研究蛋白質(zhì)凝聚凝膠的技術(shù)進展

1、爭辯蛋白質(zhì)分散凝膠的技術(shù)進展摘要由于蛋白質(zhì)形成的凝膠會影響食品的質(zhì)構(gòu)和品質(zhì),所以爭辯蛋白質(zhì)凝膠對于食品科學(xué)有極其重要的意義。然而,蛋白質(zhì)形成凝膠的機理過于簡單,需要更先進的技術(shù)來爭辯。介紹了用于蛋白質(zhì)凝膠爭辯的最新技術(shù)進展,如原子力顯微鏡(AFM),共聚焦激光顯微鏡(CSLM)和漫射波光譜(DWS)。與傳統(tǒng)爭辯凝膠的方法如動態(tài)流變儀和掃描電子顯微鏡(SEM)相比,這些新方法簡化了樣品的預(yù)處理,有實現(xiàn)在線測定的可能。由于樣品處于自然狀態(tài),所以反映的信息更具有真實性,加上高辨別率,可以實現(xiàn)蛋白形成凝膠過程分子水平的可視化。因此,接受以上的新技術(shù)可以為爭辯蛋白凝膠的形成供應(yīng)更多的信息。分散和凝膠過程

2、對食品加工起著重要的作用,它們能形成食品所需要的質(zhì)構(gòu),也會帶來不需要的沉淀或是分層現(xiàn)象。因此,爭辯膠體形成的特性對于穩(wěn)定和形成食品所需結(jié)構(gòu)格外重要,并且通過把握凝膠反應(yīng)優(yōu)化食品加工過程,提高食品品質(zhì)。對于食品體系的凝膠和分散已經(jīng)有了深化的爭辯,但分散凝膠現(xiàn)象還鮮有報道。由于爭辯凝膠過程有以下困難:首先,蛋白和多糖是大分子,三維結(jié)構(gòu)描述和定量困難。其次,凝膠過程是一個簡單的反應(yīng)體系1。例如,球蛋白的凝膠過程,通常分為蛋白分子開放,解聚和聚合,分散2的步驟。在熱變性的過程中,自然蛋白分子伸展,暴露出功能性基團(如巰基和疏水基團)。隨后,為了降低體系的能量,蛋白通過形成二硫鍵或疏水相互作用發(fā)生分散3

3、-4。當(dāng)?shù)鞍诐舛雀哂谛纬赡z的臨界點時,分散連續(xù)進展形成凝膠結(jié)構(gòu)。在整個反應(yīng)過程中,最終的凝膠和分散體的結(jié)構(gòu)受環(huán)境因素影響(蛋白濃度、pH、離子強度、溫度等)很大。食品是個簡單的體系,一些成分會影響蛋白分散凝膠的過程如蛋白蛋白的相互作用,通過轉(zhuǎn)變二硫鍵形成、疏水相互作用、氫鍵或是范德華力,轉(zhuǎn)變形成凝膠體的凝膠特性5。此外,接受傳統(tǒng)的分析手段難以獲得更加深化真實的凝膠形成信息。盡管接受動態(tài)流變儀、顯微鏡和動態(tài)光散射技術(shù)可以分析凝膠形成過程,但是這些方法主要通過分析分散發(fā)生過程時粒子尺寸或是彈性模量G的變化來進行爭辯6-9,通常需要簡單繁瑣的樣品前處理過程,如稀釋、機械變形、干燥、凍干等,這些處理

4、睬破壞易裂開的弱凝膠,影響亞穩(wěn)定體系。因此,保持體系接近原始自然狀態(tài)對于考察物理化學(xué)因素對于凝膠最終質(zhì)構(gòu)的影響格外重要。抱負的分析方法應(yīng)當(dāng)是非破壞性的、非干擾性的技術(shù),可以讓樣品處于自然狀態(tài)下測定,從而獲得處于軟凝膠狀態(tài)下,凝膠相互作用的信息10。伴隨科技的進展,一些新的非破壞性的技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)凝膠和分散的爭辯中。文章論述了原子力顯微鏡(AFM),激光共聚焦顯微鏡(CSLM)和散射光波譜(DWS)用于食品蛋白質(zhì)分散凝膠的爭辯。在我國,雖然原子力顯微鏡已經(jīng)廣泛用于多糖結(jié)構(gòu)的爭辯11-13,但是用于蛋白質(zhì)凝膠和分散的爭辯報道還很少。1AFM用于蛋白質(zhì)分散凝膠AFM起源于隧道掃描顯微鏡技術(shù),它廣泛

5、應(yīng)用于生物、物質(zhì)結(jié)構(gòu)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域。AFM用于食品科學(xué)中以下六個方面14:AFM可以定性描述食品大分子的結(jié)構(gòu);通過AFM成像供應(yīng)的結(jié)構(gòu)參數(shù)描述食品加工和儲存過程中定量分析分子結(jié)構(gòu)變化;顯示不同分子之間的相互作用;為操控食品大分子供應(yīng)條件;描述食品表面因物理特性變化而帶來的微小變化;加工納米食品的工具。1. 1AFM的原理AFM的成像是通過“感覺”而非“觀看”樣品。在AFM觀測樣品時,一個安裝在懸臂上的尖端掃描樣品表面,通過記錄懸臂的偏斜,通過激光二極管發(fā)出的激光照射在懸臂的末端,經(jīng)過鏡面反射把激光放射到光電二極管檢測器上,得到懸臂偏斜的信號。當(dāng)掃描樣品時,樣品表面的拓撲結(jié)構(gòu)通過尖端和樣品力

6、的變化使懸臂發(fā)生偏斜。通過電腦處理懸臂偏斜變化形成樣品表面三維結(jié)構(gòu)15。AFM的觀測模式有三種:接觸、非接觸和小扣。在接觸模式中,尖端始終與樣品表面接觸,而非接觸模式中,懸于空氣中的尖端僅于樣品表面吸附水層接觸而不與樣品接觸。小扣模式中,尖端與樣品間歇接觸,通常每秒接觸300 000次,削減接觸模式中產(chǎn)生的剪切力對于樣品的破壞,這種模式通常適宜那些質(zhì)地偏軟的食品和生物樣品。1. 2AFM的特點與傳統(tǒng)的電子和一般光學(xué)顯微鏡相比,AFM具有以下優(yōu)點14, 16。具有高辨別率和大的放大倍數(shù)。AFM沒有透鏡,因此不受衍射極限或者球面像差的限制,對于某些樣品可以實現(xiàn)原子級別的辨別率。簡化樣品處理的過程。

7、AFM是非破壞的分析方法,不需要染色或是覆膜處理,也不用高能量的粒子流,不需要導(dǎo)電襯底,不受樣品稠度的影響,觀測時樣品可以處于溶液中,基本達到在自然狀態(tài)下或是近似自然狀態(tài)下觀測樣品?？赏瑫r得到樣品的二維和三維成像?？梢赃B續(xù)的觀測樣品變化,所以可以直接觀測正在進行的反應(yīng)過程。如酶反應(yīng)的過程。為操控大分子和調(diào)查大分子之間的相互作用供應(yīng)了可能。然而,目前AFM也有以下缺點:相對較小的掃描面積,較慢的掃描速度,對于過于軟的樣品成像困難等1. 3AFM在蛋白分散和凝膠上的應(yīng)用AFM能有效地供應(yīng)凝膠結(jié)構(gòu)信息,進而補充流變儀或化學(xué)分析蛋白分散結(jié)構(gòu)信息。AFM可以成功的反映乳清蛋白熱分散現(xiàn)象,爭辯發(fā)覺乳清蛋白

8、分散體顯示了同-乳球蛋白分散體相像的微觀結(jié)構(gòu)17。在pH 7時,無論NaCl濃度如何變化,乳清蛋白分散體主要由橢球形微粒構(gòu)成。以上爭辯結(jié)果對于理解不同條件下得到的熱導(dǎo)致乳清蛋白凝膠特性差異供應(yīng)了基礎(chǔ)。接受小扣模式AFM觀看到加熱后-乳球蛋白,發(fā)覺它形成一種有規(guī)律的纖維結(jié)構(gòu),長度約25nm,厚度是1或2個蛋白單體14。這證明在低pH低離子強度下,形成的熱導(dǎo)致-乳球蛋白纖維體需要進行兩步以上的反應(yīng)。Iwasaki等14接受AFM分析加熱對于肌漿球蛋白絲形態(tài)的影響,發(fā)覺在70時原來的串珠結(jié)構(gòu)變成繩子結(jié)構(gòu),但是少量蛋白絲的結(jié)構(gòu)沒有明顯變化。Yang等18使用AFM觀看鯰魚凝膠結(jié)構(gòu),發(fā)覺鯰魚凝膠中具有平

9、均直徑為118 nm的環(huán)形孔洞球形分散體的平均直徑為267 nm。他們認(rèn)為球狀分散體和環(huán)形孔洞的形成與水和離子滲透過正在水解膠原質(zhì)時的方式有關(guān)。AFM能從分子水平上解釋食品流變學(xué)特性的差異,從力學(xué)的角度揭示蛋白分散特性。Iwasaki等19報道了接受AFM分析由熱導(dǎo)致和壓力導(dǎo)致的細絲狀肌漿球蛋白凝膠中的串珠結(jié)構(gòu)和彈性之間的關(guān)系。近期消滅的階段成像,力調(diào)制模式等新技術(shù),使AFM能夠定量測定物質(zhì)彈性。AFM也應(yīng)用于分析蛋白分散動力學(xué)。Yay等20使用AFM分析接受GDL導(dǎo)致不同大豆蛋白分散的過程。將11S、7S、2S在100加熱10 min后,加入GDL,接受AFM觀測它們形成不同的分散曲線。單位

10、時間內(nèi), 11S形成體積最大的分散團, 2S形成的分散團其次, 7S的分散團最小,所以可以推想11S的分散速度最快, 7S最小。雖然AFM已經(jīng)成功地運用于食品蛋白凝膠領(lǐng)域,但是對于觀測高度簡單的真實食品體系,還存在不足,有太多其他組分和組分間相互作用會干擾對調(diào)查對象的分析。但是隨著技術(shù)的進展,AFM必定會廣泛的應(yīng)用于真實的食品體系。2CSLM用于蛋白分散凝膠與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡相比,由于接受自動的顯微鏡技術(shù)、熒光探針技術(shù)、高容量和高強度的圖片處理軟件等先進技術(shù),CSLM具有很高的放大倍數(shù)和高的辨別率。CSLM已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于分子生物學(xué)21、免疫學(xué)、藥劑學(xué)22、基因?qū)W、生理學(xué)23等領(lǐng)域。2. 1C

11、SLM的原理利用激光束通過光柵針孔形成點光源,在熒光標(biāo)記標(biāo)本的焦平面上逐點掃描,采集點的光信號通過探測針孔到達光電倍增管(PMT) ,再經(jīng)過信號處理,在計算機監(jiān)視屏上形成圖像。CLSM接受共聚焦技術(shù)在物鏡的焦平面上放置了1個帶有小孔的擋板,平面以外的雜散光被攔住,消退了球差,并進一步消退了色差,且可將樣品分解成二維或三維空間上的很多點,用格外細小的激光束(點光源)逐點逐行掃描成像,再通過微機組合成1個平面的或立體的圖像24-25。2. 2CSLM的特點CSLM已經(jīng)漸漸用于食品微結(jié)構(gòu)的爭辯,有如下特點26:避開固定或者脫水操作,避開破壞樣品,因此削減了樣品制備的時間和對樣品性質(zhì)的轉(zhuǎn)變;熒光探針的

12、使用可以特定觀看食品的某種成分,提高檢測的靈敏性和特異性;食品結(jié)構(gòu)的變化可以連續(xù)的監(jiān)測;“光切片”技術(shù)可以確保不破壞微觀結(jié)構(gòu)的條件下,觀測表面以下不同深度切面的微觀結(jié)構(gòu)。雖然CSLM有諸多優(yōu)點,但是CSLM還有以下缺點:受衍射極限的限制, CSLM觀測某些蛋白和酪蛋白膠束的辨別率最高達到0. 2m以上;同時某些與樣品接受共價鍵結(jié)合的熒光探針會轉(zhuǎn)變樣品結(jié)構(gòu)的影響27。此外,熒光信號漸漸減弱,會影響測定結(jié)果;掃描速度慢,并且目前CSLM不能檢測靜止的食品體系。2. 3CSLM在蛋白分散凝膠中的應(yīng)用由于CSLM適宜觀看處于自然狀態(tài)下食品體系28,所以CSLM已經(jīng)用于分析食品膠體,如蛋白-多糖相分別,

13、蛋白凝膠結(jié)構(gòu),乳化和泡沫穩(wěn)定性29-34。CSLM可以用于測定膠體形成動態(tài)過程26。CSLM已經(jīng)觀測了接受凝乳酶導(dǎo)致全脂牛奶和低脂牛奶形成凝膠的過程。起初,酪蛋白呈現(xiàn)出粒徑小于0. 5m微小分散的小顆粒, 15 min后,酪蛋白顆粒開頭發(fā)生分散,最終凝膠形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。從CSLM分析發(fā)覺,除了在低脂牛奶中脂肪球個數(shù)遠少于全脂牛奶和凝膠速度低于全脂牛奶以外,低脂牛奶和全脂牛奶凝膠過程相像。接受CSLM觀測GDL導(dǎo)致的凝膠過程時,發(fā)覺在加入GDL后1-20 min(pH 6. 515. 64),一些粒徑小于1m蛋白微粒在各個方向上隨機快速運動, 30 min后, pH下降到5. 58時,粒徑小于

14、2m牛奶蛋白的分散體成為體系的主體。開頭發(fā)生凝膠化并形成可見的蛋白網(wǎng)絡(luò)是在pH 5. 4,而此時蛋白已經(jīng)完全靜止。CSLM能夠清楚的描述在分散凝膠過程中大分子之間的相互作用,如多糖蛋白、蛋白蛋白。Sittikijyothin等35使用CSLM爭辯由-乳球蛋白和他拉膠形成的混合膠。單純的-乳球蛋白凝膠呈現(xiàn)均質(zhì)性,而混合膠具有兩個相。-乳球蛋白發(fā)生分散后,形成富含蛋白的連續(xù)相,他拉膠構(gòu)成分散相。他拉膠濃度顯著影響混合膠的微觀結(jié)構(gòu),當(dāng)增加他拉膠濃度時,會產(chǎn)生更具有開放性和不均勻的混合膠結(jié)構(gòu)。GonCalves等36爭辯由-乳球蛋白和刺槐豆膠形成混合膠也具有相像的結(jié)構(gòu)36。Schmitt等37接受CS

15、LM爭辯發(fā)覺:總濃度為1%的-乳球蛋白和阿拉伯膠,與總濃度1%的全溶-乳球蛋白和阿拉伯樹膠形成的凝膠完全不同。球狀混合聚集物的沉淀平衡系數(shù)受構(gòu)成聚集層的兩種物質(zhì)比例的影響。當(dāng)?shù)鞍诐舛壬仙龝r,產(chǎn)生尺寸巨大、數(shù)量眾多沉淀,這些沉淀由阿拉伯樹膠包圍的蛋白質(zhì)分散團組成。而分散團由含有單個小泡顆粒(氣泡表觀直徑410m)和含有泡沫顆粒(氣泡大小相對均一,直徑在24m)構(gòu)成。在全溶-乳球蛋白和阿拉伯樹膠形成分散體系中主要是含有單個氣泡的顆粒團。產(chǎn)生不同微粒的緣由是:-乳球蛋白和全溶-乳球蛋白的分散性不同造成的。CSLM供應(yīng)了加熱乳清蛋白和-乳球蛋白可以形成簡單的凝膠網(wǎng)絡(luò)的證據(jù)。疏水相互作用和氫鍵誘導(dǎo)-乳球

16、蛋白分子吸附到乳清蛋白上39。這一點在CSLM的照片上可以清楚地看到二者的熒光信號重合在相同的區(qū)域。此外,CSLM還顯示-乳球蛋白對于乳清蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的影響,當(dāng)降低-乳球蛋白的含量時,形成的混合凝膠網(wǎng)絡(luò)更均勻。動態(tài)CSLM也成功地用于分析環(huán)境因素如離子強度、pH、時間等對于凝膠結(jié)構(gòu)的影響。接受動態(tài)CSLM可以清楚地觀測到離子強度和pH對蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響。在低離子強度和高pH條件下, CSLM觀測到酪蛋白形成帶有大孔洞的粗糙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),而在高的離子強度和低的pH條件下,形成蛋白網(wǎng)絡(luò)比較均勻,孔洞尺寸較小39。這是由于酪蛋白在高離子強度下的去穩(wěn)定化要慢于低離子強度,并且需要更低的pH條件來削減膠束

17、表面的電荷,所以形成凝膠的速度較慢,簡潔形成結(jié)構(gòu)精細的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。3DWS用于蛋白分散凝膠DWS起源于傳統(tǒng)的激光散射技術(shù)。由于多散射光子疊加,使傳統(tǒng)的靜態(tài)或是動態(tài)激光散射技術(shù)都不能用于高濃度的膠體體系,只能分析稀釋的懸濁體系,其濃度大約0. 01%。而凝膠化、相分別和絮凝現(xiàn)象發(fā)生的濃度,都高于激光散射測量的濃度范圍40。但DWS卻可以用于混濁的膠體體系,因此,DWS可以用于爭辯乳化劑、膠體、化妝品等領(lǐng)域。3. 1DWS的原理當(dāng)激光照射到組成膠體的顆粒上時,導(dǎo)致發(fā)生共振和散射,而且散射光受顆粒運動狀態(tài)的影響41。DWS測定的是在顆粒間發(fā)生多次散射光子,這時間子的運動途徑可以看作隨機運動或是散布

18、運動。因此,隨時間變化的散射光強度直接與樣品中顆粒運動狀態(tài)有關(guān),測定散射光變化,即可推出顆粒運動狀態(tài),進而得出分散的狀態(tài)。DWS有兩種構(gòu)造類型:同側(cè)型和穿透型,同側(cè)型,收集器和檢測器與激光放射源在同一側(cè);穿透型收集器和檢測器與激光放射源在異側(cè),所以散射激光必需穿過整個懸濁樣品,散射激光的強度較高。同側(cè)型的缺點是有時收集的散射光沒有發(fā)生足夠散射,但是它具有激光能量低并且易于安裝設(shè)備的優(yōu)點,因此用于食品分散凝膠化的爭辯。3. 2DWS的特點DWS可以在線測定未稀釋或是未預(yù)處理過樣品,得到分散顆粒的尺寸、空間相關(guān)性的信息。但缺點是:DWS不能用于已經(jīng)完全形成的凝膠,由于此時顆粒已經(jīng)完全靜止,體系中沒

19、有微粒移動,就不能用簡單的相關(guān)函數(shù)來推導(dǎo)凝膠的信息。目前沒有商業(yè)化DWS設(shè)備,只是一些試驗室自制的DWS設(shè)備。因此,DWS的進展受軟件和硬件的限制。3. 3DWS在蛋白質(zhì)凝膠分散中的應(yīng)用目前,DWS主要用于爭辯初始狀態(tài)下的食品分散凝膠化過程,如通過添加凝乳酶或酸化導(dǎo)致牛奶凝膠化過程,并測定凝膠網(wǎng)絡(luò)的黏彈性42-44。爭辯表明,DWS能夠精確測定分散時間,并且能找到散射光強度變化和形成結(jié)構(gòu)彈性之間的聯(lián)系。DWS通過測定光子運動平均自由行程(l*)的變化,發(fā)覺使用凝乳酶和酸凝固的酪蛋白凝膠差異明顯。參數(shù)l*是穿透性DWS特有的表征微觀結(jié)構(gòu)進展變化和不同類型凝膠形成機理的指標(biāo)。凝膠化過程中,l*的變化要早于顆粒分散尺寸變化和流變學(xué)變化。在酸化和凝乳酶誘導(dǎo)的凝膠體系中,隨時間變化,兩者的l*不同,所以證明在兩種凝膠化過程中蛋白質(zhì)間不同的相互作用類型45。即使在發(fā)生分散之前,DWS顯示在光子平均自由行程上加熱和未加熱的牛奶有明顯的差別