生物技術(shù)專業(yè)復(fù)習(xí)資料(西南民大版)-基因工程學(xué)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上 基因工程學(xué)復(fù)習(xí)1、 基因工程：利用體外重組或PCR擴增技術(shù)從某種生物基因中分離出感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經(jīng)過一系列切割，加工修飾，連接反應(yīng)形成重組DNA分子，再將其轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，以期獲得基因表達(dá)的過程。2、 生物技術(shù)概念及特征：利用活體生物或它們的產(chǎn)物來生產(chǎn)或修飾一種產(chǎn)品，以改良植物和動物，或發(fā)展具有特殊用途的微生物的技術(shù)。特征：21世紀(jì)最具有潛力的高新技術(shù)；多學(xué)科、交叉、綜合的技術(shù)；影響最為深遠(yuǎn)最廣泛的技術(shù)。3、 限制性內(nèi)切酶的定義、命名、識別序列的特點、末端類型：定義：廣義上指限制修飾系統(tǒng)中的限制酶，狹義指型限制酶。命名：菌種-菌系

2、編號-分離順序。識別序列特點：長度4-8，一般6個堿基，大多回文結(jié)構(gòu)，切割大多在DNA內(nèi)部，限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)5-P和3-OH。末端類型：產(chǎn)生匹配黏端、平末端、非對稱末端。4、 異源同序酶：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶5、 核酸酶S1的特點及用途：特點：糖蛋白（含糖量8%），最佳pH4.5，對熱穩(wěn)定，抗變性劑。用途：a.基因突變-缺失，常與外切酶，如Exo、Bal31連用 b.DNA定序分析 c.S1作圖法 d.基因結(jié)構(gòu)分析 e.tRNA結(jié)構(gòu)分析。 6、 分子克隆載體定義、特征：定義：一類可供外源DNA插入并攜帶重組DNA分子進(jìn)入適當(dāng)宿主細(xì)胞的DNA分子。特點：a.

3、至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制 b.至少應(yīng)有一個克隆位點，以供外源DNA插入 c.至少應(yīng)有一個遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞。7、 質(zhì)粒的定義、特點：定義：質(zhì)粒是染色體外的遺傳因子，能進(jìn)行自我復(fù)制（但依賴宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)），大多數(shù)為超螺旋的雙鏈共價閉合環(huán)狀DNA分子，少數(shù)為線狀。特點：a.質(zhì)粒DNA復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān) b.質(zhì)粒DNA以超螺旋形式存在 c.質(zhì)粒DNA可以接合轉(zhuǎn)移 d.質(zhì)粒的不相容性和不相容群 e.質(zhì)粒DNA的消除-化學(xué)和物理方法 f.質(zhì)粒的整合-F因子又可整合到E.coli染色體中。8、 質(zhì)粒載體的種類、特點及用途：A.普通型

4、載體：特點：至少有一個以上的克隆位點和兩個標(biāo)記基因，其中一個用于轉(zhuǎn)化體選擇，另一個用于重組子的檢測 用途：基因組或cDNA文庫的構(gòu)建，次克隆或限制酶譜分析，外源DNA擴增 B.表達(dá)型載體：特點：基因的啟動子序列和終止子序列；一般無檢測標(biāo)記基因；克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）；重組分子用凝膠電泳檢出（依賴分子量差異）。 類型：型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列+啟動子）+終止子 型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)終止子：+翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子）+終止子 型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)+信號肽鏈編碼區(qū)+終止子。用途：表達(dá)外源基因以產(chǎn)生大量外源基因產(chǎn)物；用于構(gòu)建cDNA文庫。9、 M13（大腸桿菌單鏈絲狀噬

5、菌體載體）噬菌體的特點、結(jié)構(gòu)、用途：特點：a.在IR區(qū)中插入一個lacZ基因，然后在該基因中逐漸構(gòu)建一個多克隆位點區(qū)，ds-DNA可用常規(guī)方法直接導(dǎo)入，ss-DNA常用感染的方法b.噬菌斑的形成用于選擇DNA導(dǎo)入的細(xì)胞，在X-Gal平板上形成的無色噬菌斑檢測重組子 結(jié)構(gòu)：環(huán)狀ssDNA，病毒顆粒呈絲狀。用途：用于點突變、DNA的核苷酸序列測定和制備單鏈DNA探針。10、 何為互補，它在載體構(gòu)建中有何作用？-半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活性，該蛋白質(zhì)分為兩部分：鏈和鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體的裝配，后者具有-半乳糖苷酶活性，只有兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，

6、該作用稱為互補作用。在載體構(gòu)建中可作為標(biāo)記基因。11、 人工染色體載體定義：用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動外源DNA片段復(fù)制的載體稱為人工染色體載體。特點：模擬了染色體的復(fù)制方式，因此都能裝載大片段DNA。用途：染色體圖譜制作、基因組測序、基因簇克隆、基因組和功能基因組的研究。12、 酵母菌人工染色體(yeast artificial chromosome, YAC)廣泛用于構(gòu)建高等動植物基因組文庫的構(gòu)建, 由YLp經(jīng)適當(dāng)改造后構(gòu)建成pYAC載體。必備元件：自主復(fù)制序列、著絲粒、兩個端粒、選擇標(biāo)記。13、 穿梭載體定義：能夠在兩類不同的宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體，主要是質(zhì)粒載體14、 整合載體定義

7、：在生物學(xué)研究和基因工程應(yīng)用中，會涉及將某個基因或某些基因插入到染色體中去的工作，承擔(dān)這部分工作的載體，可稱為整合載體。 15、 DNA的質(zhì)量評估：1）凝膠電泳 2）光密度值測定 3）限制酶切分析16、 分子雜交：分子雜交是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用于檢測混合樣品中特定核酸分子或蛋白質(zhì)分子是否存在，以及其分子量大小。17、 轉(zhuǎn)導(dǎo)：由噬菌體將細(xì)菌基因從一個細(xì)菌（供體）轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)菌（受體）的過程18、 轉(zhuǎn)化：即來自一個細(xì)菌細(xì)胞（供體）的DNA片段被另一個細(xì)胞（受體）所吸收，隨后同受體染色體一起進(jìn)行重組。19、 生物芯片：是指通過機器人自動印跡或光引導(dǎo)化學(xué)合成技術(shù)在硅片、玻璃、

8、凝膠或尼龍膜上制造的生物分子微陣列。根據(jù)分子間的特異性相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于芯片表面，以實現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。20、 基因芯片的制作簡要步驟：基因芯片又稱DNA芯片或DNA陣列，是將DNA分子固定在固相支持物上，并與標(biāo)記的樣品雜交，從而檢測樣品中mRNA分子的表達(dá)量或進(jìn)行基因突變體檢測的技術(shù)。步驟：樣品的標(biāo)記處理、芯片制作、分子雜交、信號的檢測、數(shù)據(jù)處理21、 PCR技術(shù)：即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是通過模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方法，在體外選擇性地將DNA某個特殊區(qū)域擴增出來的技術(shù)。22、 如何設(shè)計引物： 長度：至少 16bp

9、，通常為 18-30bp ，更短的引物一般會降低擴增的特異性，但會提高擴增的有效性。 引物的解鏈溫度：兩個引物之間的 Tm 值差異最好在 2-5 。對于小于 20 個堿基的引物其 Tm 值可用簡易公式計算，即 Tm=4（G+C）+2（A+T）。 對于 14-70 個核苷酸的引物可用以下公式計算。Tm=81.5+16.6（1gK+）+0.41（G+C）%-（675/N） N 表示引物的核苷酸數(shù)目， K+ 表示單價離子即鉀離子的濃度。 避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補序列（3個堿基），從而減少引物二聚體的形成以及引物內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的形成。 G+C 含量：盡量控制在 40% 至 60% 之間， 4 種堿

10、基的分布應(yīng)盡可能均勻。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，以及 T 在 3 末端的重復(fù)排列。 引物的 3 末端最好是 G 或 C ，但不要 GC 連排。23、 兩種定序方法的優(yōu)缺點：a.化學(xué)法：優(yōu)點：所有片段具有相同的標(biāo)記強度；一次可以讀出250-400個核苷酸；定序分析不需要次克??；不受二級結(jié)構(gòu)區(qū)的影響；多A區(qū)定序清楚；適合500bp或以下DNA片段的定序分析。缺點: 需限制酶圖；需放射自顯影時間較長和增感屏；DNA片段需經(jīng)凝膠純化；多嘧啶區(qū)定序不夠清楚；所用試劑為誘變劑和致癌物質(zhì)。b.酶法：優(yōu)點: 反應(yīng)簡單，易于操作；具有配套載體和宿主菌；不一定需要詳盡的限制酶圖；可采用多種方法進(jìn)行次克隆。缺點

11、: DNA帶放射強度不均勻；下游堿基閱讀困難；需要大量的次克隆和鑒定工作；二級結(jié)構(gòu)區(qū)和多C區(qū)定序困難24、 體外誘變：是對克隆化的DNA進(jìn)行誘變處理，改變其核苷酸序列，從而獲得突變基因，用于基因工程和蛋白工程的研究。25、 增變菌種：將大腸桿菌與DNA錯配矯正功能和DNA損傷修復(fù)有關(guān)的基因突變后，細(xì)胞內(nèi)突變頻率大大增加，這樣的菌株叫增變菌株。26、 基因組：單倍體細(xì)胞中的全套染色體為一個基因組。27、 基因組DNA文庫：將某種生物的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機械力量切割成一定長度范圍的DNA片段，與合適的載體體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽性菌落。28、 cDNA文庫定義、構(gòu)建步

12、驟：一定生長階段或條件的某種細(xì)胞分離到的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后再重組和增殖所產(chǎn)生的無性繁殖系的總和。步驟：a.細(xì)胞總RNA的提取和mRNA的分離 b.第一鏈cDNA合成 c.第二鏈cDNA合成（自身引導(dǎo)法、置換合成法、引導(dǎo)合成法） d.雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入 特點：基因特異性、器官特異性、代謝或發(fā)育特異性、不均勻性、各cDNA均可獲得表達(dá)29、 基因克隆篩選策略：表型篩選法、雜交篩選和 PCR 篩選、免疫篩選、酵母雙雜交系統(tǒng)30、 表型篩選法：就是根據(jù)目的基因編碼比較特殊的功能，并且其與載體作用可以在宿主菌中表達(dá)該基因，表現(xiàn)出其特殊的功能所決定的表形性狀來，這樣就很

13、容易通過導(dǎo)入的基因帶來新的功能或恢復(fù)其缺失的功能來確定目的基因。31、 遺傳作圖：采用遺傳學(xué)分析方法將基因或其它DNA順序標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。32、 物理作圖：采用分子生物學(xué)方法直接將DNA分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基因組上的實際位置。33、 基因組工程：對大片段的基因或基因簇進(jìn)行功能分析或除去非必需遺傳區(qū)域，以及對染色體進(jìn)行可控的重組。34、 細(xì)菌及酵母作為表達(dá)系統(tǒng)的比較及優(yōu)缺點：大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早、目前應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)，是分子生物學(xué)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要工具。此系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、表達(dá)產(chǎn)物容易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強以及適用范圍

14、廣等優(yōu)點；但同時該表達(dá)系統(tǒng)也有明顯的缺陷如表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì))缺少翻譯后修飾，高表達(dá)時易折疊錯誤導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物沒有活性，而且大腸桿菌本身含有內(nèi)毒素和有毒蛋白，可能混雜在終產(chǎn)物里，導(dǎo)致在醫(yī)藥方面的使用受到局限。酵母是單細(xì)胞低等真核微生物，作為表達(dá)工具有獨特的優(yōu)點，如表達(dá)產(chǎn)物可以糖基化且屬分泌型表達(dá)，有利于蛋白的分離純化，能適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需要，易培養(yǎng)、繁殖快，遺傳背景清楚，便于進(jìn)行遺傳操作；而且酵母毒性比細(xì)菌小，安全可靠，已長期廣泛應(yīng)用于釀酒和食品工業(yè)，因此酵母作為基因表達(dá)系統(tǒng)特別是在大分子真核生物基因研究方面得到日益廣泛的應(yīng)用。但是，由于通過酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白質(zhì)可能形成聚合體而影響表達(dá)效率，其信號肽加工不完全或蛋白質(zhì)的內(nèi)部降解等，可造成表達(dá)產(chǎn)物的差異，產(chǎn)生極不均一的現(xiàn)象，為表達(dá)產(chǎn)物純化和工業(yè)化生產(chǎn)帶來了困難。35、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)方式及其運行：外源基因表達(dá)的方式：1）外源基因以融合蛋白形式表達(dá)：融合表達(dá)是指目的基因與編碼具有特殊活性的多肽和蛋白質(zhì)的基因融合，構(gòu)建成一融合蛋白基因。2）構(gòu)建可分泌蛋白，分泌到胞外培養(yǎng)基中：通常位于蛋白質(zhì)N段的稱為信號肽的一段