高效液相色譜法測定保健食品中維生素E的測量不確定度評定

1、 高效液相色譜法測定保健食品中維生素E的測量不確定度評定 高效液相色譜法測定保健食品中維生素E的測量不確定度評定林賢邦，陳宏壁，陳彩云，蘇昭侖，蔡偉江*（湯臣倍健股份有限公司，廣東 珠海 519040） 摘 要：利用高效液相色譜測定保健食品中維生素E的含量,分析了不確定度來源,建立了高效液相色譜含量測定法的數(shù)學(xué)模型。對其中的標(biāo)準(zhǔn)溶液配置、樣品準(zhǔn)備、測量重復(fù)性等各個(gè)不確定度分量進(jìn)行評估。計(jì)算得出本實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為U=1.14%。關(guān)鍵詞：不確定度；高效液相；維生素E；保健食品High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method Was

2、 Developed For The Determination Of Vitamin E In health Food Measurement Uncertainty EvaluationLin Xianbang，Chen Hongbi，Chen Caiyun，Su Zhaolun；Cai Weijiang(By-Health Co.，Ltd,Guangdong Zhuhai 519040)Abstract: Using high performance liquid chromatography (HPLC) determination of the content of vitamin

3、E in health food, analyzes the sources of uncertainty, established the mathematical model of high performance liquid chromatography (HPLC) content measurement. About the configuration of standard solution, sample preparation, to evaluate the uncertainty components of measurement repeatability. Calcu

4、lated from the experiment, the expanded uncertainty of determination results for U = 1.14%.Key words: uncertainty； high performance liquid；vitamin E； health food 維生素E是指具有生育酚生物活性的一類物質(zhì)，在自然界中共有8種存在形式：-T，-T，-T，-T四種生育酚， -TT，-TT，-TT，-TT四種生育三烯酚。維生素E（Vitamin E）是一類脂溶性維生素，易溶于脂肪和乙醇等有機(jī)溶劑中。本中心測定保健品中維生素E依據(jù)GB 5413

5、.9-20101中維生素E含量的測定方法進(jìn)行測定。依據(jù)檢測實(shí)驗(yàn)室具有并應(yīng)用測量不確定度的程序?qū)z測結(jié)果的測量不確定度進(jìn)行評定，并依照J(rèn)JF 1059.1-2012測量不確定度評定與表示2要求，建立維生素E含量的不確定度評定的一般模式，根據(jù)評定結(jié)果確認(rèn)方法制定的可行性范圍的一般方法。1 測定方法描述1.1 測量方法GB 5413.9-20101.2 方法提要試樣皂化后，經(jīng)石油醚萃取，蒸走石油醚并無水乙醇定量溶解，以甲醇為流動相，使用填料為C18,4.6mm×250mm,5m的不銹鋼柱和紫外可變波長檢測器UV294nm，流速1.0min/mL,柱溫40°C，對樣品的維生素E進(jìn)行

6、液相色譜分離和測定。1.3 維生素E含量（mg/g）計(jì)算公式 X=C*V/M式中： X樣品維生素E的含量； mg/gM樣品的質(zhì)量，g；V樣品的稀釋倍數(shù)，mL；C樣品溶液中維生素E的濃度，mg/mL。1.4分析步驟1.4.1標(biāo)樣溶液的配制 精確稱取38.33mg維生素E標(biāo)準(zhǔn)品于50ml容量瓶中，加入乙醇溶解后定容至刻度。 維生素E校正：精密量取生育酚1mL，用無水乙醇定容至25mL，以乙醇為空白，在294nm波長處測定d-生育酚吸光度，按校正公式:C=A*V*10/E。其中C是維生素E濃度（單位為mg/mL），A是紫外吸光度，E是維生素E1%比色光系數(shù)，V是標(biāo)準(zhǔn)液稀釋倍數(shù)；10單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。(d

7、-生育酚吸光系數(shù)為71)。1.4.2樣品處理1.4.2.1皂化精確稱取樣品適量于250mL具塞錐形瓶中，加入50mL 4550水使其溶解，加入約100mL 1.5%抗壞血酸的乙醇溶液，充分混勻后加入25mL氫氧化鉀溶液混勻，放入磁力攪拌子，充氮排出空氣，塞上瓶塞。將錐形瓶放入恒溫磁力攪拌水浴鍋中，控制水溫在53±2，皂化45min后，取出立刻冷卻至室溫。1.4.2.2 提取及濃縮用少量水將皂化液全部轉(zhuǎn)入500mL分液漏斗中，加入100mL 石油醚，輕輕搖蕩，排氣后塞好瓶塞，室溫下振蕩約10min后靜置分層，將水相轉(zhuǎn)入另一500mL 分液漏斗中，按上述方法進(jìn)行二次萃取。合并醚液，用水洗

8、至近中性。醚液通過無水硫酸鈉過濾脫水，醚液收入250mL 圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上在40±2充氮條件下蒸至近干，殘?jiān)o密加入25mL乙醇，超聲溶解，過膜后待測。1.4.3測定待儀器穩(wěn)定后,注入標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣的峰面積，算出試樣中的含量。1.5 主要儀器電子天平AL204（METTLER TOLEDO）；高效液相色譜儀1260（Agilent technologies）；紫外分光光度計(jì)UV-2450（島津）。2 分析過程2.1 識別不確定度來源A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度：通過實(shí)驗(yàn)測得數(shù)據(jù)，以統(tǒng)計(jì)分析方法評定的不確定度，結(jié)果以實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差表征；B類標(biāo)準(zhǔn)不確定度：根據(jù)經(jīng)驗(yàn)、資料及假

9、設(shè)的不確定度以概率分布估計(jì)獲得的標(biāo)準(zhǔn)偏差表征。2.2 不確定度的來源（1）試樣重復(fù)測定時(shí)，總重復(fù)性引起的不確定度ur(x1)。（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x2)。（3）樣品引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x3)。（4）儀器（液相色譜儀）引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x4)。根據(jù)以上分析，不確定度來源如圖的因果圖所示。重復(fù)性樣品吸光度測量稀釋d-生育酚的含量 w液相色譜儀人員操作樣品稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量皂化儀器定容濃縮圖1 維生素E試樣有效成分含量測定的不確定度來源2.3 不確定度來源量化2.3.1不確定度傳播律由于數(shù)學(xué)模型是非線性模型，采用相對不確定度合成公式：ucr(x)= u2r(x1)+ u2r

10、(x2)+ u2r(x3)+ u2r(x4)1/22.3.2標(biāo)準(zhǔn)不確定度各分量的評定2.3.2.1試樣重復(fù)測定時(shí)，總重復(fù)性引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量ur(x1)u(x1)包括：人員、環(huán)境、儀器重復(fù)性等因素引起的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；天平重復(fù)稱量引起的不確定度等。本法按“GB 5413.9-2010 維生素E”的要求，通過對同一試樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部比對試驗(yàn)，得出一組數(shù)據(jù)，見表1。表1 樣品中維生素E含量重復(fù)測定10次結(jié)果序 號含量（%）14.54824.55334.55344.54854.5464.54774.55184.55194.552104.549維生素E含量測量單次的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：S1=0.003

11、88158標(biāo)準(zhǔn)不確定度: u(x3.2.1)= =0.00388158/=0.001228相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：= =0.001228/4.5492=0.02699%此數(shù)值可作為測量重復(fù)性的方法確認(rèn)結(jié)果，以后評定可采用此數(shù)據(jù)。ur(rep)=ur(x2.3.2.1)= 0.02699%在實(shí)際工作過程中，當(dāng)測定某維生素E樣品中維生素E含量2次時(shí)，取其算術(shù)平均值4.549作為測量結(jié)果，故測定重復(fù)性引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為：ur(x1)=ur(x2.3.2.1)/=0.02699%/=0.02%2.3.2.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量ur(x2)2.3.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校正前稀釋引入的不確定度u

12、r（x2.3.2.2.1）溶液定容過程引起不確定度主要由1mL 單標(biāo)移液管（B級）引入的不確定度。2.3.2.2.1.1 1mL單標(biāo)移液管校準(zhǔn)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度 ur（x2.3.2.2.1.1）按照1mL單標(biāo)移液管的校準(zhǔn)證書知，實(shí)驗(yàn)中所用的1mL單標(biāo)移液管都屬于B級測量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度U=0.00048mL， k=2，屬于正態(tài)分布，則有： 標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(x2.3.2.2.1.1)=0.00048/2=0.00024mL相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：ur(x2.3.2.2.1.1)=0.00024/1=0.024%2.3.2.2.1.2溶液溫度與校準(zhǔn)溫度不同產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（x2.3.2.2

13、.1.2）假設(shè)溶液與校準(zhǔn)溫度的差異為±5，移液管的體積為1mL，水體積膨脹系數(shù)水為(2.1×10-4)/，水的體積膨脹明顯大于玻璃的體積膨脹，因此只需考慮水的體積膨脹即可，按矩形分布，取k，則有：標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u（x2.3.2.2.1.2）=1×5×2.1×10-4/0.00061mL 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：ur(x2.3.2.2.1.2)= 0.00061/1=0.061%1mL單標(biāo)線移液管產(chǎn)生的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：ur(x2.3.2.2.1)=0.07%2.3.2.2.2溶液定容過程引起的不確定度ur（x2.3.2.2.2） 溶液定容過程

14、引起不確定度主要由25 mL單標(biāo)線容量瓶 (B級) 引入的不確定度。2.3.2.2.2.1 25 mL容量瓶校準(zhǔn)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度 ur（x2.3.2.2.2.1）按照25 mL單標(biāo)線容量瓶的校準(zhǔn)證書知，實(shí)驗(yàn)中所用的25 mL單標(biāo)線容量瓶都屬于B級測量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度U=0.01mL， k2，屬于正態(tài)分布，則有：標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(x2.3.2.2.2.1)=0.01/20.005mL相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：ur(x2.3.2.2.2.1)=0.005/25=0.020%2.3.2.2.2.2溶液溫度與校準(zhǔn)溫度不同產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（x2.3.2.2.2.2）假設(shè)溶液與校準(zhǔn)溫度的差異為

15、77;5，容量瓶的體積為25mL，水體積膨脹系數(shù)水為(2.1×10-4)/，水的體積膨脹明顯大于玻璃的體積膨脹，因此只需考慮水的體積膨脹即可，按矩形分布，取k，則有：標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u（x2.3.2.2.2.2）=25×5×2.1×10-4/0.016mL 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：ur(x2.3.2.2.2.2)=0.015/25=0.064%25 mL單標(biāo)線容量瓶產(chǎn)生的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：ur(x2.3.2.2.2)=0.07%2.3.2.2.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度校正引入的不確定度ur（x2.3.2.2.3）用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度校正，維生素E標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)吸光度

16、=0.2177；紫外分光光度計(jì)的校準(zhǔn)證書給出的測量結(jié)果示值誤差的擴(kuò)展不確定度U=0.0022，k=2，屬正態(tài)分布，則有：標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(x2.3.2.2.3)=0.0022/2=0.0011相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：ur(x2.3.2.2.3)=0.0011/0.2177=0.506%由上面分析可得，維生素E標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：= =0.52%2.3.2.3維生素E樣品引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x3)2.3.2.3.1樣品稱量引起的不確定度ur（x2.3.2.3.1）用電子天平進(jìn)行稱量，維生素E試樣重量m=0.2243g, 天平的校準(zhǔn)證書給出的測量結(jié)果示值誤差的擴(kuò)展不確定度U=0.3

17、mg，k=2，屬正態(tài)分布，則有：標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(x2.3.2.2.2)=0.3/2=0.00015g相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：ur(x2.3.2.3.1)= 0.00015/0.2243=0.067%2.3.2.3.2 樣品處理引起的不確定度ur（x2.3.2.3.2）將樣品處理引起的不確定度量化，用回收率來整體評價(jià)樣品處理過程的不確定度。分析程序的回收率在實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)使用標(biāo)準(zhǔn)加入法分析。表2收集了實(shí)驗(yàn)室對含維生素E樣品中的維生素E標(biāo)準(zhǔn)回收率進(jìn)行10次分析的結(jié)果。表2 維生素E標(biāo)準(zhǔn)回收率分析結(jié)果測量組分加入標(biāo)準(zhǔn)的量/mg測量次數(shù)nRec平均回收率/%S2標(biāo)準(zhǔn)偏差/%維生素E1.5331098.76

18、0.6由上面分析可得，維生素E樣品引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：= =0.20%2.3.2.4液相色譜儀引起的不確定度ur(x4)檢測結(jié)果的重現(xiàn)性主要受操作人員的樣品處理過程的一致性，樣品的均勻性和儀器本身的性能因素的影響，該不確定度屬A類評定，采用同一樣品進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評估，其中的測量結(jié)果如下表3：表3重復(fù)進(jìn)樣5次峰面積的測量值序號峰面積A14355.4277324374.0297934353.9477544362.0668954359.55566平均值4361.00556單次測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差：標(biāo)準(zhǔn)不確定度為： u(x2.3.2.4)=7.125/=3.187相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：=3.187

19、/4361.00556=0.08%表4相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度一覽表名稱不確定度來源類型相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度值ur (x1)方法總重復(fù)性A0.02%ur (x2)維生素E標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)B0.52%ur (x3)維生素E樣品A0.20%ur (x4)液相色譜儀A0.08%2.4合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定由表3中各相對不確定度合成ucr(x)=u2r(x1)+u2r(x2) + u2r(x3) + u2r(x4)1/2 =(0.02%)2+(0.52%)2+(0.20%)2+(0.08%)21/2=0.564%3 擴(kuò)展不確定度評定擴(kuò)展不確定度可由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子，取置信概率p=95%,則k=2，因此維生素E樣品中的維生素E含量測定的相對擴(kuò)展不確定度為： U=k×ucr(x)=2×0.57%=1.14%4 測量不確定度的報(bào)告與表示維生