鱷膽素聯(lián)合阿霉素對人肝癌細胞SMMC-7721抑制作用

1、鱷膽素聯(lián)合阿霉素對人肝癌細胞 SMMC-7721抑制作用鄧軼韜1，丁玉梅1，李華亮1，2，董欣2，沈雪瑩1，陳清西1*（1廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廈門361005；2廣州鼉龍生物技術(shù)開發(fā)有限公司）摘要 本文研究了鱷膽素（crocodile choline）聯(lián)合阿霉素（doxorubicin）對人肝癌細胞SMMC-7721的體外抑制作用以不同濃度鱷膽素、阿霉素單用藥組和兩藥聯(lián)合用藥組作用SMMC-7721細胞，應(yīng)用MTT法和集落形成實驗檢測細胞增殖抑制、流式細胞儀分析細胞周期分布、Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達結(jié)果顯示鱷膽素、阿霉素單藥與聯(lián)合均能抑制SMMC-7721細胞的增殖，且呈

2、劑量依賴效應(yīng)，兩藥聯(lián)合有協(xié)同效應(yīng)（P0.01）集落形成實驗中對照組、鱷膽素單用藥組和阿霉素單用藥組的克隆形成率分別為88%、30.8%和28.5%，而兩藥聯(lián)合后幾乎沒有克隆形成，表明兩藥聯(lián)合有顯著的差異細胞周期分析顯示藥物處理組出現(xiàn)S期阻滯，聯(lián)合組與對照組相比，S期細胞含量由12%上升到59%；各組均能誘導(dǎo)SMMC-7721細胞凋亡，并以聯(lián)合組效果更佳，細胞核經(jīng)Hoechst染色出現(xiàn)濃染致密的固縮形態(tài)和強藍色熒光;細胞中促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)誘導(dǎo)細胞凋亡研究結(jié)果表明鱷膽素與阿霉素聯(lián)合對人肝癌細胞SMMC-7721有顯著的抑制作用，作用效果具有協(xié)同效應(yīng)本研究有望為肝癌的聯(lián)合用藥治療提供理論依據(jù)

3、關(guān)鍵詞：鱷膽素；阿霉素；聯(lián)合用藥；肝癌；細胞凋亡中圖分類號：Q 3561 文獻標識碼：A* 通訊作者：chenqx （陳清西）基金項目： 廈門市科技計劃項目：3502Z20133009，國家自然科學(xué)基金委基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金科研訓(xùn)練及科研能力提高項目(廈門大學(xué))（基金號：No.J1310027）和廈門大學(xué)生物學(xué)科拔尖計劃項目資助 肝癌在全球范圍內(nèi)是一種發(fā)生率和致死率都很高的癌癥，隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展，由于水資源污染等造成肝癌的發(fā)生率居高不下，在中國的東南沿海一帶更是如此1肝癌的臨床治療主要是手術(shù)、放化療與中藥結(jié)合的方法治療阿霉素是臨床常用的化療藥物，也是肝癌的推薦用藥但阿霉素對正常細胞會產(chǎn)生一定

4、的殺傷作用，造成較嚴重的心臟毒性和骨髓抑制作用，在臨床上的應(yīng)用受到了一定的限制2藥物聯(lián)合可以減少用藥劑量和增加療效，從而降低藥物的副作用，并且能避免機體對其產(chǎn)生耐受目前已有關(guān)于阿霉素聯(lián)合其他化療藥物抑制肝癌細胞的報道3, 4，但是通過添加另一種化療藥物來降低阿霉素的用量可能會來給機體其他的傷害，阿霉素與天然藥物的聯(lián)合將可能真正降低化療藥物的副作用隨著中藥研究的發(fā)展，動物膽汁在醫(yī)藥上的應(yīng)用愈發(fā)受到重視，中國藥典已收載的動物膽汁制劑達到20多種鱷膽汁是由20種以上的膽汁酸、膽汁醇及中性的甾醇類組成5，本實驗室利用生化方法從暹羅鱷膽汁中分離提取到的有效成分命名為鱷膽素，對膽管癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤

5、細胞有良好的抑制作用6兩者聯(lián)合使用還未見報道本研究探討鱷膽素、阿霉素單獨及聯(lián)合作用對肝癌SMMC-7721細胞的體外抑制作用，初步探索兩藥單獨及聯(lián)合作用時的藥效變化，以期減少化療藥物的用量，降低對機體的毒副作用，達到增效減毒目的，為藥物的臨床聯(lián)合應(yīng)用提供理論依據(jù)和支持1 材料與方法1.1 材料鱷膽素由本實驗室從暹羅鱷膽汁中提取分離，用100% DMSO溶解，-20 保存，實驗時稀釋，DMSO終濃度1%；阿霉素購自上海生工生物工程有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；胎牛血清購自Hyclone公司； MTT購自Sigma公司；人肝癌SMMC-7721細胞由廈門華僑亞熱帶

6、植物引種園惠贈1.2 實驗方法1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組人肝癌SMMC-7721細胞培養(yǎng)在內(nèi)含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基（pH 7.2），37 ，體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗根據(jù)對細胞處理的藥物種類及濃度進行分組，即對照組，鱷膽素、阿霉素單獨用藥組和鱷膽素、阿霉素聯(lián)合用藥組鱷膽素單獨用藥組的終濃度依次為5、10、15、20 g/mL；阿霉素單獨用藥組的終濃度依次為0.1、0.2、0.4、0.8和1.0 g/mL;聯(lián)合組用藥組的最終濃度依次為：阿霉素（0.2、0.4、0.8和1.0 g/mL）+鱷膽素（5 g/mL），阿霉素（0.

7、2、0.4、0.8和1.0 g/mL）+鱷膽素(10 g/mL)和阿霉素（0.2、0.4、0.8、10 g/mL）+鱷膽素（15 g/mL）1.2.2 MTT法測定鱷膽素和阿霉素單獨或聯(lián)合作用對SMMC-7721細胞增殖的影響用MTT法測定鱷膽素單藥組、阿霉素單藥組和兩藥聯(lián)合組對SMMC-7721細胞的抑制率取對數(shù)生長期的細胞以6×103/孔密度接種于96孔板，每個濃度設(shè)置4個重復(fù)，每孔加入200 L細胞懸液，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入2 L不同濃度的藥液，對照組加入相同體積的DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入20 L MTT溶液（5mg/mL），培養(yǎng)4 h，棄上清液，

8、每孔再加入150 L二甲基亞砜（DMSO），37 充分溶解后，用酶標儀測定吸光度，測定波長為490 nm按下式計算抑制率：抑制率（%）=（對照組OD值實驗組OD值）/對照組OD值×100%1.2.3 藥物聯(lián)合作用評價采用金氏公式q=Eab/(Ea+Eb)-Ea×Eb判斷兩藥不同藥物濃度相互作用是否具有協(xié)同作用，式中Eab為合用藥物的抑制率，Ea、Eb分別為a藥、b藥單獨用藥的抑制率若q值在0.851.15內(nèi)為兩藥合用單純相加，q值1.15為有協(xié)同作用，q值0.85則表示兩藥合用有拮抗作用1.2.4 集落形成實驗取對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞，分別以每孔2000個細胞接

9、種于60 mm的培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后，分別用鱷膽素、阿霉素及兩者聯(lián)合處理細胞24 h;接著撤走藥物刺激，用含10%胎牛血清的正常RPMI培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周除去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，無水甲醇固定，結(jié)晶紫染色，統(tǒng)計集落形成數(shù)并拍照1.2.5 Hoechst33258熒光染色觀察取對數(shù)生長期的肝癌SMMC-7721細胞接種于6孔板中，每孔含多聚賴氨酸處理過的蓋玻片，細胞貼壁后加入藥物作用48h實驗分為對照組、鱷膽素及阿霉素單藥組、鱷膽素和阿霉素聯(lián)合組取長有對照組細胞核處理組細胞的爬片，預(yù)熱的PBS洗3次，然后用固定液（甲醇：乙酸 = 3:1）固定10 min，PBS洗3次，滴加10 µg

10、/mL Hoechst 33258染液室溫避光孵育10 min，PBS洗3次，稍微晾干，用含有抗淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照1.2.6 細胞周期測定將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的肝癌SMMC-7721細胞按1×105 ml-1接種于100 mm 培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后加入藥物藥物處理24 h后收集細胞，4 800 r/min離心5 min，PBS洗2次后加入 -20 預(yù)冷的體積分數(shù)為70%乙醇固定，4 過夜細胞上機檢測前低速離心除去乙醇，PBS洗滌2次，每管分別加入500 L PBS重懸細胞，然后加入10 L 10 mg/mL RNase A，37孵育30 min,轉(zhuǎn)入冰浴，加

11、入25 L 碘化丙啶（PI）染液 (10 mg/mL)，染色30 min,300目絹篩過濾，于EPICS XL型流式細胞儀中進行檢測，所得數(shù)據(jù)用ModFit LT 3.3軟件進行細胞周期分析1.2.7 細胞內(nèi)總蛋白的提取及免疫印跡取處于對數(shù)生長期的肝癌SMMC-7721細胞，經(jīng)過不同濃度的藥物處理48 h后，離心（1000 r/min, 5 min）收集貼壁和懸浮的所有細胞，PBS洗1次，離心，棄上清，加入預(yù)冷的細胞裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑，混勻，冰上裂解30 min,每10 min漩渦震蕩一次；4 , 13000 r/min,離心10 min，取上清用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定總

12、蛋白濃度，用PBS調(diào)節(jié)蛋白濃度使每管總蛋白濃度相同每管加入等體積的5×Loading buffer上樣緩沖液，沸水中煮沸5 min使蛋白變性，取20 µg總蛋白上樣，12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉，TBST（10 mmol/L Tris-HCl, pH7.2, 150 mmol/L NaCl，0.05% Tween 20）緩沖液洗膜3次，每次10 min，一抗孵育過夜，相同方法洗膜，加入HRP標記的二抗孵育1 h，相同方法洗膜后，滴加ECL化學(xué)發(fā)光底物于PVDF膜上，在暗室中進行膠片曝光、顯影和定影2 結(jié)果與分析2.1

13、 MTT實驗結(jié)果MTT實驗結(jié)果顯示，鱷膽素、阿霉素單藥組和聯(lián)合作用組對SMMC-7721細胞都有增殖抑制作用，且呈濃度依賴性，藥物濃度越高，抑制作用越強單獨作用24 h時，鱷膽素對SMMC-7721細胞的IC50 = 22.28 g/mL，阿霉素對其IC50 = 1.17 g/mL兩者聯(lián)合作用時，低濃度鱷膽素（5 g/mL）與不同濃度阿霉素合用，其聯(lián)合作用呈拮抗作用；中濃度及高濃度鱷膽素與不同濃度阿霉素組合，其聯(lián)合作用由相加轉(zhuǎn)變到協(xié)同作用由表1可以看出，鱷膽素為15 g/mL、阿霉素為0.4 g/mL時，兩者協(xié)同作用最為顯著，達到相同作用效果時能顯著降低阿霉素的濃度，降低阿霉素所產(chǎn)生的毒副作用

14、后續(xù)實驗均采用這一濃度組合（鱷膽素15 g/mL、阿霉素為0.4 g/mL）表1 鱷膽素與阿霉素聯(lián)合作用對肝癌SMMC-7721細胞的增殖抑制作用Table. 1 Inhibitory effect of combined treatment with crocodile choline and doxorubicin on the proliferation of SMMC-7721 cells組別鱷膽素g/mL阿霉素g/mL抑制率(%)Q值100025012.43±2.98310033.40±4.32415046.24±6.89500.26.70±3

15、.07600.412.54±6.52700.828.72±7.73801.042.43±2.57950.214.46±6.351.391050.425.36±4.010.621150.827.33±5.920.731251.032.80±5.580.6613100.233.95±2.940.9014100.440.05±6.040.9615100.849.47±6.080.9416101.053.47±3.260.8717150.255.50±5.491.1118150.46

16、7.54±2.361.2719150.876.57±4.731.2420151.080.81±2.961.172.2 鱷膽素與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對細胞集落形成能力的影響集落形成實驗是一種考察腫瘤細胞藥物敏感性的長期實驗方法，實驗周期為兩周.首先將細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，每皿約2000個細胞,藥物處理24 h后撤去藥物，繼續(xù)培養(yǎng)兩周，最后吉姆薩染色并拍照.實驗結(jié)果（圖1）顯示，SMMC-7721細胞對照組形成的克隆密集且較大，鱷膽素單用藥組能看到較小的克隆，數(shù)量明顯比對照組減少，阿霉素單用藥組結(jié)果相似，聯(lián)合用藥組則幾乎看不到克隆從柱狀圖可以看出，對照組細胞克隆形成

17、率為88%，鱷膽素單用藥組的克隆形成率為30.8%，阿霉素單用藥組的克隆形成率為28.5%，聯(lián)合用藥組幾乎沒有克隆形成，各實驗組和對照組克隆形成率比較，有極顯著性差異圖1 鱷膽素與阿霉素單獨或聯(lián)合用藥對SMMC-7721細胞克隆形成能力的影響Fig. 1 Effect of crocodile choline with or without doxorubicin on the colony formation of SMMC-7721 cells2.3 鱷膽素與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對細胞周期分布的影響應(yīng)用流式細胞儀檢測鱷膽素與阿霉素單獨或聯(lián)合應(yīng)用對SMMC-7721細胞周期分布的影響，采用ModF

18、it LT 3.3軟件對細胞周期進行分析實驗結(jié)果總結(jié)于圖2、表2從圖2可以看出，沒有藥物處理時，SMMC-7721細胞主要處于G0/G1期；當細胞用鱷膽素和阿霉素單獨處理及聯(lián)合處理時，細胞周期發(fā)生顯著變化，細胞處于G0/G1期數(shù)量逐漸減少，S期細胞數(shù)量顯著增加，G2/M期細胞數(shù)量變化不大由表2可以看出，處理組與對照組相比，鱷膽素作用24 h后，S期細胞數(shù)量增加了5.27%；阿霉素作用24 h后，細胞S期數(shù)量顯著增加，從12.30%增加到55.91%，增加了43.61%,與對照組相比有顯著差異；聯(lián)合用藥組作用24 h后細胞也出現(xiàn)了S期阻滯，S期細胞從12%增加到59%，與對照組相比有顯著差異圖2

19、 鱷膽素與阿霉素單獨或聯(lián)合作用SMMC-7721細胞24 h后對細胞周期分布的影響Fig. 2 FACS analysis of cell cycle of SMMC-7721 cells treated with Crocodile choline with or without Doxorubicin for 24 h表2 不同處理組對SMMC-7721細胞周期影響的數(shù)據(jù)分析Table. 2 Data analysis of cell cycle distribution of SMMC-7721 cells after treated with different groups for

20、24 hSpecimensG0/G1（%）S（%）G2/M（%）Control82.7712.304.94Crocodile choline75.217.577.24Doxorubicin39.7155.914.38Combined Two29.0759.0311.912.4 細胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察SMMC-7721細胞經(jīng)過鱷膽素與阿霉素單獨或聯(lián)合處理48 h后，Hochest33258染色，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，結(jié)果如圖3所示從圖中可以看出，對照組細胞的細胞核完整，邊緣清晰整齊，發(fā)出彌散均勻的微弱淡藍色熒光，細胞核未見濃縮致密染色；鱷膽素單獨處理組與對照組相比，有部分細胞核出現(xiàn)變形，皺縮，

21、細胞核內(nèi)呈現(xiàn)出濃致密的顆粒狀強藍色熒光；阿霉素單獨處理組與對照組相比，部分細胞核變形，核斷裂，出現(xiàn)凋亡小體；聯(lián)合處理組細胞數(shù)量明顯減少，絕大多數(shù)細胞核出現(xiàn)核固縮，產(chǎn)生凋亡小體，細胞都發(fā)出強藍色熒光，凋亡特征明顯以上結(jié)果表明，鱷膽素和阿霉素都能誘導(dǎo)SMMC-7721細胞發(fā)生凋亡，兩者聯(lián)合應(yīng)用效果顯著高于單藥組A: Control; B: Crocodile choline;C: Doxorubicin; D: Cro+Dox.圖3 Hoechst 33258染色觀察鱷膽素與阿霉素單用或聯(lián)用后對SMMC-7721細胞的形態(tài)學(xué)變化（48 h, ×200）Fig. 3 Effect of c

22、rocodile choline with or without doxorubicin on the morphology changes of SMMC-7721 cells by staining with Hoechst 332582.5 鱷膽素與阿霉素聯(lián)合作用對Bax和Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白表達的影響采用Western blot實驗檢測SMMC-7721細胞中Bax和Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白的表達，實驗結(jié)果如圖4所示從圖4可以看出，在內(nèi)參蛋白-actin含量一致的情況下，與對照組相比，鱷膽素、阿霉素單獨作用促凋亡蛋白Bax的表達都有所增加，兩藥聯(lián)合組Bax的表達顯著增加，與對照組相比有

23、顯著差異但是無論鱷膽素、阿霉素單獨作用還是聯(lián)合作用，對抑凋亡蛋白Bcl-2的表達幾乎沒有影響說明鱷膽素和阿霉素聯(lián)合作用促進SMMC-7721細胞凋亡是通過上調(diào)Bax蛋白表達來實現(xiàn)，兩者聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)A: Control; B: Crocodile choline;C: Doxorubicin; D: Cro+Dox圖4 鱷膽素與阿霉素單獨或聯(lián)合作用對Bax和Bcl-2蛋白表達情況的影響Fig. 4 Effect on the expression of Bax and Bcl-2 protein in SMMC-7721 cells3 討論肝癌作為目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，

24、被稱為“癌中之王”近年來，因我國乙肝病毒感染患者數(shù)量遞增，肝癌的發(fā)病率大增，治療方式仍以手術(shù)為主，術(shù)后輔助化療但化療藥物選擇性差，對正常細胞也有殺傷作用，往往毒副作用很強多數(shù)化療藥物能引起胃腸道不適、脫發(fā)、骨髓抑制等，病人不僅要承受病痛的折磨，還要忍受治療藥物所產(chǎn)生的不適，許多患者往往會因為耐受不住化療藥物對機體的毒副作用而放棄治療因此，尋求新的更有效的肝癌治療方法和抗肝癌藥物組方是現(xiàn)在醫(yī)藥界面臨的重要挑戰(zhàn)之一阿霉素已經(jīng)在臨床上用于治療肝癌，但由于其具有心臟毒性，在使用時受到了很大的限制鱷膽素為本實驗室從鱷膽汁中提取得到的具有抗腫瘤功效的天然產(chǎn)物，毒性低，并且對肝癌細胞SMMC-7721具有明

25、顯的增殖抑制作用本文將不同濃度的鱷膽素與阿霉素聯(lián)合使用，MTT法測定其對肝癌細胞的增殖抑制作用，并以金氏公式評價不同濃度兩藥組合的效果，篩選出了一個具有協(xié)同作用的抗肝癌組方：15 g/mL鱷膽素和0.4 g/mL阿霉素隨后以集落形成實驗對該組方進行了驗證，結(jié)果表明以上濃度的兩藥具有協(xié)同作用與MTT法不同，集落形成實驗是一種考察腫瘤細胞藥物敏感性的長期實驗方法，周期為 14 天，期間經(jīng)過多個細胞分裂周期；其次藥物干預(yù)24 h后撤藥繼續(xù)培養(yǎng)，不僅可以看出藥物對腫瘤細胞增殖的抑制能力，在一定程度上還可以看出藥物處理對細胞恢復(fù)能力的影響，而這種恢復(fù)能力可能是癌癥治療后復(fù)發(fā)的動力兩組實驗均表明該組方能協(xié)

26、同抑制肝癌細胞的增殖S期是DNA合成期，細胞做好合成DNA的準備后，由G1期進入S期，隨即開始DNA的合成DNA復(fù)制完成后，細胞即進入G2期DNA順利完成復(fù)制、S期周期蛋白的正常表達以及周期蛋白-CDK復(fù)合物的形成等都是細胞進入G2期所必需的，一旦出現(xiàn)異常，細胞就不可能從S期進入G2期PI單染結(jié)果顯示肝癌SMMC-7721細胞經(jīng)兩藥聯(lián)合處理后S期的比例明顯增多，表明大量的細胞被阻滯在S期這一結(jié)果與史衛(wèi)紅7等已報道的索拉菲尼與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對HepG2細胞周期影響的結(jié)果一致聯(lián)合組方將SMMC-7721細胞阻滯在S期可能與DNA復(fù)制以及CDK激酶的活性有關(guān)，具體機制需要通過測定相關(guān)蛋白的表達量等后

27、續(xù)試驗探究Hoechst 33258染色結(jié)果顯示聯(lián)合組的細胞經(jīng)歷了細胞凋亡的過程細胞增殖過盛和凋亡抑制被認為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵多種化療藥物均能引起腫瘤細胞的凋亡通過誘導(dǎo)凋亡治療腫瘤是目前的一個研究熱點8細胞凋亡是多基因控制的程序化過程與細胞凋亡相關(guān)的基因包括Bcl-2蛋白家族，P53蛋白質(zhì)家族等 Western blot實驗結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)用后，Bcl-2的表達量幾乎不變，而Bax的表達量顯著上升Bax和Bcl-2同屬于Bcl-2蛋白家族，分別具有促進凋亡和抑制凋亡的功能，在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用9兩藥聯(lián)用后，高表達的Bax可能與Bcl-2 形成Bax/Bcl-2異二聚體，抵消B

28、cl-2的抑凋亡作用；或者過量的Bax寡聚化，插入線粒體外膜上，形成Bax離子通道，離子流入線粒體，細胞色素C轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中，激活caspase通路，最終引發(fā)細胞凋亡從鱷膽汁中分離制得的鱷膽素，屬于天然動物提取物，它不同于常見的化療藥物，無毒副作用體外實驗顯示鱷膽素與阿霉素聯(lián)用能協(xié)同抑制肝癌細胞的增殖，所得的聯(lián)合組方亦可作為后續(xù)動物實驗用藥劑量的參考本研究表明一定濃度的鱷膽素可增強阿霉素對腫瘤細胞的殺傷作用，從而避免大劑量應(yīng)用阿霉素引發(fā)的毒副作用，達到阿霉素減毒增效的目的這為天然動物提取物與化療藥物的聯(lián)合抗肝癌提供了新的思路和實踐，為臨床上肝癌的藥物聯(lián)合治療提供了理論支持參考文獻1 ElSer

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34、tocellular Carcinoma Cells SMMC-7721DENG Yi-tao1, DING Yu-mei1, Li Hua-liang1, DONG xin2, SHENG Xu-ying2, CHEN Qing-xi1*( School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China; GuangZhou TuoLong Biological Technology Co., Ltd., GuangZhou 510801, China)Abstract: In this paper, we studied t

35、he effect of crocodile choline with doxorubicin on proliferation of human hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721 in vitro. SMMC-7721 cells were treated with different concentration of crocodile choline alone or combined with doxorubicin, then used MTT assay, colony formation, flow cytometry analysis, Hoechst33258 staining, western blot to detect re