western-blot-教學(xué)

1、SDS-PAGE & Western Blot提問：RT-PCR、WB、免疫組化、 FCM、ELISA、Bio-plex 用來 檢測什么？ 有何區(qū)別？SDS-PAGE 蛋白分析的利器；Western 既可以定性，又可以半定量,是初步鑒定蛋白質(zhì)最方便也是最通用的方法。 Western Blot又稱免疫印跡，是指將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到固相又稱免疫印跡，是指將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的抗體來檢測目的蛋白的一種方法。是載體上，而后利用相應(yīng)的抗體來檢測目的蛋白的一種方法。是檢測混合樣品中檢測混合樣品中單一特定蛋白單一特定蛋白的常用技術(shù)。的常用技術(shù)。靈敏度可以達(dá)到靈敏度可以達(dá)到1-5pg.

2、1-5pg. 研究檢測樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在研究檢測樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在 細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析 蛋白質(zhì)分子的相互作用研究蛋白質(zhì)分子的相互作用研究 Western Blot 應(yīng)用應(yīng)用 蛋白樣品制備蛋白樣品制備 SDS-PAGE 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 抗體檢測抗體檢測 化學(xué)發(fā)光成像化學(xué)發(fā)光成像蛋白樣品制備蛋白樣品制備1蛋白抽提方法蛋白抽提方法物理方法物理方法反復(fù)凍融反復(fù)凍融機(jī)械攪拌機(jī)械攪拌超聲超聲研磨研磨酶解法酶解法(裂解酶裂解酶)化學(xué)方法化學(xué)方法自溶法自溶法 去污劑去污劑總蛋白的提取總蛋白的提取材料：HT-29細(xì)胞（收集25cm培養(yǎng)瓶一瓶）試劑：RIPA蛋白抽提試劑

3、 （裂解液有多種，根據(jù)需要選擇）檢測 beta-actin，分子量43KDa注意：為防止蛋白酶對蛋白的降解，提前前需加入1x coaktail (含PMSF) ，冰中 操作。 PMSF: 絲氨酸蛋白酶抑制劑【配制方法】用異丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分裝成小份貯存于-20。如有必要可配成濃度高達(dá)17.4mg/ml的貯存液（100mmol/L）。 【注意】PMSF嚴(yán)重?fù)p害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)或通過皮膚吸收后有致命危險。 PMSF在水中不穩(wěn)定，故需在使用前再加 PMSF；PMSF低溫時會有冰晶，用時要搖勻至無結(jié)晶。1、貼壁細(xì)胞，去培養(yǎng)基，加入貼壁細(xì)胞，去

4、培養(yǎng)基，加入2ml預(yù)冷預(yù)冷的的PBS，洗洗2-3 次，最后移至次，最后移至EP管中，用濾紙管中，用濾紙棄干水分，棄干水分，25cm培養(yǎng)瓶一瓶加入培養(yǎng)瓶一瓶加入120 L配好的含多種酶抑制劑的配好的含多種酶抑制劑的RIPA裂解液，用槍裂解液，用槍頭輕輕將細(xì)胞吹頭輕輕將細(xì)胞吹散散，放在冰上裂解，放在冰上裂解20-30min，期間可以用手彈一彈管子或者振蕩數(shù)次期間可以用手彈一彈管子或者振蕩數(shù)次以使細(xì)胞裂解充分。（注意不要引起過多氣泡以免蛋白降解）。裂解完，以使細(xì)胞裂解充分。（注意不要引起過多氣泡以免蛋白降解）。裂解完，14000轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)，4離心離心15分鐘。取上清即得所需總蛋白。分鐘。取上清即得所需總

5、蛋白。組織樣品：按組織樣品：按100 mg組織加組織加1 ml的的RIPA裂解液（含酶抑制劑），用玻璃勻漿器勻漿。裂解液（含酶抑制劑），用玻璃勻漿器勻漿。冰中裂解，余同上。冰中裂解，余同上。如果有些樣品提時發(fā)現(xiàn)如果有些樣品提時發(fā)現(xiàn)粘度粘度較大（粘是因為含較大（粘是因為含核酸核酸多），可置于冰中進(jìn)行超聲數(shù)次；多），可置于冰中進(jìn)行超聲數(shù)次；或者加核酸酶以降解核酸?；蛘呒雍怂崦敢越到夂怂?。提完蛋白請分裝（分裝時一定要保證蛋白混合均勻），提完蛋白請分裝（分裝時一定要保證蛋白混合均勻），-80保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆?。注意：不要全部變性，留些為變性的蛋白置于注意：不要全部變性，留些為變性的蛋白置?80，以備

6、用。，以備用。如果是檢測磷酸化蛋白則提取時要加如果是檢測磷酸化蛋白則提取時要加磷酸酶抑制劑磷酸酶抑制劑。 在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)分子中的肽鏈結(jié)構(gòu)能與Cu2+ 絡(luò)合，將Cu2+還原成Cu+。 BCA 試劑可敏感特異地與Cu+結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色復(fù)合物。 在562nm處有高的光吸收值，顏色的深淺與蛋白濃度呈正比。 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中的蛋白濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液（蛋白樣品與上樣緩沖液（5x）按）按4:1的比例混合后，放在的比例混合后，放在100加熱器中加熱加熱器中加熱3-5min（提前開機(jī)預(yù)熱），充分變性蛋白后迅速降溫，（提前開機(jī)預(yù)熱），充分變性蛋白后迅速降溫，離心離心，一周內(nèi)要做的存至，

7、一周內(nèi)要做的存至-20，一一個月內(nèi)要做的放于個月內(nèi)要做的放于-80 冰箱冰箱。如果蛋白濃度很高的話也可以選擇蛋白上樣緩沖液（如果蛋白濃度很高的話也可以選擇蛋白上樣緩沖液（2x）。）。 SDS-PAGE21、應(yīng)用于提純過程中純度的檢測、應(yīng)用于提純過程中純度的檢測2、用于分子量的檢測、用于分子量的檢測3、蛋白濃度測定（只跑濃縮膠，用已知濃度、蛋白濃度測定（只跑濃縮膠，用已知濃度BSA對比）對比）SDS-PAGE原理原理SDS-PAGE：SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 丙烯酰胺 (A)：形成聚合物鏈 N,N-亞甲雙丙烯酰胺 (B) ：形成縱向架橋（cro

8、ss-linkage）過硫酸銨(APS，Ammonium persulfate) ：助凝劑TEMED(si)：催化劑 O CH2=CHCNH2 O O CH2=CHCNHCH2NHCCH=CH2 CONH2 CONH2 CONH CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH CONH CH2 CONH CONH2 CONH2 CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH CONH APS, TEMED( (神經(jīng)神經(jīng)毒性毒性) )1、30%丙烯酰胺儲備膠溶液丙烯酰胺儲備膠溶液 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.8) 3、1M Tris-HCl(pH 6.8)4、10% SDS 5、10%

9、過硫酸銨（過硫酸銨（AP） 6、TEMED (N,N,N,N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺)7、2 SDS電泳上樣緩沖液電泳上樣緩沖液 8、ddH2O聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.8，分離膠選擇，分離膠選擇pH8.8，選擇，選擇Tris-HCl系系統(tǒng)，具體作用后面介紹；統(tǒng)，具體作用后面介紹；TEMED與與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；：促凝作用，加速聚

10、丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，）：陰離子去污劑， 作用有四：作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊（部分）。的疏水作用、去多肽折疊（部分）。濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠5% pH6.812% pH8.8蛋白質(zhì)在進(jìn)入分離膠以前，先被濃縮成一條細(xì)線，使每個蛋白的起跑線相同，提高解析度提高解析度。pH不連續(xù)凝膠不連續(xù)緩沖液成分不連續(xù)特點：分離膠孔徑較小，通過選擇合適的凝膠濃度，可以使樣品很好的分離。 當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速

11、率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。 pH對整個制膠體系的影響是至關(guān)重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。 ddH2O 2.0ml 30%儲備膠 1.65ml 1.5M Tris-HCl (pH 8.0) 1.25ml 10% SDS 0.05ml 10% AP 0.05ml 混勻上述液體后加4 l 的TEMED SDS低溫（低溫（10）下會結(jié)晶，冬天配膠時應(yīng)注意。）下會結(jié)晶，冬天配膠時應(yīng)注意。1、清洗玻璃板，如果是第一次使用的波板，應(yīng)用洗衣粉泡，超聲，自來水沖洗完、清洗玻璃板

12、，如果是第一次使用的波板，應(yīng)用洗衣粉泡，超聲，自來水沖洗完再用蒸餾水沖洗直至不掛水珠，晾干，裝膠板，加入蒸餾水再用蒸餾水沖洗直至不掛水珠，晾干，裝膠板，加入蒸餾水 ，靜置，靜置10min觀察是否觀察是否會漏水，然后倒掉超純水，用濾紙吸干會漏水，然后倒掉超純水，用濾紙吸干，應(yīng)盡量吸干。應(yīng)盡量吸干。2、制膠（、制膠（5+2）：根據(jù)蛋白分子量大小配好分離膠：）：根據(jù)蛋白分子量大小配好分離膠：12%分離膠常用按順序加入分離膠常用按順序加入各試劑至離心管中，加各試劑至離心管中，加AP（10%）后，輕輕混勻，之后加）后，輕輕混勻，之后加TEMED迅速上膠，灌膠迅速上膠，灌膠待膠面升到綠帶中間線高度時即可，

13、然后加滿正丁醇待膠面升到綠帶中間線高度時即可，然后加滿正丁醇/乙醇乙醇封?。榱耸狗蛛x膠界封?。榱耸狗蛛x膠界面保持水平，將膠壓平，使蛋白質(zhì)分子跑時在同一水平線上；并且阻止空氣中的氧面保持水平，將膠壓平，使蛋白質(zhì)分子跑時在同一水平線上；并且阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用），讓膠自然凝固。氣對凝膠聚合的抑制作用），讓膠自然凝固。3、待分離膠完全凝固后（約、待分離膠完全凝固后（約4560 min） ，倒去正丁，倒去正丁醇醇/乙醇，乙醇，用超純水沖洗干凈，用超純水沖洗干凈，濾紙濾紙吸干吸干殘留水滴。殘留水滴。4、加入濃縮膠至溢出，插入樣品梳（稍微傾斜插入以減少氣泡的產(chǎn)生），讓膠自、加入濃縮膠至

14、溢出，插入樣品梳（稍微傾斜插入以減少氣泡的產(chǎn)生），讓膠自然凝固。然凝固。 5、收膠：膠放在電泳液、收膠：膠放在電泳液/水中于水中于4度冰箱保存，拿出來用時恢復(fù)到室溫。度冰箱保存，拿出來用時恢復(fù)到室溫。操作時要使兩玻璃對齊，左、右、底三邊無間隙操作時要使兩玻璃對齊，左、右、底三邊無間隙，尤其注意底邊平齊，以免漏膠。，尤其注意底邊平齊，以免漏膠。 未聚合的丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺具有神經(jīng)毒未聚合的丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，可通過皮膚和呼吸道吸收，要帶手套并小心性，可通過皮膚和呼吸道吸收，要帶手套并小心操作。操作。 灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放灌膠時開始可快一些，膠面快到所

15、需高度時要放慢速度，操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠慢速度，操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水或飽和正丁醇液封時要很中才不會有氣泡。加水或飽和正丁醇液封時要很慢，否則膠會被沖變型。慢，否則膠會被沖變型。 室溫室溫25下凝膠完全聚合約需下凝膠完全聚合約需30-60min。 積層/濃縮膠（4%）的配制 總體積：2ml ddH2O 1.4 ml 30%儲備膠 0.33 ml 1M Tris-HCl (pH 6.8) 0.25 ml 10%SDS 0.02 ml 10%AP 0.02 ml 混勻后 最后加TEMED 2 l 將混合液迅速加入玻璃板間隙，并立即插入梳子將混合液迅速加

16、入玻璃板間隙，并立即插入梳子插梳子時要使梳子保持水平并小心避免混入氣泡。插梳子時要使梳子保持水平并小心避免混入氣泡。由于膠凝固時體積會收縮減小，會使加樣孔變形，由于膠凝固時體積會收縮減小，會使加樣孔變形，所以在濃縮膠凝固的過程中要不斷補(bǔ)充濃縮膠溶液所以在濃縮膠凝固的過程中要不斷補(bǔ)充濃縮膠溶液使之充滿梳子間的空隙。使之充滿梳子間的空隙。 ：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml， -巰基乙醇巰基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油，甘油2.0ml，0.1%溴酚蘭溴酚蘭1.0ml，ddH2O 3.5ml。 (緩沖液中緩沖液中溴酚蘭溴酚蘭染料，使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操染料，使樣品

17、呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操作更為便利；甘油還能夠增大樣品密度，以確保樣品均勻作更為便利；甘油還能夠增大樣品密度，以確保樣品均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi)；進(jìn)入樣品孔內(nèi)；SDSSDS使蛋白變性并帶上負(fù)電荷；使蛋白變性并帶上負(fù)電荷； - -巰基乙?guī)€基乙醇還原蛋白。醇還原蛋白。) ) 蛋白樣品與上樣緩沖液（蛋白樣品與上樣緩沖液（5x）按）按4:1的比例混合后，放在的比例混合后，放在100加熱器中加熱器中加熱加熱3-5min（提前開機(jī)預(yù)熱），充分變性蛋白后迅速降溫，（提前開機(jī)預(yù)熱），充分變性蛋白后迅速降溫，離心離心，一周，一周內(nèi)要做的存至內(nèi)要做的存至-20，一個月內(nèi)要做的放于一個月內(nèi)要做的放于-80 冰箱冰箱。為了防爆

18、管可在離心管上放為了防爆管可在離心管上放 冰塊。冰塊。四、電泳四、電泳1、將膠板裝入電泳槽中，拔出樣品梳（拔出來盡量小心、將膠板裝入電泳槽中，拔出樣品梳（拔出來盡量小心,不要破壞加樣孔不要破壞加樣孔, 如有膠絲可如有膠絲可 用毛細(xì)血管槍頭挑出）用毛細(xì)血管槍頭挑出），清洗泳道清洗泳道。2、將樣品放置在冰上，融化后先離心，然后在振蕩器上混勻，上樣，上樣量、將樣品放置在冰上，融化后先離心，然后在振蕩器上混勻，上樣，上樣量10-50ug，一孔加一孔加marker，在邊緣孔中加入等體積的上樣緩沖液，在邊緣孔中加入等體積的上樣緩沖液 ，以避免邊緣效應(yīng)。，以避免邊緣效應(yīng)。3、在電泳槽內(nèi)加入足夠的電泳液，插好

19、電極，打開電泳儀電源，以、在電泳槽內(nèi)加入足夠的電泳液，插好電極，打開電泳儀電源，以60v電壓開始跑分離電壓開始跑分離膠，到分離膠時，以膠，到分離膠時，以80-120v跑膠，電泳至溴酚藍(lán)到膠的邊緣時結(jié)束。跑膠，電泳至溴酚藍(lán)到膠的邊緣時結(jié)束。注意：注意：1、電泳過程中隨時檢查內(nèi)槽的電泳液是否會漏，槽應(yīng)清洗干凈，電極棒注意不能有結(jié)晶，、電泳過程中隨時檢查內(nèi)槽的電泳液是否會漏，槽應(yīng)清洗干凈，電極棒注意不能有結(jié)晶，線不能繞。線不能繞。2、為減少小蛋白條帶的擴(kuò)散，上樣后應(yīng)盡快開始電泳；上樣總體積建議為、為減少小蛋白條帶的擴(kuò)散，上樣后應(yīng)盡快開始電泳；上樣總體積建議為10-15 L，盡量，盡量不要超過不要超過

20、25 。3、加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品、加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進(jìn)溢出。加入下一個樣品時，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。次，以免交叉污染。4、為了獲得更好的重復(fù)性，可配、為了獲得更好的重復(fù)性，可配10或或5X電泳液電泳液母液母液，用時再稀釋。，用時再稀釋。5、由于變性完的蛋白放在冰箱中會發(fā)生復(fù)性，所以每次上樣前都要進(jìn)行變性、由于變性完的蛋白放在冰箱中會發(fā)生復(fù)性，所以每次上樣前都要進(jìn)行變性分鐘。分鐘。6、電泳前可先用、電泳前可先用10V預(yù)電泳預(yù)電泳10min使條帶更平整。使條帶更

21、平整。80V100V濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠 最常見的凝膠電泳緩沖液由Tris-甘氨酸組成。緩沖液可以包含0.1%去污劑，通常是SDS。vTris-甘氨酸甘氨酸凝膠可用于分離很寬寬分子量范圍（6-200KD）的蛋白質(zhì)，并可與變性或非變性條件相容。vTris-tricine最適于分離小小分子蛋白質(zhì)（150KD），轉(zhuǎn)膜液加），轉(zhuǎn)膜液加0.1%SDS促使跑快點。促使跑快點。但是由于但是由于SDS干擾蛋白與膜的結(jié)合，故不能加太多。干擾蛋白與膜的結(jié)合，故不能加太多。一般在一般在0.025-0.1%。(SDS有助于大分子量蛋白從凝膠剝離有助于大分子量蛋白從凝膠剝離)高分子量恒流好，低分子量恒壓好，因為高分

22、子量要跑比較久，高分子量恒流好，低分子量恒壓好，因為高分子量要跑比較久，恒壓跑的話跑久電流會往下降。恒壓跑的話跑久電流會往下降。1. 稱量稱量Tris 48.4g，Na2EDTA2H2O 7.44g 于于1L燒杯中；燒杯中； 2.向燒杯中加入約向燒杯中加入約800ml去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?；去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓?3加入加入11.4ml的冰醋酸，充分?jǐn)嚢?；的冰醋酸，充分?jǐn)嚢瑁?4.用去離子水定容至用去離子水定容至1L后，室溫保存，待用。后，室溫保存，待用。 Tris-乙酸緩沖液乙酸緩沖液Towbin 緩沖液: 25mM Tris, 192mM 甘氨酸, 20% (v/v) 甲醇.Towbin

23、緩沖液+SDS: 25mM Tris, 192mM甘氨酸, 0.1% SDS, 20% (v/v)甲醇.CAPS緩沖液: 10mM CAPS, 10%甲醇.乙酸緩沖液: 0.7%乙酸Transfer mini gels for 1530 minutes at 1015 V. Large gels can be transferred for 30 minutes to 1 hour at 1525 V. Do not exceed 25 V with this instrument. A current limit (3 mA/cm2 for large gels; 5.5 mA/cm2 fo

24、r mini gels) is recommended to prevent excessive heating during the run.1) 為減少小蛋白條帶的擴(kuò)散，上樣后應(yīng)盡快開始電泳。為減少小蛋白條帶的擴(kuò)散，上樣后應(yīng)盡快開始電泳。2) 如用預(yù)染如用預(yù)染Marker，當(dāng)要分辨的蛋白到達(dá)最佳分辨區(qū)，當(dāng)要分辨的蛋白到達(dá)最佳分辨區(qū)分離膠的分離膠的2/3處處 ，結(jié)束電泳。，結(jié)束電泳。3) 電泳用恒壓模式能保持蛋白質(zhì)恒定的電泳遷移率，而電泳用恒壓模式能保持蛋白質(zhì)恒定的電泳遷移率，而電壓先低后高可使樣品更好的進(jìn)入凝膠。實際電壓可根據(jù)電壓先低后高可使樣品更好的進(jìn)入凝膠。實際電壓可根據(jù)時間安排調(diào)節(jié)，

25、電壓高時電泳發(fā)熱大，電壓低于時間安排調(diào)節(jié)，電壓高時電泳發(fā)熱大，電壓低于50V時小時小蛋白容易彌散，凝膠分辨率會下降。蛋白容易彌散，凝膠分辨率會下降。1） 下膠時先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，下膠時先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在邊上輕輕的反復(fù)撬（玻板很易裂）。要在邊上輕輕的反復(fù)撬（玻板很易裂）。2） 考馬斯亮藍(lán)使用簡便快速，可以分辨考馬斯亮藍(lán)使用簡便快速，可以分辨1ug左右的條帶，左右的條帶，是最經(jīng)濟(jì)通用的蛋白是最經(jīng)濟(jì)通用的蛋白PAGE膠電泳染色方法。膠電泳染色方法。 3） 考馬斯亮蘭染色液盡可能過濾后使用，以避免未溶解的考馬斯亮蘭染色液盡可能過濾后使用，以避免未溶解

26、的染料沉積于膠上。染料沉積于膠上。4） 為減少小分子量蛋白條帶的擴(kuò)散，電泳結(jié)束后應(yīng)該馬上為減少小分子量蛋白條帶的擴(kuò)散，電泳結(jié)束后應(yīng)該馬上固定或染色。固定或染色。5） 用微波短暫加熱使染液升溫可以加速染膠，但染色效果用微波短暫加熱使染液升溫可以加速染膠，但染色效果一般（具體操作：每次加熱一般（具體操作：每次加熱1-2分鐘，分鐘，23次，避免染色沸次，避免染色沸騰損壞膠，再搖動染色騰損壞膠，再搖動染色30min以上）。以上）。1：凝膠時間不對。通常膠在30min-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。 如果凝的太快，

27、可能是APS和TEMED用量過多，此時膠太硬易裂，電泳時易燒膠。 2：電泳時間比正常要長?？赡苡捎谀z緩沖系統(tǒng)和電級緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強(qiáng)度太高。 3：指示劑成微笑符號（指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲線形），說明凝膠的中間部分凝固不均勻，或凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致分子有不同的遷移率所致。 4：指示劑成微笑符號（指示劑前沿呈現(xiàn)向下的曲線形），由于電泳槽的裝置不合適，尤其是凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片得凝膠聚和不完全。 一般濃縮膠電泳的電壓是濃縮膠60-80v，分離膠100v。 濃縮膠用較小電壓的目的使得

28、loading 的樣品能夠在同一條水平線上進(jìn)入分離膠，如果電壓太大前端的蛋白容易在后面的蛋白趕上來前進(jìn)入分離膠。而在分離膠，理論上（實際上也是）小電壓/長時間分離的效果會更好，但是在一般操作過程中沒有必要等那么長的時間，所以可用大電壓快點跑。為什么通常電泳時濃縮膠和分離膠的電壓不一致？ 影響跑膠跑的質(zhì)量，有以下因素：1、膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。 倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，水或飽和正丁醇隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋下層的分離膠，使膠不均勻。2、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。 3、

29、電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。 電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠80v，分離膠100v就能跑得很好。4、樣品，在加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素可以克服：由于樣品溶解不佳引起的紋理和拖尾現(xiàn)象 。5、減少上樣量可以避免由于加樣量太多引起蛋白帶過寬或與鄰近泳道的蛋白帶相連。 如何使電泳條帶漂亮些? 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 膜膜3 PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。 大于20kD的蛋白就可以用0.45m的膜，小于20kD的蛋白就要用0.22m的膜了，如果用0.45m的膜就會發(fā)生“Blowthrough

30、”的現(xiàn)象。 關(guān)于轉(zhuǎn)印膜的幾點說明半干轉(zhuǎn)半干轉(zhuǎn) 用濾紙吸buffer來做轉(zhuǎn)移體系的轉(zhuǎn)移方法；適合轉(zhuǎn)移小分子量的蛋白；200 KD以上不能做；半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來算的，時間是根據(jù)蛋白分子大小定的；用轉(zhuǎn)，根據(jù)分子量摸索轉(zhuǎn)膜時間 濕轉(zhuǎn)濕轉(zhuǎn)將膜、膠、濾紙整個浸泡在buffer的Tank里轉(zhuǎn)移的方法；適合轉(zhuǎn)移大分子量（100KD以上）蛋白；濕轉(zhuǎn)時間也是根據(jù)分子量而定；封閉封閉+陽極陽極-陰極陰極多孔墊片多孔墊片濾濾紙紙凝凝膠膠膜濾濾紙紙 墊片墊片 3 3層濾紙層濾紙 膜（左上角標(biāo)記）膜（左上角標(biāo)記） 凝膠（凝膠（MarkerMarker靠左靠左） 3 3層濾紙層濾紙 墊片墊片白色夾板（正極）白色夾

31、板（正極）黑色夾板（負(fù)極）黑色夾板（負(fù)極）五、轉(zhuǎn)膜1、將轉(zhuǎn)膜液放在冰箱里預(yù)冷，剪好濾紙及PVDF膜（一般長8cm，寬1.5cm），將轉(zhuǎn)膜夾放在盤中，黑色朝下，倒入轉(zhuǎn)膜液；2、凝膠須在電轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡15min，除去除去電泳過程中所帶的鹽鹽；在轉(zhuǎn)印過程中，這些鹽會引起轉(zhuǎn)印緩沖液導(dǎo)電性升高，產(chǎn)生大量的焦耳熱3、卸下膠板放在轉(zhuǎn)膜液中，輕輕拿掉短板，將濃縮膠輕輕刮去，根據(jù)marker和指標(biāo)分子量的大小，切下所需要范圍內(nèi)的膠。4、處理PVDF膜及濾紙：剪濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。PVDF是疏水性的，在轉(zhuǎn)膜緩沖液里很難浸透，甲醇處理后使更容易浸潤。按照甲醇浸泡數(shù)秒甲醇浸泡數(shù)秒- -

32、 超純水中超純水中1-21-2min-min-轉(zhuǎn)膜液轉(zhuǎn)膜液10min10min ，濾紙置于轉(zhuǎn)膜液中浸泡。（PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合） 5、放好轉(zhuǎn)膜夾，黑色面放在下面，放入纖維襯墊，在纖維襯墊上放置濾紙（厚的一張，薄的三張）輕輕地將凝膠放在濾紙上，用滾軸趕去氣泡。6、接著小心地將印跡膜放在凝膠上，并確保凝膠和印跡膜的位置正確，放置后盡量不要移動轉(zhuǎn)印膜，以防止產(chǎn)生玷污印跡和人為印跡。除氣泡除氣泡，使凝膠和印跡膜完全地接觸。7. 在轉(zhuǎn)膜液中浸潤另外一張濾紙，將其放在膜上。8、浸潤另一塊纖維襯墊，并將其放在濾紙上9、扣好凝膠轉(zhuǎn)印夾，做好

33、標(biāo)記，將其垂直插入緩沖液槽中，確定轉(zhuǎn)印夾黑色面對應(yīng)于黑色電極將夾子放在槽中，接通電源，電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。按100v恒壓在冰浴中轉(zhuǎn)膜，注意監(jiān)測電流的大小，并作好記錄10、轉(zhuǎn)印結(jié)束后，取下轉(zhuǎn)印夾，拆卸凝膠三明治裝置，TBST 清洗印跡膜。11、半干轉(zhuǎn)時，順序是濾紙-PVDF膜-膠-濾紙。注意：如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)印夾如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)印夾夾夾不緊可，多墊濾紙，使其夾緊，否則影響轉(zhuǎn)膜的均勻度。不緊可，多墊濾紙，使其夾緊，否則影響轉(zhuǎn)膜的均勻度。注意：注意：1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙濾紙=膜膜=膠膠。2）濾紙、膠、膜之間千萬）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣

34、泡不能有氣泡，氣泡會造成短路。，氣泡會造成短路。3）因為膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也）因為膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時必須隨時保持濕潤保持濕潤（干膜法除外）。（干膜法除外）。4）整個操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。上下濾紙不能相互接觸上下濾紙不能相互接觸，接觸，接觸后會發(fā)生短路。后會發(fā)生短路。 去除非特異結(jié)合位點：去除非特異結(jié)合位點： Blocking Buffer ：3%BSA 5% Milk Room Temperature 1 -3h，或者4孵育過夜.一般磷酸化

35、蛋白不用脫脂奶粉封閉，而選用3%BSA。 糖蛋白有拖尾現(xiàn)象，最好用BSA來封閉 抗抗 體體 檢檢 測測4單抗多抗將熒光、酶、金直接標(biāo)記在一抗上進(jìn)行顯色缺點：要求抗體濃度高，每種一抗均需用酶來標(biāo)記將標(biāo)記物標(biāo)記在二抗上優(yōu)點：敏感性高，只需少數(shù)幾種動物的二抗就可以和所有一抗相匹配一抗孵育一抗孵育:拿出合適大小的密封袋，寫下抗體名稱和日期及類型，配制一抗按拿出合適大小的密封袋，寫下抗體名稱和日期及類型，配制一抗按1：1000溶于一抗稀釋液中，將膜從封閉液中拿出，注意只能夾沒有蛋白的邊緣部位，溶于一抗稀釋液中，將膜從封閉液中拿出，注意只能夾沒有蛋白的邊緣部位，放置到一抗中，趕出氣泡，放置到一抗中，趕出氣

36、泡，4度搖床過夜（一般度搖床過夜（一般10-15h)，一抗回收，一抗回收4保存，保存，可用約可用約10天左右。天左右。洗膜：用洗膜：用TBST漂洗漂洗5 minX3次次二抗孵育：二抗孵育：CST: 用用1:2000，溶于二抗稀釋液中中，孵育，溶于二抗稀釋液中中，孵育1 h（常溫?fù)u床）（常溫?fù)u床）Pierce 分裝：建議分裝：建議1:5000-1:100000。Abmart：1:30001:8000洗膜：洗膜：TBST漂洗漂洗5 minX3次；最后用次；最后用TBS 漂洗漂洗5 min。注意：注意：1、避免膜干燥。、避免膜干燥。2、二抗要跟一抗相抗。、二抗要跟一抗相抗。問：問：1、如何判斷二抗是

37、否有問題及如何快速摸索最佳二抗?jié)舛?？、如何判斷二抗是否有問題及如何快速摸索最佳二抗?jié)舛龋?采用斑點法。采用斑點法。 2、如何摸索一抗最佳濃度？、如何摸索一抗最佳濃度？化學(xué)發(fā)光成像化學(xué)發(fā)光成像1、打開儀器預(yù)熱、打開儀器預(yù)熱(提前提前30分鐘），暗箱底座擦干凈，鋪上保鮮膜，保鮮膜下分鐘），暗箱底座擦干凈，鋪上保鮮膜，保鮮膜下適當(dāng)加點水使貼住。適當(dāng)加點水使貼住。2、打開電腦中的、打開電腦中的Image Lab程序程序-新建新建-選擇選擇-印記印記-chemi-設(shè)置（圖像時間）設(shè)置（圖像時間）-放置凝膠，調(diào)整大小及位置。放置凝膠，調(diào)整大小及位置。2、關(guān)閉電燈，按、關(guān)閉電燈，按1：1取等量的取等量的EC

38、L發(fā)光液（發(fā)光液（A、B兩液）混合配置化學(xué)發(fā)光兩液）混合配置化學(xué)發(fā)光液，現(xiàn)配現(xiàn)用。（注意不能有遺漏的地方，觀察液面是否完整覆蓋住膜）液，現(xiàn)配現(xiàn)用。（注意不能有遺漏的地方，觀察液面是否完整覆蓋住膜）3、顯影液完全覆蓋住、顯影液完全覆蓋住PVDF膜，反應(yīng)膜，反應(yīng)1 min，點擊運行，盡量避光操作，點擊運行，盡量避光操作注意：注意：1、注意避光，發(fā)光試劑用完立即放回、注意避光，發(fā)光試劑用完立即放回4度。度。2、加化學(xué)發(fā)光液前應(yīng)把膜上的水用濾紙吸掉。、加化學(xué)發(fā)光液前應(yīng)把膜上的水用濾紙吸掉。3、放置完在對焦下使效果更好。、放置完在對焦下使效果更好?；瘜W(xué)發(fā)光成像化學(xué)發(fā)光成像5Western熒光檢測取決：熒

39、光檢測取決：45KBeta-actin45K35KGAPDH漩渦狀條帶或條帶丟失；轉(zhuǎn)印擴(kuò)散漩渦狀條帶或條帶丟失；轉(zhuǎn)印擴(kuò)散1. 印跡膜和凝膠沒有密切接觸，在二者之間存有氣泡或過量緩沖液 使用滾筒小心驅(qū)趕印跡膜與凝膠間的氣泡或過量緩沖液. 在凝膠和印跡膜兩側(cè)使用厚的濾紙. 更換纖維墊，纖維墊隨會時間變薄或降解，不能夾緊印跡膜和凝膠.2. 電源條件使用不當(dāng) 開始前核實電流。在特定電壓下，電流可能過高。如果緩沖液使用不當(dāng)，導(dǎo)電率太高，引起電場強(qiáng)度增大，出現(xiàn)過熱現(xiàn)象。3. 印跡膜沒有完全潤濕或有些干燥 硝酸纖維素膜上的白色斑點表明其潤濕不完全，蛋白不能與這些干燥部位結(jié)合。如果將印跡膜放在轉(zhuǎn)印緩沖液中很難潤濕，可以取蒸餾水加熱至接近沸點，將