淺論二苯乙烯苷含藥血清作用于老年性癡呆細(xì)胞模型的最佳條件篩選

1、淺論二苯乙烯苷含藥血清作用于老年性癡呆細(xì)胞模型的最佳條件篩選                 作者：黃忠仕，張樹球，農(nóng)嵩，李韜，李曙波【摘要】【關(guān)鍵詞】  二苯乙烯苷 癡呆 老年性 淀粉樣蛋白 NG108-15細(xì)胞   Abstract:  Objective  To confirm the optimum conditions of TSG-containing serum affect on

2、cell model of Alzheimers disease (AD).  Methods  Cell counting and MTT technique were used to determine the optimum concentration of amyloid 25-35(A25-35) and drug-containing serum in establishing cell model of AD, then observed the cell survival rate of the cell model after treated with d

3、ifferent concentration of rats serum and of amyloid 25-35, respectively.  Results  5% concentration of serum resulted  in the highest cell survival rate among all kinds of serum. At the 5% concentration of serum condition, the cell survival rate of drug-containing serum groups were hi

4、gher than the normal serum group at 0mol/L and 5mol/L concentration of A25-35 (P0.05 or P0.01), but had no difference at 10oml/L concentration.  Conclusions  It is the optimum condition to select 5mol/L concentration of A25-35 and 5% concentration of drug-containing serum to establish the

5、NG108-15 cell model of AD and the best system to assess the drug efficacy. Under these conditions can be objectively assessed the drug efficacy of TSG-containing serum.Key words:  2,3,5,4-tetrahydroxy-stilbene-2-O-B-D-glycoside; dementia, senile; amyloid beta-protein; NG108-15 cells  

6、 用動(dòng)物模型研究老年性癡呆（AD）能夠反映整體水平的變化以及行為和記憶功能的改變，但由于體內(nèi)復(fù)雜因素的影響，對某些特殊類型細(xì)胞功能及細(xì)胞結(jié)構(gòu)、酶、離子及其通道、受體的研究卻較困難。動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)成功彌補(bǔ)了這一缺陷。利用細(xì)胞培養(yǎng)法建立AD細(xì)胞模型已經(jīng)成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究AD的重要手段1,2。我們將淀粉樣蛋白(A)25-35作用于NG108-15神經(jīng)細(xì)胞，建立AD細(xì)胞模型，研究二苯乙烯苷（2, 3, 5, 4-tetrahydroxy-stilbene-2-O-D-glycoside, TSG）含藥血清對AD細(xì)胞模型的影響。本實(shí)驗(yàn)主要探討建立AD細(xì)胞模型的A25-35的最佳濃度和二苯乙烯苷含藥

7、血清的最佳作用濃度，觀察在不同濃度A25-35和不同濃度二苯乙烯苷含藥血清的細(xì)胞存活率?，F(xiàn)報(bào)道1  材料1.1  動(dòng)物健康3月齡Wistar大鼠60只，雌雄兼用，體重200250g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號：SCXKG桂2003-0003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYKG桂2003-0005）。1.2 主要藥品與試劑 二苯乙烯苷：由本教研室根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)3,4提??；石杉堿甲（豫中制藥廠生產(chǎn)，批號：H10940156）；A25-35片段，環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，青霉素(Penicillin) G，硫酸鏈霉素，MTT（以上試劑由Sigma公司提供）；HAT（

8、次黃嘌呤/胸腺嘧啶核苷/氨甲喋呤，Gibco 公司提供）；胎牛血清（FBS），DMEM培養(yǎng)基（由Hyclone公司提供）。1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma公司），倒置顯微鏡（南京江南光電股份有限公司），酶標(biāo)儀（Metertech公司）。1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株NG108-15細(xì)胞：由廣西中醫(yī)學(xué)院鐘振國教授惠贈。2 方法2.1 含藥血清的制備及實(shí)驗(yàn)血清濃度的選擇 將健康的3月齡Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為3組，每組20只：正常對照組；石杉堿甲組；二苯乙烯苷組。各組根據(jù)成人治療量換算為大鼠用量，用高劑量灌胃。每天灌胃量0.5ml/100g體重，二苯乙烯苷按

9、0.3g/kg體重，石杉堿甲按0.02mg/kg體重，正常血清組給相應(yīng)體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃10天，于末次給藥后2h，用20%烏拉坦腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈抽血，離心分離血清，56滅活30min，無菌過濾，即得相應(yīng)的含藥血清。將各組含藥血清和正常對照組血清分別加入HAT、雙抗和DMEM培養(yǎng)液，配成含5%、10%、20%的含藥血清和正常對照組血清DMEM培養(yǎng)液（各組HAT和雙抗的終濃度均為1%），培養(yǎng)NG108-15細(xì)胞，以生存率為指標(biāo)，選擇細(xì)胞生長狀態(tài)最好的血清濃度為實(shí)驗(yàn)血清濃度。2.2 A25-35濃度的選擇 將A25-35溶于高壓滅菌后的生理鹽水，配成250mol/L母液備

10、用。在篩選出最佳實(shí)驗(yàn)血清濃度的基礎(chǔ)上，分別比較大鼠血清在A25-35 0mol/L、5mol/L和10mol/L濃度時(shí)的細(xì)胞生存率，確立A25-35片段在建立細(xì)胞模型時(shí)的最佳濃度。2.3 AD細(xì)胞模型的建立 將NG108-15細(xì)胞加入細(xì)胞增殖液（5%FBS加DMEM加1%HAT加1%雙抗），在10%CO2、37條件下培養(yǎng)1天，然后加入較適濃度A25-35片段，繼續(xù)培養(yǎng)1天后，即建成AD細(xì)胞模型。以各含藥血清或含正常對照組血清DMEM培養(yǎng)液更換原培養(yǎng)液，仍加入上述較適濃度A25-35片段以維持AD細(xì)胞模型。培養(yǎng)2天后進(jìn)行觀察、分析。2.4 細(xì)胞存活率觀察  細(xì)胞直接置于光學(xué)顯

11、微鏡下觀察其形態(tài)及計(jì)數(shù)其存活率。在培養(yǎng)板每孔上下左右中5個(gè)視野各拍片1張，然后在照片上計(jì)算培養(yǎng)板各組細(xì)胞的數(shù)目，將最初播下的細(xì)胞數(shù)定為基數(shù)（100%），然后將各組細(xì)胞與原播種細(xì)胞數(shù)相比得出各組結(jié)果。2.5 MTT測定法 吸棄待測細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)培養(yǎng)液，加無血清DMEM液100l/孔，MTT液20l，置于37、10%CO2條件下4h，出現(xiàn)藍(lán)色結(jié)晶后，加SDS-DMF100l/孔，于37、10%CO2條件下過夜，用酶標(biāo)儀于=570nm處測OD值。2.6 統(tǒng)計(jì)方法  所有檢測結(jié)果以(±s)表示。用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較采用

12、t檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)在=0.05。         3 結(jié)果3.1 不同濃度血清對NG108-15細(xì)胞存活率的影響 3.2  5%濃度血清培養(yǎng)液中不同濃度A25-35對NG108-15細(xì)胞存活率的影響見表2。在5%血清濃度下，A25-35 0mol/L及5mol/L濃度組中石杉堿甲和二苯乙烯苷含藥血清細(xì)胞存活率明顯高于同濃度的正常大鼠血清（P0.01）；在10mol/L濃度時(shí)組間無差異。同一血清組內(nèi)不同A25-35濃度對細(xì)胞存活率進(jìn)行比較顯示：0mol/L濃度組細(xì)胞存活率明顯高于5mol/L和1

13、0mol/L濃度組，石杉堿甲和二苯乙烯苷含藥血清在A25-35 5mol/L濃度組細(xì)胞存活率比10mol/L濃度組高（P0.01）。以上結(jié)果表明，二苯乙烯苷含藥血清在無A25-35的毒性作用下，對正常細(xì)胞能促進(jìn)增殖和維持良好的生長態(tài)勢。在A25-35 5mol/L濃度時(shí)，二苯乙烯苷和石杉堿甲含藥血清能保護(hù)A對NG108-15細(xì)胞的毒性殺傷作用，但在A濃度較高（10mol/L）時(shí)則未能起到保護(hù)作用。表2  5%血清時(shí)，不同濃度A25-35對NG108-15細(xì)胞存活率的影響（略）注：A25-35濃度相同時(shí)與正常大鼠血清比較，a：P0.01；A25-35濃度不同時(shí)同類血清與0mol/L濃度

14、比較，b：P0.01；A25-35濃度不同時(shí)同類血清與5mol/L濃度比較，c：P0.01。見表3。在5%血清濃度下，A25-35 0mol/L及5mol/L濃度組中石杉堿甲和二苯乙烯苷含藥血清組的OD值明顯高于同濃度的正常大鼠血清（P0.01），但在10mol/L濃度時(shí)組間差異無顯著性。同一組血清內(nèi)組間兩兩比較則顯示0mol/L濃度A25-35OD值最高，石杉堿甲和二苯乙烯苷含藥血清在A25-35 5mol/L濃度OD值比10mol/L濃度組高（P0.01）。以上結(jié)果與細(xì)胞計(jì)數(shù)法得出的結(jié)果一致。表3  不同濃度A25-35在NG108-15細(xì)胞以不同血清處理2天后的MTT OD值

15、（略）注：A25-35濃度相同時(shí)與正常大鼠血清比較，a：P0.01；A25-35濃度不同時(shí)同類血清與0mol/L濃度比較，b：P0.01；A25-35濃度不同時(shí)同類血清與5mol/L濃度比較，c：P0.01。4 討論   大量的證據(jù)表明大腦神經(jīng)原纖維纏結(jié)、老年斑、膽堿能神經(jīng)元的大量缺失是AD的主要病理改變，同時(shí)在這些病變的病灶中發(fā)現(xiàn)有大量A沉積物5。一般認(rèn)為，A或含A順序的淀粉樣蛋白前體（-Amyloid protein precursor, -APP）的降解產(chǎn)物聚集沉積產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用是AD的病因；而神經(jīng)元的死亡、纖維纏結(jié)的形成、血管的損害和癡呆的出現(xiàn)是A沉積的直接結(jié)果6

16、8。因此，可把A作為AD腦的生化標(biāo)記物。A25-35作為全長A的最短有效毒性片段，作用于不同細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均顯示出與全長A相近的毒性效應(yīng)，可致培養(yǎng)細(xì)胞死亡9,10。故將A25-35片段加入細(xì)胞培養(yǎng)液中造模是目前較常用的方法之一。鐘振國等11,12將A25-35產(chǎn)物直接加入到培養(yǎng)中的NG108-15細(xì)胞中建立AD細(xì)胞模型，其細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、死亡率、ChAT活性水平、Synapsin水平、Ach遞質(zhì)釋放能力等與AD病理生理變化基本一致，故可用A25-35誘導(dǎo)NG108-15神經(jīng)細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型。   本實(shí)驗(yàn)為探討建立AD細(xì)胞模型及藥效考察體系的最佳條件的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：過高

17、的二苯乙烯苷含藥血清濃度能降低細(xì)胞的存活率，不利于細(xì)胞的增殖，同時(shí)造成血清的浪費(fèi)；過低的A25-35濃度達(dá)不到造模的目的，過高A25-35濃度又會造成NG108-15細(xì)胞的大量死亡，不能靈敏地反映二苯乙烯苷含藥血清的藥效。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：5mol/L A25-35及5%血清濃度條件時(shí)，建立AD細(xì)胞模型及藥效考察體系較為合適，在此條件下，應(yīng)用該細(xì)胞模型觀察發(fā)現(xiàn)，5%二苯乙烯苷含藥血清能有效地降低A25-35片段對NG108-15神經(jīng)細(xì)胞的損害，減少細(xì)胞的死亡率。其細(xì)胞存活率，與正常大鼠血清組比較差異具有顯著性（P0.01），而與陽性對照藥石杉堿甲含藥血清組比較則無明顯差異。此細(xì)胞模型及藥效考察體系的

18、最佳條件的確立，能靈敏、真實(shí)地反映藥效，為進(jìn)一步考察二苯乙烯苷含藥血清的藥效打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。【參考文獻(xiàn)】  1Hartman RE, Laurer H, Longhi L, et al. Apolipoprotein E4 influences amyloid deposition but not cell loss after traumatic brain injury in a mouse model of Alzheimers disease J. Neurosci,2002,22(23):10083-10087.2Xu TH, Ding J, Shi YL. Toosendanin increases free-Ca2+ conc