原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

1、原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師：費(fèi)曉方指導(dǎo)教師：費(fèi)曉方20052005年年5 5月月v掌握無(wú)菌操作技術(shù)。掌握無(wú)菌操作技術(shù)。v了解小鼠解剖操作技術(shù)。了解小鼠解剖操作技術(shù)。v了解原代細(xì)胞培養(yǎng)的一般方法與步驟。了解原代細(xì)胞培養(yǎng)的一般方法與步驟。v了解培養(yǎng)細(xì)胞的消化分散。了解培養(yǎng)細(xì)胞的消化分散。v了解細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。了解細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。v了解倒置顯微鏡的使用。了解倒置顯微鏡的使用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅簩?shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅簩?shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：v原代細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)v是將機(jī)體內(nèi)的某組織取出，分散成單細(xì)胞，是將機(jī)體內(nèi)的某組織取出，分散成單細(xì)胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長(zhǎng)、繁在人工條件下培養(yǎng)使其生存

2、并不斷生長(zhǎng)、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細(xì)胞的分殖的方法。借助這種方法可以觀察細(xì)胞的分裂繁殖、細(xì)胞的接觸抑制、以及細(xì)胞的衰老，裂繁殖、細(xì)胞的接觸抑制、以及細(xì)胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。死亡等生命現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：v動(dòng)物的選擇：動(dòng)物的選擇： 選擇大約一半足孕時(shí)間的胚胎，選擇大約一半足孕時(shí)間的胚胎，1013天齡胚胎含有最大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細(xì)胞，天齡胚胎含有最大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞可從這些細(xì)胞衍生獲得。成纖維細(xì)胞可從這些細(xì)胞衍生獲得。 每組小鼠胚胎每組小鼠胚胎1個(gè)個(gè)實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料：v每組的超凈臺(tái)中有以下物品：每組的超凈臺(tái)中有以下物品：v1. 50ml 配制好的配制好的R

3、PMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)液1瓶；瓶；8ml小牛小牛血清（血清（FCS) 1瓶；瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶 1瓶；瓶；PBS(-)1 瓶瓶v2. 100ml滅菌燒杯滅菌燒杯2個(gè)；個(gè)；v3、50ml離心筒離心筒2個(gè)個(gè)v4、滅菌培養(yǎng)皿、滅菌培養(yǎng)皿1個(gè)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶個(gè)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶1個(gè)個(gè)v4、1ml ，200l移液器各移液器各1支；槍頭盒支；槍頭盒2個(gè)；無(wú)菌個(gè)；無(wú)菌玻璃攪拌棒玻璃攪拌棒1個(gè)個(gè)v5、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、細(xì)胞計(jì)數(shù)板1塊；塊；v6、滅好菌的鑷子、滅好菌的鑷子1把，剪刀把，剪刀1把；把；v7、酒精燈、酒精燈1臺(tái)；臺(tái)；試驗(yàn)操作步驟：試驗(yàn)操作步驟：v1)胚胎的分離。適用哺乳動(dòng)物胚胎的分離。適用

4、哺乳動(dòng)物(倉(cāng)鼠、小鼠和大鼠倉(cāng)鼠、小鼠和大鼠)v a采用認(rèn)可的方案處死嚙齒動(dòng)物。采用認(rèn)可的方案處死嚙齒動(dòng)物。 v b立即在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)用立即在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)用70乙醇擦洗整個(gè)動(dòng)物。乙醇擦洗整個(gè)動(dòng)物。v c用無(wú)菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用用無(wú)菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無(wú)菌鑷子將皮膚扯向后腿。無(wú)菌鑷子將皮膚扯向后腿。v d用另一無(wú)菌的剪刀和鑷子切開(kāi)腹部，取出含有胚胎的用另一無(wú)菌的剪刀和鑷子切開(kāi)腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿上。子宮，置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿上。v e剔除胚胎周?chē)陌ぃ瑢⑴咛シ庞跓o(wú)菌的含有無(wú)菌剔除胚胎周?chē)陌?，將胚胎放于無(wú)菌的含有無(wú)菌PBS的的100

5、ml燒杯中。燒杯中。v f漂洗胚胎，去掉漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。液清亮為止。v2)將將12個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移至一個(gè)小的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用新的個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移至一個(gè)小的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用新的無(wú)菌剪刀小心地絞碎胚胎，無(wú)菌剪刀小心地絞碎胚胎， 用用PBS漂洗。漂洗。v3)在無(wú)菌狀態(tài)下，將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一在無(wú)菌狀態(tài)下，將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一50ml 的無(wú)菌離的無(wú)菌離心筒中心筒中, 加入加入40ml 0.25的無(wú)菌胰蛋白酶的無(wú)菌胰蛋白酶,用攪拌棒輕輕用攪拌棒輕輕攪動(dòng)攪動(dòng) 。v4)在溫暖的環(huán)境中或置于在溫暖的環(huán)境中或置于37 C培養(yǎng)箱中輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)箱中輕輕搖動(dòng)1

6、5分分鐘。鐘。v5)讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含有懸浮讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含有懸浮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)移至一無(wú)菌細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)移至一無(wú)菌50ml的離心管中，該管內(nèi)按照的離心管中，該管內(nèi)按照每每10ml上清加入上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以滅活小牛血清的比例加入牛血清以滅活,胰蛋白酶。胰蛋白酶。v6)6)加人新鮮胰蛋白酶溶液加人新鮮胰蛋白酶溶液( (見(jiàn)前述步驟見(jiàn)前述步驟) )于含有殘留未消化組于含有殘留未消化組織塊的原來(lái)的織塊的原來(lái)的50ml50ml離心筒中，重復(fù)步驟離心筒中，重復(fù)步驟4 4和和5 5。v7)7)離心混合的細(xì)胞懸液，離心混合的細(xì)胞懸液，1200r1

7、200rrainrain，5 5分鐘，棄上清。分鐘，棄上清。v8)8)用新鮮的無(wú)菌用新鮮的無(wú)菌PBSPBS重懸沉淀的細(xì)胞，按步驟重懸沉淀的細(xì)胞，按步驟7 7再次離心。再次離心。v9)9)用用PBSPBS反復(fù)洗滌細(xì)胞直至上清清亮為止。反復(fù)洗滌細(xì)胞直至上清清亮為止。v10)10)用含有用含有1010牛血清和抗生素牛血清和抗生素( (如青霉素、鏈霉素如青霉素、鏈霉素) )的的DMEM(GIBCODMEM(GIBCOBRL)lOmlBRL)lOml再懸沉淀，并使終體積為再懸沉淀，并使終體積為20ml20ml。v11)11)讓殘留的大塊未破碎的組織或特殊顆粒物質(zhì)沉降?？刹勺寶埩舻拇髩K未破碎的組織或特殊顆粒物質(zhì)沉降。可采用數(shù)層無(wú)菌紗布過(guò)濾細(xì)胞懸液以去除任何殘留的細(xì)胞塊。用數(shù)層無(wú)菌紗布過(guò)濾細(xì)胞懸液以去除任何殘留的細(xì)胞塊。v12)為確定現(xiàn)有細(xì)胞濃度，加入為確定現(xiàn)有細(xì)胞濃度，加入0.2ml細(xì)胞懸液于細(xì)胞懸液于1.8ml 1醋酸溶液中以裂解紅細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。醋酸溶液中以裂解