng)用。滅活疫苗雖然安全，但保存期短。20世紀(jì)50年代，在佐劑和病毒培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展的推動下，人們在研制出較為理想的滅活疫苗的同時，還研制出安全有效的豬瘟弱毒疫苗，并廣泛應(yīng)用于臨床。豬瘟弱毒疫苗由豬瘟野毒株弱化獲得，如中國C株、日本GPE株、法國Thivcrval株等都是廣泛應(yīng)用的CSFV疫苗株，-般均可提供終生免疫。中國培育的C株是國收稿日期：2009-12-18作者簡介：杜軍(1976-)，女，河南南汨人.學(xué)士，講師。際上公認(rèn)的安全有效的疫苗株，該

4、毒株免疫原性好、免疫譜廣、安全性高、遺傳性穩(wěn)定。但也有研究認(rèn)為C株可發(fā)生垂直感染。中國C株是中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所周泰沖等研究者自1954年開始，相繼用4株豬瘟病毒(hog-cholcravirus,HCV)分別誘發(fā)家兔感染，經(jīng)過一系列的試驗(yàn)，終于選育出一株能夠適應(yīng)家兔的HCV,經(jīng)兔體連續(xù)傳代適應(yīng)后發(fā)生變異，減弱對豬的致病力，卻仍保持很強(qiáng)的免疫原性。用其制備的疫苗自1956年開始在全國推廣應(yīng)用，對控制我國豬瘟(HC)的流行起到了決定性作用，并在國外廣泛應(yīng)用。世界公認(rèn)中國C株兔化弱毒的突出優(yōu)點(diǎn)是，用其接種的豬不產(chǎn)生病毒血癥和腦炎病變，可以安全地免疫接種任何懷孕期的母豬和吮乳仔豬，不影響受精率及存活率

5、，不引起流產(chǎn)、死胎，可安全地用于建立種豬群。傳統(tǒng)疫苗具有免疫原性優(yōu)良，免疫譜廣、安全高效、遺傳穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)。但是，由于弱毒疫苗干擾豬瘟血清學(xué)診斷，使人們難以區(qū)別豬瘟感染豬和免疫豬；弱毒活苗還有可能與野毒重組或進(jìn)行自然突變而造成毒力返強(qiáng)，并可通過母豬胎盤感染造成胎豬死亡、弱仔、先天性感染仔豬，導(dǎo)致出現(xiàn)免疫耐受現(xiàn)象。歐盟已禁止使用豬瘟弱毒疫苗，而采用撲殺感染豬來控制和消滅豬瘟，采用撲殺政策需要大量的人力、物力和巨額資金投入，發(fā)展中國家是難以承受的，因此開發(fā)豬瘟的新型疫苗顯得尤為迫切。近年來基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展為豬瘟新型疫苗的研究和開發(fā)提供了新的工具。2新型疫苗2.1重組疫苗以無致病力或低毒力

6、的痘病毒（VAC）和偽狂犬病毒（PRV）為載體，將豬痕病毒E2基因與之重組研制出的基因重組疫苗，免疫動物后可對2種病毒產(chǎn)生良好的保護(hù)力。Rumenapf等將編碼CSFV結(jié)構(gòu)蛋白的E2基因插入痘病毒的TK基因中，獲得了能表達(dá)該結(jié)構(gòu)蛋白的重組痘苗病毒，將這種重組病毒免疫豬，可使豬抵抗強(qiáng)毒攻擊。隨后Matthias等發(fā)表了豬瘟E2基因重組痘病毒疫苗的相關(guān)研究，澳大利亞學(xué)者Hammond等相繼發(fā)表了將E2基因重組到腺病毒后免疫豬的文章。Mulder等指出，偽狂犬病毒是另一個重要的活病毒載體，外源基因可穩(wěn)定地插入其DNA。荷蘭學(xué)者Peetes等報(bào)道了將豬痕E2基因重組到偽狂犬病毒中，免疫豬可以抵抗豬瘟和

7、偽狂犬病毒的攻擊。我國四川農(nóng)大郭萬柱。教授研制的偽狂犬/豬瘟活載體重組疫苗也顯示出了良好的應(yīng)用前景。重組疫苗的安全性和實(shí)用價值目前還有爭議，因?yàn)槿祟愔两襁€不了解病毒自然發(fā)生變異的機(jī)制一方面，對于VAC/HCV重組體來講，引起人們疑慮的是痘病毒會引起未種痘疫苗人群的感染，并使極少數(shù)感染者發(fā)病;另一方面，偽狂犬病是一種較為普遍的疾病，豬瘟一偽狂犬病毒重組疫苗對于已感染或已免疫的動物不能產(chǎn)生保護(hù)力。2.2亞單位疫苗亞單位疫苗因其良好的安全性和穩(wěn)定性而備受研究者青睞。CSFV亞單位疫苗的研制是基于對CSFV保護(hù)性抗原的深入研究，其產(chǎn)品已被載人歐洲藥典,CSFV編碼的E2和E0蛋白是其主要保護(hù)性抗原，均

8、能獨(dú)立誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)機(jī)體免受強(qiáng)毒攻擊.荷蘭學(xué)者Hulst等將E2基因與桿狀病毒重組，并在昆蟲細(xì)胞Sf21中成功表達(dá)，免疫20g表達(dá)的E2蛋白可以保護(hù)被免疫豬免受強(qiáng)毒的攻擊。荷蘭學(xué)者Bouma等確定將表達(dá)的32gE2蛋白為1頭份疫苗，對豬的保護(hù)率可達(dá)95%,保護(hù)期達(dá)18個月,deSmit等研究了E2亞單位疫苗的保護(hù)期，發(fā)現(xiàn)E2亞單位疫苗一免后可提供613個月的保護(hù)力.他又進(jìn)一步研究了E2亞單位疫苗一免和二免后對CSFV溫和型毒株的保護(hù)情況，發(fā)現(xiàn)用E2亞單位疫苗標(biāo)準(zhǔn)滴度一次免疫就能顯著減少溫和型毒株從帶毒妊娠母豬向胎兒的傳播，二免后4周攻毒可阻止病毒胎盤傳播。2.3標(biāo)記疫苗目前國際上興

9、起了所謂標(biāo)記疫苗（Markervaccine）,該疫苗就是對豬瘟兔化弱毒進(jìn)行改造，使其缺失某一段基因（如E0）或某一段特殊片段（如E2）,但其免疫原性不改變。以缺失的基因所表達(dá)的蛋白作為診斷抗原，能綻區(qū)別疫苗接種豬和自然感染豬產(chǎn)生的抗體。荷蘭學(xué)者deSmit等將C株重組克隆出Fle2和Fle3重組疫苗株，Widjo-joatmodjo等報(bào)道利用豬瘟C株感染性拷貝在SK6e26細(xì)胞系上連續(xù)傳代，制備了2株E0基因突變株Fle22及Fle23,荷蘭學(xué)者vanGennip等報(bào)道制備了3株C株E2基因突變株Fle4、Fle47及Fle48.荷蘭學(xué)者deSmit等又報(bào)道構(gòu)建了2株C株E2基因突變株Fle

10、9和Fiello他們構(gòu)建的很多突變株可以抗豬瘟強(qiáng)毒的感染.GRRisatti等研究了E2亞單位標(biāo)記疫苗在實(shí)驗(yàn)條件下的免疫保護(hù)情況并發(fā)現(xiàn)，在E2亞單位標(biāo)記疫苗中融入細(xì)胞因子有可能進(jìn)一步提高疫苗免疫效果。標(biāo)記疫苗的最大優(yōu)點(diǎn)在于它帶有可識別的標(biāo)記，誘導(dǎo)的抗體能與野毒誘導(dǎo)的抗體相區(qū)別，便于及早發(fā)現(xiàn)感染動物，采取控制措施，可為在實(shí)施豬瘟“撲滅計(jì)劃”時減少大量錯殺導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失，同時也是擴(kuò)大生豬及其制品出口，發(fā)展對外貿(mào)易的需要.2.4核酸疫苗DNA疫苗技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新的疫苗研制技術(shù)，它將連接有豬瘟病毒主要保護(hù)性抗原E2基因的表達(dá)載體直接免疫動物，使病毒核酸在動物機(jī)體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生免

11、疫保護(hù).解放軍軍需大學(xué)余興龍等已用豬瘟DNA疫苗成功保護(hù)了豬對豬瘟強(qiáng)毒的攻擊,他們構(gòu)建了4種包含E2全基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒，其中用pCDSW質(zhì)粒（含有5'信號序列）給小鼠肌肉注射后可誘導(dǎo)小鼠抗CSFV的體液免疫。Hammmond等用表達(dá)CSFVE2基因的裸露質(zhì)粒DNA免疫6周齡斷奶仔豬和7日齡提前斷奶乳豬，再將這2組豬群均用表達(dá)E2基因的腺病毒重組體（rPAV-gp55）加強(qiáng)免疫一次，用CSFV攻毒后，100%的仔豬和75%的乳豬獲得保護(hù)。Andrew等也證明用編碼CSFVE2基因的質(zhì)粒免疫豬后可獲得保護(hù)。MarkowskaDaniel等報(bào)道CSFVDNA疫苗免疫豬后能完全保護(hù)強(qiáng)毒攻

12、擊，但攻毒后有2d體溫高達(dá)40C以上，同時T、B淋巴細(xì)胞活性輕微增強(qiáng).任何疫苗應(yīng)用效果評價都應(yīng)考慮其安全性問題,核酸疫苗同樣如此。從目前研究情況來看，核酸疫苗在安全性上主要存在三個方面的問題即DNA抗體形成,外來抗原持續(xù)表達(dá)帶來的副作用以及導(dǎo)致宿主細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的可能性。CSFV核酸疫苗剛剛起步，其免疫安全性是必須要考慮和解決的。3我國豬瘟疫苗生產(chǎn)工藝中存在的問題3.1傳統(tǒng)豬瘟兔化弱毒疫苗的生產(chǎn)工藝發(fā)展歷程我國在1956年開始推廣豬瘟兔化弱毒疫苗，最初提倡就地制苗，就地使用。繼而研制真空冷凍干燥疫苗成功，集中生產(chǎn)，統(tǒng)一供應(yīng)。凍干苗便于保存，成為我國防制HC的有力工具。開始時采用家兔淋脾組織制苗，

13、每只家兔所制疫苗可供300頭豬免疫。1964年將豬痕兔化弱推接種乳兔，研制成功乳兔苗，對豬仍保持較好的免疫原性和弱毒性。每只乳兔所制疫苗可供1500頭豬使用，大大提高了產(chǎn)屋，降低了成本，自1965年起在全國推廣使用。接著又用豬瘟兔化弱毒接種牛，病毒可在牛體內(nèi)繁殖，淋脾毒價可達(dá)到乳兔水平，便于就地制苗或生產(chǎn)廠制造凍干苗。在偏僻山區(qū)用牛生產(chǎn)牛體反應(yīng)苗深受歡迎。1974年黑龍江獸醫(yī)研究所用原代豬腎細(xì)胞培養(yǎng)豬瘟兔化弱毒制苗，獲得成功，但不能適應(yīng)于規(guī)?；a(chǎn)的需要。1975年開始由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所組織全國獸醫(yī)藥品生產(chǎn)廠進(jìn)行病毒型疫苗轉(zhuǎn)為細(xì)胞培養(yǎng)制苗的技術(shù)革新，將豬瘟兔化弱毒接種原代腎細(xì)胞進(jìn)行工廠化制苗

14、。19781980年，有13家獸用生物藥品廠生產(chǎn)豬腎細(xì)胞苗，并用細(xì)胞毒配制豬瘟、豬丹毒、豬肺疫三聯(lián)凍干苗，在全國大量使用，1980年我國研制成功綿羊腎細(xì)胞苗，1982年研制成功奶山羊腎細(xì)胞苗,1985年生產(chǎn)出犢牛睪丸細(xì)胞苗，為HC疫苗生產(chǎn)開辟了一條新的道路。羊腎和犢牛睪丸細(xì)胞苗接種豬后3d可產(chǎn)生免疫力，5d可產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力，免疫期均達(dá)到一年。王棟等發(fā)明了耐熱凍干保護(hù)劑配方和制造耐熱凍干活疫苗的技術(shù)，獲得發(fā)明專利，使我國豬瘟耐熱凍干苗達(dá)到國際水平。3.2傳統(tǒng)疫苗的特點(diǎn)豬痕疫苗的質(zhì)量涉及兩方面的問題：一是豬瘟兔化弱毒的免疫原性，免疫原性是由最小免疫保護(hù)劑量和刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平?jīng)Q定的，兔化弱攜

15、對兔感染的主要標(biāo)志是發(fā)熱反應(yīng)，無臨床癥狀及病理變化，即使傳至935代，經(jīng)鑒定免疫原性亦無改變；二是豬瘟疫苗的使用時的質(zhì)量（毒價），涉及到制苗中的質(zhì)量、出廠運(yùn)輸冷藏保管的質(zhì)笊和注射疫苗操作技術(shù)的影響等3個方面的問題。3.3傳統(tǒng)豬瘟疫苗生產(chǎn)中存在的問題3.3.1溫度的影響豬瘟細(xì)胞毒生產(chǎn)中，病毒增殖過程中釋放于營養(yǎng)液中的病毒粒子部分失活。豬瘟病毒在37C的半衰期為3h。在轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)中，病毒粒子成熟后從細(xì)胞中釋放到營養(yǎng)液里，會導(dǎo)致部分病毒粒子失活。因此降低病毒對溫度的敏感性是提高疫苗質(zhì)量的重要因素。3.3.2不產(chǎn)生細(xì)胞病交CSFV-般不使培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生病理變化（Cytopathicefect.CPE）,在

16、體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，CSFV以低水平增殖.產(chǎn)牛的子代病窿滴度較低。這是當(dāng)前生產(chǎn)中影響疫苗質(zhì)最的關(guān)建問題。3.3.3毒價低在豬瘟細(xì)胞苗生產(chǎn)過程中，4收以后細(xì)胞明顯老化，毒價降低；6收以后毒價難以達(dá)到配苗要求。3.3.4病毒粒子的失活抗原保存和疫苗凍干過程中病毒粒子的失活也是制約疫苗質(zhì)量的因素之一。據(jù)報(bào)道，在某個豬瘟疫苗接種點(diǎn)觀察，早上稀釋效價為150個兔體反應(yīng)量的合格疫苗，于室溫條件下到晚上8時就只有15個兔體反應(yīng)景，效價損失達(dá)90%（已失效）。3.4傳統(tǒng)豬瘟疫苗應(yīng)用過程中存在的問題國際上要求豬瘟疫苗應(yīng)達(dá)到每頭份400RID,才能剌激機(jī)體出現(xiàn)亞臨床癥狀，產(chǎn)生保護(hù)性抗體。由于我國豬痕細(xì)胞苗生產(chǎn)工藝的

17、限制，毒價含量偏低，每頭份含量僅為150RID。我國豬瘟細(xì)胞苗生產(chǎn)中用犢牛睪丸細(xì)胞培養(yǎng)收獲細(xì)胞毒，效檢用5萬倍兔檢通過為合格，而按國際標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)13萬倍兔檢通過，犢牛睪丸細(xì)胞培養(yǎng)難以達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)。在獸醫(yī)部門進(jìn)行臨床疫苗免疫測試時，用1頭份疫苗免疫后，只要對攻毒能臨床保護(hù)，即算通過，這一標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)低于國際標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致免疫劑量不足使免疫水平達(dá)不到保護(hù)性亞臨床感染的水平，以至于出現(xiàn)隱蔽感染豬瘟。豬瘟傳統(tǒng)細(xì)胞苗需一15C保存，目前養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)條件很難達(dá)到這一要求.4豬瘟疫苗研究展望4.1發(fā)展亞單位標(biāo)記疫苗，建立鑒別試驗(yàn)如將傳統(tǒng)c株病毒的某一基因用相應(yīng)的牛病毒性腹瀉病毒的基因代替，或者牛病毒性腹瀉病毒的E2基因被

18、有毒力的豬瘟病毒E2基因代替，或者直接開發(fā)DNA疫苗進(jìn)入宿主細(xì)胞后表達(dá)E2基因，或者將突變的E2基因刪除。4.2病毒保護(hù)劑研究在細(xì)胞苗半成品生產(chǎn)中加入病毒保護(hù)劑，提高疫苗生產(chǎn)質(zhì)最。其重點(diǎn)在于:解決收獲液中病毒效價的降低，以及配苗前冷凍保存中病毒效價的降低問題;降低疫苗對溫度的敏感性,延長冷凍保存時間和凍干保存期。4.3耐熱凍干保護(hù)劑研究選擇適宜的耐熱凍干保護(hù)劑使生產(chǎn)的疫苗產(chǎn)品具有抗過敏、疫苗免疫原性高、可常溫保存等特點(diǎn)。4.4免疫佐劑及稀釋液研究開發(fā)出與傳統(tǒng)豬瘟疫苗相配套的免疫佐劑和稀釋液，提高其免疫效果。4.5新工藝在傳統(tǒng)豬瘟細(xì)胞苗生產(chǎn)中研制、篩選和應(yīng)用高通量、大規(guī)模生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，將替代

19、常規(guī)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，為細(xì)胞苗的生產(chǎn)帶來新的飛越。4.6產(chǎn)業(yè)化新型疫苗的研究和開發(fā)須向低成本、高產(chǎn)率、更安全的產(chǎn)業(yè)化方向努力。綜上所述，疫苗對豬瘟的預(yù)防、控制及凈化起到了不可替代的作用。就其發(fā)展方向而言，滅活疫苗已成為歷史；弱毒疫苗雖仍在使用，但要消滅豬瘟，應(yīng)禁止使用；亞單位疫苗安全，但還需改進(jìn)生產(chǎn)工藝、降低成本，并有與之相配的鑒別診斷方法；活載體疫苗雖已取得成功，但到臨床應(yīng)用還有許多工作要作;標(biāo)記疫苗優(yōu)勢明顯，但投入應(yīng)用前仍需證實(shí)其安全性、有效性；核酸疫苗剛剛起步，具有很大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景，但在安全性和接種方法方面還需解決和改進(jìn)?？傊瑹o論是哪一種疫苗都不能作為控制并最終消滅豬瘟的唯一手段。參考

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