高效液相色譜法測定保健食品中維生素E的測量不確定度評定

1、 高效液相色譜法測定保健食品中維生素E的測量不確定度評定 高效液相色譜法測定保健食品中維生素E的測量不確定度評定林賢邦，陳宏壁，陳彩云，蘇昭侖，蔡偉江*（湯臣倍健股份有限公司，廣東 珠海 519040） 摘 要：利用高效液相色譜測定保健食品中維生素E的含量,分析了不確定度來源,建立了高效液相色譜含量測定法的數(shù)學模型。對其中的標準溶液配置、樣品準備、測量重復性等各個不確定度分量進行評估。計算得出本實驗測定結果的擴展不確定度為U=1.14%。關鍵詞：不確定度；高效液相；維生素E；保健食品High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method Was

2、 Developed For The Determination Of Vitamin E In health Food Measurement Uncertainty EvaluationLin Xianbang，Chen Hongbi，Chen Caiyun，Su Zhaolun；Cai Weijiang(By-Health Co.，Ltd,Guangdong Zhuhai 519040)Abstract: Using high performance liquid chromatography (HPLC) determination of the content of vitamin

3、E in health food, analyzes the sources of uncertainty, established the mathematical model of high performance liquid chromatography (HPLC) content measurement. About the configuration of standard solution, sample preparation, to evaluate the uncertainty components of measurement repeatability. Calcu

4、lated from the experiment, the expanded uncertainty of determination results for U = 1.14%.Key words: uncertainty； high performance liquid；vitamin E； health food 維生素E是指具有生育酚生物活性的一類物質，在自然界中共有8種存在形式：-T，-T，-T，-T四種生育酚， -TT，-TT，-TT，-TT四種生育三烯酚。維生素E（Vitamin E）是一類脂溶性維生素，易溶于脂肪和乙醇等有機溶劑中。本中心測定保健品中維生素E依據(jù)GB 5413

5、.9-20101中維生素E含量的測定方法進行測定。依據(jù)檢測實驗室具有并應用測量不確定度的程序對檢測結果的測量不確定度進行評定，并依照JJF 1059.1-2012測量不確定度評定與表示2要求，建立維生素E含量的不確定度評定的一般模式，根據(jù)評定結果確認方法制定的可行性范圍的一般方法。1 測定方法描述1.1 測量方法GB 5413.9-20101.2 方法提要試樣皂化后，經石油醚萃取，蒸走石油醚并無水乙醇定量溶解，以甲醇為流動相，使用填料為C18,4.6mm×250mm,5m的不銹鋼柱和紫外可變波長檢測器UV294nm，流速1.0min/mL,柱溫40°C，對樣品的維生素E進行

6、液相色譜分離和測定。1.3 維生素E含量（mg/g）計算公式 X=C*V/M式中： X樣品維生素E的含量； mg/gM樣品的質量，g；V樣品的稀釋倍數(shù)，mL；C樣品溶液中維生素E的濃度，mg/mL。1.4分析步驟1.4.1標樣溶液的配制 精確稱取38.33mg維生素E標準品于50ml容量瓶中，加入乙醇溶解后定容至刻度。 維生素E校正：精密量取生育酚1mL，用無水乙醇定容至25mL，以乙醇為空白，在294nm波長處測定d-生育酚吸光度，按校正公式:C=A*V*10/E。其中C是維生素E濃度（單位為mg/mL），A是紫外吸光度，E是維生素E1%比色光系數(shù)，V是標準液稀釋倍數(shù)；10單位轉換系數(shù)。(d

7、-生育酚吸光系數(shù)為71)。1.4.2樣品處理1.4.2.1皂化精確稱取樣品適量于250mL具塞錐形瓶中，加入50mL 4550水使其溶解，加入約100mL 1.5%抗壞血酸的乙醇溶液，充分混勻后加入25mL氫氧化鉀溶液混勻，放入磁力攪拌子，充氮排出空氣，塞上瓶塞。將錐形瓶放入恒溫磁力攪拌水浴鍋中，控制水溫在53±2，皂化45min后，取出立刻冷卻至室溫。1.4.2.2 提取及濃縮用少量水將皂化液全部轉入500mL分液漏斗中，加入100mL 石油醚，輕輕搖蕩，排氣后塞好瓶塞，室溫下振蕩約10min后靜置分層，將水相轉入另一500mL 分液漏斗中，按上述方法進行二次萃取。合并醚液，用水洗

8、至近中性。醚液通過無水硫酸鈉過濾脫水，醚液收入250mL 圓底燒瓶中，于旋轉蒸發(fā)器上在40±2充氮條件下蒸至近干，殘渣緊密加入25mL乙醇，超聲溶解，過膜后待測。1.4.3測定待儀器穩(wěn)定后,注入標準溶液和試樣，根據(jù)標準溶液和試樣的峰面積，算出試樣中的含量。1.5 主要儀器電子天平AL204（METTLER TOLEDO）；高效液相色譜儀1260（Agilent technologies）；紫外分光光度計UV-2450（島津）。2 分析過程2.1 識別不確定度來源A類標準不確定度：通過實驗測得數(shù)據(jù)，以統(tǒng)計分析方法評定的不確定度，結果以實驗標準差表征；B類標準不確定度：根據(jù)經驗、資料及假

9、設的不確定度以概率分布估計獲得的標準偏差表征。2.2 不確定度的來源（1）試樣重復測定時，總重復性引起的不確定度ur(x1)。（2）標準物質引起的標準不確定度ur(x2)。（3）樣品引起的標準不確定度ur(x3)。（4）儀器（液相色譜儀）引起的標準不確定度ur(x4)。根據(jù)以上分析，不確定度來源如圖的因果圖所示。重復性樣品吸光度測量稀釋d-生育酚的含量 w液相色譜儀人員操作樣品稱量標準物質稱量皂化儀器定容濃縮圖1 維生素E試樣有效成分含量測定的不確定度來源2.3 不確定度來源量化2.3.1不確定度傳播律由于數(shù)學模型是非線性模型，采用相對不確定度合成公式：ucr(x)= u2r(x1)+ u2r

10、(x2)+ u2r(x3)+ u2r(x4)1/22.3.2標準不確定度各分量的評定2.3.2.1試樣重復測定時，總重復性引起的標準不確定度分量ur(x1)u(x1)包括：人員、環(huán)境、儀器重復性等因素引起的不確定度；標準物質；天平重復稱量引起的不確定度等。本法按“GB 5413.9-2010 維生素E”的要求，通過對同一試樣進行實驗室內部比對試驗，得出一組數(shù)據(jù)，見表1。表1 樣品中維生素E含量重復測定10次結果序 號含量（%）14.54824.55334.55344.54854.5464.54774.55184.55194.552104.549維生素E含量測量單次的標準偏差為：S1=0.003

11、88158標準不確定度: u(x3.2.1)= =0.00388158/=0.001228相對標準不確定度為：= =0.001228/4.5492=0.02699%此數(shù)值可作為測量重復性的方法確認結果，以后評定可采用此數(shù)據(jù)。ur(rep)=ur(x2.3.2.1)= 0.02699%在實際工作過程中，當測定某維生素E樣品中維生素E含量2次時，取其算術平均值4.549作為測量結果，故測定重復性引起的標準不確定度分量為：ur(x1)=ur(x2.3.2.1)/=0.02699%/=0.02%2.3.2.2標準物質引起的標準不確定度分量ur(x2)2.3.2.2.1標準物質校正前稀釋引入的不確定度u

12、r（x2.3.2.2.1）溶液定容過程引起不確定度主要由1mL 單標移液管（B級）引入的不確定度。2.3.2.2.1.1 1mL單標移液管校準產生的標準不確定度 ur（x2.3.2.2.1.1）按照1mL單標移液管的校準證書知，實驗中所用的1mL單標移液管都屬于B級測量結果的擴展不確定度U=0.00048mL， k=2，屬于正態(tài)分布，則有： 標準不確定度為：u(x2.3.2.2.1.1)=0.00048/2=0.00024mL相對標準不確定度為：ur(x2.3.2.2.1.1)=0.00024/1=0.024%2.3.2.2.1.2溶液溫度與校準溫度不同產生的標準不確定度ur（x2.3.2.2

13、.1.2）假設溶液與校準溫度的差異為±5，移液管的體積為1mL，水體積膨脹系數(shù)水為(2.1×10-4)/，水的體積膨脹明顯大于玻璃的體積膨脹，因此只需考慮水的體積膨脹即可，按矩形分布，取k，則有：標準不確定度為：u（x2.3.2.2.1.2）=1×5×2.1×10-4/0.00061mL 相對標準不確定度為：ur(x2.3.2.2.1.2)= 0.00061/1=0.061%1mL單標線移液管產生的合成相對標準不確定度：ur(x2.3.2.2.1)=0.07%2.3.2.2.2溶液定容過程引起的不確定度ur（x2.3.2.2.2） 溶液定容過程

14、引起不確定度主要由25 mL單標線容量瓶 (B級) 引入的不確定度。2.3.2.2.2.1 25 mL容量瓶校準產生的標準不確定度 ur（x2.3.2.2.2.1）按照25 mL單標線容量瓶的校準證書知，實驗中所用的25 mL單標線容量瓶都屬于B級測量結果的擴展不確定度U=0.01mL， k2，屬于正態(tài)分布，則有：標準不確定度為：u(x2.3.2.2.2.1)=0.01/20.005mL相對標準不確定度為：ur(x2.3.2.2.2.1)=0.005/25=0.020%2.3.2.2.2.2溶液溫度與校準溫度不同產生的標準不確定度ur（x2.3.2.2.2.2）假設溶液與校準溫度的差異為

15、77;5，容量瓶的體積為25mL，水體積膨脹系數(shù)水為(2.1×10-4)/，水的體積膨脹明顯大于玻璃的體積膨脹，因此只需考慮水的體積膨脹即可，按矩形分布，取k，則有：標準不確定度為：u（x2.3.2.2.2.2）=25×5×2.1×10-4/0.016mL 相對標準不確定度為：ur(x2.3.2.2.2.2)=0.015/25=0.064%25 mL單標線容量瓶產生的合成相對標準不確定度：ur(x2.3.2.2.2)=0.07%2.3.2.2.3標準物質濃度校正引入的不確定度ur（x2.3.2.2.3）用紫外分光光度計進行濃度校正，維生素E標準物質吸光度

16、=0.2177；紫外分光光度計的校準證書給出的測量結果示值誤差的擴展不確定度U=0.0022，k=2，屬正態(tài)分布，則有：標準不確定度為：u(x2.3.2.2.3)=0.0022/2=0.0011相對標準不確定度為：ur(x2.3.2.2.3)=0.0011/0.2177=0.506%由上面分析可得，維生素E標準物質引起的相對標準不確定度為：= =0.52%2.3.2.3維生素E樣品引起的標準不確定度ur(x3)2.3.2.3.1樣品稱量引起的不確定度ur（x2.3.2.3.1）用電子天平進行稱量，維生素E試樣重量m=0.2243g, 天平的校準證書給出的測量結果示值誤差的擴展不確定度U=0.3

17、mg，k=2，屬正態(tài)分布，則有：標準不確定度為：u(x2.3.2.2.2)=0.3/2=0.00015g相對標準不確定度為：ur(x2.3.2.3.1)= 0.00015/0.2243=0.067%2.3.2.3.2 樣品處理引起的不確定度ur（x2.3.2.3.2）將樣品處理引起的不確定度量化，用回收率來整體評價樣品處理過程的不確定度。分析程序的回收率在實驗室確認使用標準加入法分析。表2收集了實驗室對含維生素E樣品中的維生素E標準回收率進行10次分析的結果。表2 維生素E標準回收率分析結果測量組分加入標準的量/mg測量次數(shù)nRec平均回收率/%S2標準偏差/%維生素E1.5331098.76

18、0.6由上面分析可得，維生素E樣品引起的相對標準不確定度為：= =0.20%2.3.2.4液相色譜儀引起的不確定度ur(x4)檢測結果的重現(xiàn)性主要受操作人員的樣品處理過程的一致性，樣品的均勻性和儀器本身的性能因素的影響，該不確定度屬A類評定，采用同一樣品進行重復實驗進行評估，其中的測量結果如下表3：表3重復進樣5次峰面積的測量值序號峰面積A14355.4277324374.0297934353.9477544362.0668954359.55566平均值4361.00556單次測量結果的標準偏差：標準不確定度為： u(x2.3.2.4)=7.125/=3.187相對標準不確定度為：=3.187

19、/4361.00556=0.08%表4相對標準不確定度一覽表名稱不確定度來源類型相對標準不確定度值ur (x1)方法總重復性A0.02%ur (x2)維生素E標準物質B0.52%ur (x3)維生素E樣品A0.20%ur (x4)液相色譜儀A0.08%2.4合成標準不確定度評定由表3中各相對不確定度合成ucr(x)=u2r(x1)+u2r(x2) + u2r(x3) + u2r(x4)1/2 =(0.02%)2+(0.52%)2+(0.20%)2+(0.08%)21/2=0.564%3 擴展不確定度評定擴展不確定度可由合成標準不確定度乘以包含因子，取置信概率p=95%,則k=2，因此維生素E樣品中的維生素E含量測定的相對擴展不確定度為： U=k×ucr(x)=2×0.57%=1.14%4 測量不確定度的報告與表示維生