慢性病毒性肝炎與機(jī)體固有免疫應(yīng)答

1、慢性病毒性肝炎與機(jī)體固有免疫應(yīng)答白雪帆 張 野第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍感染病中心 （西安 710038）抗病毒免疫應(yīng)答是病毒感染后機(jī)體對(duì)抗病毒感染、使疾病過程減輕縮短最終恢復(fù)并使機(jī)體具備防護(hù)再次感染的能力的反應(yīng)。在機(jī)體抗感染免疫過程中，特別是在病毒感染的早期，是以固有免疫（innate immunity）即先天性免疫為主，固有免疫應(yīng)答在機(jī)體非特異性抗感染免疫中具有重要意義，在獲得性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、調(diào)節(jié)和效應(yīng)階段也發(fā)揮重要作用。一、固有免疫細(xì)胞執(zhí)行固有免疫作用的細(xì)胞主要包括：?jiǎn)魏送淌杉?xì)胞、樹突狀細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、T細(xì)胞和B1細(xì)胞等，它們是固有免疫的主要執(zhí)行者。目前針對(duì)肝炎病毒感

2、染的研究熱點(diǎn)主要集中于樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和自然殺傷T細(xì)胞。1、樹突狀細(xì)胞樹突狀細(xì)胞（dendritic cell, DC）由Steinman和Cohn于1973年首先發(fā)現(xiàn)1，因其表面具有星狀多形性或樹枝狀突起而得名。DC具有其他細(xì)胞所沒有得形態(tài)特點(diǎn)和運(yùn)動(dòng)能力，分布十分廣泛。DC不但具有吞噬能力，而且是迄今已知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，可以有效地刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞活化，從而將固有免疫和獲得性免疫有機(jī)地聯(lián)系起來?？共《綯細(xì)胞的活化，特別是在初次免疫應(yīng)答階段，極大的依賴于單核細(xì)胞源性DC的功能。病毒進(jìn)入人體組織器官后遭遇的第一種免疫細(xì)胞就是位于表皮、真皮以及粘膜的不成熟DC，這些不成熟

3、DC擔(dān)當(dāng)外周組織免疫系統(tǒng)哨兵的角色，也存在于肺組織的上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中。不成熟DC能夠捕獲并處理病毒抗原，形成包含主要組織相容性復(fù)合物（MHC）分子和結(jié)合肽的復(fù)合物。來源于受損組織或微生物產(chǎn)物的信號(hào)可以觸發(fā)DC向引流淋巴組織的遷移，遷移過程中，DC逐漸發(fā)育成熟并獲得一系列特征性的表面標(biāo)志，由此成為了免疫系統(tǒng)中最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞。成熟的DC可有效地活化靜息的T淋巴細(xì)胞，活化的T細(xì)胞可以進(jìn)入感染的部位，消滅病毒感染的細(xì)胞。因此，病毒和DC之間的相互作用對(duì)于病毒感染的結(jié)果及其致病機(jī)理都十分重要。Beckebaum等2及Arimas等3均在HBV感染者的DC中檢測(cè)到HBV DNA及HBV mRNA，

4、這提示DC可能也是HBV侵襲的肝外宿主，HBV通過對(duì)血液和骨髓中DC前體細(xì)胞的直接感染改變DC的表型和功能2。而在非病毒性肝炎導(dǎo)致的慢性肝病患者中DC功能正常4，進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)。但也有研究者認(rèn)為在DC內(nèi)檢測(cè)到的HBV DNA和mRNA是DC對(duì)游離于外周血的HBV顆粒非特異性攝取的結(jié)果5，HBV感染者的DC胞漿中也并未檢測(cè)到前S1轉(zhuǎn)錄體和HBV前基因組轉(zhuǎn)錄所必需的HNF 1和HNF 46，在野生型和重組型HBV感染的DC中也都未發(fā)現(xiàn)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的存在5。雖然HBV是否能夠感染DC尚未確定，但DC功能的損傷是慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB

5、）患者體內(nèi)T細(xì)胞和B細(xì)胞呈現(xiàn)低反應(yīng)的主要原因。早在2001年，王福生教授就對(duì)分別對(duì)CHB和健康人的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）進(jìn)行離體培養(yǎng)，在多種細(xì)胞因子和趨化因子的作用下均可誘導(dǎo)出成熟DC的典型形態(tài)學(xué)標(biāo)志。然而，CHB患者的DC無論是在數(shù)量上還是在增殖能力上與健康人相比都有顯著的降低，特別是CHB患者DC表面的HLA-DR, CD80和CD86的表達(dá)水平均較健康人顯著降低。同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(allogenic mixed lymphocyte reaction, AMLR)也證實(shí)CHB患者的DC在誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答和產(chǎn)

6、生IL-12能力方面顯著下降7。Beckebaum等的研究也發(fā)現(xiàn)，CHB患者的DC的數(shù)量和表達(dá)共刺激分子的水平下降，同種免疫刺激活性受損，這些DC在受到前炎癥因子的刺激后，共刺激分子表達(dá)和IL-12的分泌水平均升高，同種免疫刺激活性部分修復(fù)，但仍略低于健康人2。提示CHB患者的DC存在數(shù)量和功能的缺陷。van der Molen的研究發(fā)現(xiàn)，阿德福韋酯治療6個(gè)月后，隨著HBV 載量下降和ALT水平的復(fù)常，髓樣DC（myeloid dendritic cell, mDC）的水平明顯升高，基本達(dá)到健康者水平，mDC的同種免疫刺激活性，分泌腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor al

7、pha, TNF-）和IL-12的能力在治療后也顯著增強(qiáng)，但漿細(xì)胞樣DC（plasmacytoid dendritic cell, pDC）卻沒有明顯變化8。Zheng等9對(duì)應(yīng)用拉米夫定治療后的CHB患者DC的研究也發(fā)現(xiàn)，拉米夫定治療后DC表達(dá)CD1、CD83和HLA-DR的水平升高，分泌IL-12水平升高，IL-6水平降低。上述研究結(jié)果讓科學(xué)家看到了應(yīng)用DC打破CHB患者免疫耐受的可能性，基于DC的HBV治療性疫苗的研究一時(shí)間成為研究熱點(diǎn)。Shimizu等10利用HBsAg致敏的DC來免疫HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)DC疫苗可以打破對(duì)HBV的免疫耐受并誘導(dǎo)有效的抗病毒免疫應(yīng)答。由于尿酸可以提高DC

8、表面CD80和CD86的表達(dá)11，Ma等12就以尿酸作為免疫佐劑與HBsAg致敏的DC疫苗聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)此法可以顯著上調(diào)小鼠骨髓來源DC分泌IFN-的能力并下調(diào)分泌IL-4的能力。Chen等13發(fā)現(xiàn)經(jīng)過體外誘導(dǎo)的自體HBsAg致敏的DC疫苗可以有效的抑制HBV的復(fù)制，減少血清中的病毒載量，消除HBeAg或促進(jìn)HBeAg/抗HBe的血清學(xué)轉(zhuǎn)換。同時(shí)發(fā)現(xiàn)自體HBsAg致敏的DC疫苗不僅對(duì)于ALT水平高的患者有效，對(duì)于正常水平的ALT患者也同樣有效，并且自體HBsAg致敏的DC疫苗聯(lián)合應(yīng)用拉米夫可以更加有效的清除病毒。王福生教授的課題組也發(fā)現(xiàn)，CpG活化的pDC能促進(jìn)HBcAg處理的單核細(xì)胞來源的D

9、C（core-DC）的成熟和IL-12的分泌。這些CpG活化的pDC能夠協(xié)同core-DC在體外誘導(dǎo)自體HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖和IFN-的分泌14。DC在慢性丙型肝炎感染中的研究在近兩年也有了最新進(jìn)展。雖然同為慢性病毒感染，但HBV與HCV對(duì)DC的影響卻大相徑庭。雖然慢性HCV感染中也存在DC功能缺陷，但研究發(fā)現(xiàn)，HCV（JFH1株）可上調(diào)mDC表面CD83、CD86和CD40的表達(dá)，雖然HCV并不抑制Toll樣受體（TLR）3的配體ploy I:C介導(dǎo)的mDC的成熟，但卻可以抑制poly I:C活化初始CD4+T細(xì)胞的能力15。Dolganiuc等16的研究發(fā)現(xiàn)mDC可誘導(dǎo)HC

10、V感染者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)感染慢性化。Mengshol等17對(duì)HCV 1亞型感染患者分別在治療前2周和治療24周后外周血中的DC進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在治療前2周HCV感染者pDC和mDC的水平均明顯低于健康者，治療24周后應(yīng)答的患者pDC水平復(fù)常。pDC表面CD40和CD83，CXCR3和CXCR4在基線期顯著高于健康者的水平，對(duì)治療發(fā)生應(yīng)答的患者這些共刺激因子和趨化因子的水平隨著治療的進(jìn)行不斷下降，但其余標(biāo)志（如CD86和CCR7）并未升高提示這些DC僅具有部分活化表型，基線期pDC對(duì)CXCL12和CXCL10的趨化性并不能預(yù)測(cè)治療是否成功。Pachiadakis等18也對(duì)HCV感染者

11、的DC在應(yīng)用聚乙二醇干擾素-2b聯(lián)合利巴韋林治療前后的同種免疫刺激活性、HCV特異性T細(xì)胞應(yīng)答以及分泌IL-12的能力進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HCV RNA以及HCV核心抗原水平對(duì)DC的表型和同種免疫刺激活性均有影響，但感染HCV的基因型以及HCV核心蛋白對(duì)DC的功能并無影響，治療12周后血清HCV RNA仍為陽(yáng)性的患者抗病毒免疫并未得到改善，而HCV RNA轉(zhuǎn)陰的患者抗病毒能力提高。2、自然殺傷細(xì)胞和自然殺傷T細(xì)胞自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell, NK）來源于骨髓淋巴樣干細(xì)胞，其發(fā)育成熟依賴于骨髓和胸腺微環(huán)境。NK細(xì)胞主要分布于外周血和脾臟，不表達(dá)特異性抗原識(shí)別受體。NK細(xì)胞無

12、需抗原預(yù)先致敏，就可以直接殺傷某些腫瘤和病毒感染的靶細(xì)胞，因此在機(jī)體抗腫瘤和早期抗病毒或胞內(nèi)寄生菌感染的免疫過程中發(fā)揮重要作用。在腫瘤或病毒特異性IgG抗體存在的條件下，NK細(xì)胞也可以通過表面IgG Fc受體（FcRIII）介導(dǎo)，通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC），識(shí)別殺傷與IgG抗體特異性結(jié)合的腫瘤或病毒感染的靶細(xì)胞。此外，NK細(xì)胞活化后，還可以通過分泌IFN-、IL-2和TNF等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。自然殺傷T細(xì)胞（natural killer T cells, NKT cells

13、）是一類能夠識(shí)別MHC-I類分子相關(guān)的抗原提呈CD1d分子限制性的脂類和糖脂抗原的固有樣T細(xì)胞，它兼具T細(xì)胞和NK細(xì)胞的表型特征（TCR和NK1.1NKRP1C、Ly-49）。CD1d限制性的NKT細(xì)胞有兩種亞型：I型NKT細(xì)胞，也叫做恒定型NKT（invariant NKT, iNKT）細(xì)胞，表達(dá)高度限制性的TCR組成，在小鼠表達(dá)TCR V14-J18和V8.2, -7或-2鏈，相應(yīng)的在人類即表達(dá)TCR V24-J18和V11鏈；II型NKT細(xì)胞，也稱為非恒定型NKT（non-iNKT）細(xì)胞，則表達(dá)更加多變的TCR組成。目前，對(duì)于NKT細(xì)胞的研究主要集中于iNKT細(xì)胞，因?yàn)槿祟惡托∈蟮膇NK

14、T細(xì)胞都可以和糖脂類物質(zhì)-半乳糖?；拾贝迹? galactosylceramide, -GalCer）反應(yīng)，應(yīng)用熒光標(biāo)記的-GalCer標(biāo)記CD1d分子可以準(zhǔn)確標(biāo)記iNKT細(xì)胞。iNKT細(xì)胞的另一重要特征是經(jīng)TCR信號(hào)活化后可以迅速（幾小時(shí)內(nèi)）產(chǎn)生Th1和Th2型細(xì)胞因子，同時(shí)，經(jīng)TCR信號(hào)活化的iNKT細(xì)胞也可以活化多種其它類型的細(xì)胞，如：DC、NK細(xì)胞、B細(xì)胞和一般的T細(xì)胞。所以說，iNKT細(xì)胞可以有力的影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答和一系列宿主防御反應(yīng)和病理過程?？茖W(xué)家們?cè)谘芯筷P(guān)于體內(nèi)NK細(xì)胞與NKT細(xì)胞之間的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn),活化的NKT細(xì)胞通過其表面的NK1.1分子與NK細(xì)胞結(jié)合激活NK細(xì)胞，使NK

15、細(xì)胞產(chǎn)生大量的IFN-，經(jīng)過一定的潛伏期之后，還能夠激活CD8+T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞19。因此，機(jī)體內(nèi)NKT 細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞是處于一種鏈鎖狀態(tài)，在抗病毒的過程中均發(fā)揮重要作用。由于NK細(xì)胞在正常肝臟中大量存在，約占肝內(nèi)淋巴細(xì)胞的1/3，在機(jī)體抗HBV感染的固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，肝內(nèi)的NK細(xì)胞可直接被病毒活化或間接被其他細(xì)胞（如：NKT細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞等）活化，通過其天然細(xì)胞毒性和產(chǎn)生高水平細(xì)胞因子發(fā)揮抗病毒效應(yīng)，同時(shí)可調(diào)節(jié)其它淋巴細(xì)胞（如：T細(xì)胞、B細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞等）的功能，調(diào)控機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答20。早在1991年，西班牙學(xué)者Echevarria等21就發(fā)現(xiàn)急性乙型

16、肝炎（AHB）患者病程早期外周血NK細(xì)胞的活性和IL-2的水平顯著升高，兩者呈正相關(guān)，恢復(fù)期兩者水平逐漸復(fù)常。研究還發(fā)現(xiàn)，HBV DNA陽(yáng)性患者NK細(xì)胞活性和IL-2水平高于健康者，但HBV DNA陰性患者卻與健康人無顯著差異。NK細(xì)胞活性和IL-2水平在HBeAg陽(yáng)性和HBeAb陽(yáng)性患者也無明顯差異。提示NK細(xì)胞能夠早期控制HBV感染。Dunn等22也發(fā)現(xiàn)，CHB患者肝臟炎癥程度與IL-8、IFN-及表達(dá)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand, TRAIL）的NK細(xì)胞相關(guān)。CHB患者肝臟內(nèi)富集

17、活化并表達(dá)TRAIL的NK細(xì)胞，其肝細(xì)胞表達(dá)TRAIL死亡誘導(dǎo)受體的水平也升高。這些患者體內(nèi)IFN-水平的升高可活化NK細(xì)胞，誘導(dǎo)TRAIL介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果均提示，NK細(xì)胞可能通過TRAIL介導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡在肝臟炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。2000年，美國(guó)Scripps研究所對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中的NKT細(xì)胞進(jìn)行了分析，-GalCer注射24小時(shí)內(nèi)，小鼠肝臟中檢測(cè)到IFN-g和IFN-/的表達(dá)，HBV復(fù)制體消失，此過程是暫時(shí)性的，隨著NKT細(xì)胞的快速消失而終止。對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的CD4+和CD8+T細(xì)胞進(jìn)行抗體介導(dǎo)的剔除處理后再注射-GalCer仍然能夠觸發(fā)肝臟中HBV的清除，提示傳統(tǒng)的T

18、細(xì)胞并不參與此過程。但-GalCer介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)在IFN-g或IFN-/受體缺陷的小鼠內(nèi)被抑制，提示-GalCer介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)是由IFN-g、IFN-/介導(dǎo)的?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，作者認(rèn)為-GalCer可以通過直接活化肝臟NKT細(xì)胞和間接活化NK細(xì)胞分泌抗病毒細(xì)胞因子抑制HBV復(fù)制，固有免疫應(yīng)答同適應(yīng)性免疫應(yīng)答一樣，都可以在HBV感染過程中控制病毒復(fù)制23。Baron等24也發(fā)現(xiàn)non-iNKT細(xì)胞（CD1d限制性但對(duì)-GalCer無應(yīng)答）在急性HBV感染表達(dá)HBV病毒抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟中被活化，提示non-iNKT細(xì)胞也可能參與了機(jī)體抗HBV感染的免疫應(yīng)答。NKG2D及其配體在no

19、n-iNKT細(xì)胞介導(dǎo)的抗HBV感染免疫應(yīng)答和急性肝炎過程中發(fā)揮重要作用。HBV感染可調(diào)控細(xì)胞表面NKG2D及其配體維甲酸早期誘導(dǎo)因子-1或RAE-1的表達(dá)，阻斷NKG2D與其配體的相互作用可完全阻止HBV和CD1d依賴的、non-iNKT細(xì)胞介導(dǎo)的急性肝炎和肝臟損害，因此活化NKT細(xì)胞也可能作為治療CHB新的方法和手段25。在我國(guó)，田志剛教授的課題組多年來致力于NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞在HBV感染中的研究。2005年，田教授的課題組就證實(shí)了慢性HBsAg攜帶轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細(xì)胞的功能，發(fā)現(xiàn)慢性HBsAg攜帶小鼠肝臟內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量下降，肝臟內(nèi)NK細(xì)胞的天然活化能力和細(xì)胞毒性均有所減弱，這可能與肝

20、臟NK細(xì)胞表面TRAIL表達(dá)的下調(diào)相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟內(nèi)活化的NK細(xì)胞抗腫瘤活性明顯受損，發(fā)生肝細(xì)胞肝癌的幾率明顯上升26。向野生型小鼠和HBV轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔內(nèi)分別注射不同劑量的poly I:C，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)poly I:C介導(dǎo)的肝臟損傷過度敏感，此過程完全是由NK細(xì)胞及肝臟內(nèi)NK細(xì)胞分泌的IFN-g介導(dǎo)的。轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞在表面poly I:C作用下IFN-g受體表達(dá)明顯升高，應(yīng)用IFN-g預(yù)處理可誘發(fā)轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞下游信號(hào)通路（pSTAT1-IRF-1）活化。剔除Kupffer細(xì)胞或中和內(nèi)源性IL-12并不影響poly I:C介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟損害。提示NK細(xì)胞在po

21、ly I:C介導(dǎo)的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟損傷中發(fā)揮重要作用，此過程是由IFN-g介導(dǎo)的，但Kupffer細(xì)胞和IL-12并不參與此過程27。為進(jìn)一步研究NK細(xì)胞在慢性HBV感染肝臟損害中的分子機(jī)制，田教授的課題組發(fā)現(xiàn)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在受到ConA刺激后肝細(xì)胞NKG2D配體（Rae-1和Mult-1）表達(dá)明顯升高，由于NKG2D配體可以通過識(shí)別NKG2D/Rae-1或Mult-1顯著活化肝臟NK細(xì)胞，對(duì)野生型小鼠無肝臟毒性的低劑量ConA卻可導(dǎo)致HBV轉(zhuǎn)基因小鼠嚴(yán)重的肝臟損害。提示NK細(xì)胞可通過識(shí)別肝細(xì)胞上的NKG2D導(dǎo)致慢性HBV感染中的肝臟損害28。在有關(guān)NKT細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，肝部分切除術(shù)（

22、partial hepatectomy, PHx）可誘發(fā)NKT細(xì)胞在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠剩余肝臟中的聚集，同時(shí)可提高肝臟再生早期肝臟NKT細(xì)胞表面CD69的表達(dá)和IFN-g的分泌增多，這導(dǎo)致PHx誘導(dǎo)肝臟再生的延遲。剔除NKT細(xì)胞，阻斷CD1d與NKT細(xì)胞的相互作用，以及中和IFN-g均可使轉(zhuǎn)基因小鼠受損的肝臟再生功能得以明顯改善，但剔除NK細(xì)胞并不能達(dá)到此效果，提示活化的NKT細(xì)胞在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠PHx模型的肝臟再生中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用29。慢性HCV感染中NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的變化與慢性HBV感染相似。Corado等30發(fā)現(xiàn)HCV感染者NK細(xì)胞的殺傷活性較健康人低4倍，且剔除B細(xì)胞不能逆轉(zhuǎn)殺傷

23、活性的損傷。HCV感染也可導(dǎo)致NK細(xì)胞受體NKG2D的表達(dá)水平降低31。Kawarabayashi等32的研究也證實(shí)HCV感染者及HCV導(dǎo)致的肝硬化患者肝臟內(nèi)NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的比例均明顯降低，并且分泌IFN-g及對(duì)K562細(xì)胞、Raji細(xì)胞及HuH-7細(xì)胞的殺傷作用在肝硬化患者中顯著降低。但PBMC中這些細(xì)胞的比例和功能則未顯著改變。經(jīng)聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療產(chǎn)生持續(xù)應(yīng)答的HCV感染者肝臟內(nèi)NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)上升33。體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證明，Huh細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)或在其培養(yǎng)液中加入NK細(xì)胞的培養(yǎng)上清均可以顯著降低Huh細(xì)胞中HCV RNA的水平，NK細(xì)胞上清可誘導(dǎo)Huh

24、細(xì)胞高表達(dá)IFN-/和干擾素調(diào)節(jié)因子（IFN regulatory factor, IRF）3和IRF-7，激活I(lǐng)FN介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮抗病毒效應(yīng)34。以上結(jié)果均提示，HCV感染可導(dǎo)致NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的數(shù)量和功能受損，發(fā)生肝細(xì)胞癌的可能性上升。二、Toll樣受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑Toll樣受體(Toll like receptors, TLRs)是一類重要的免疫分子，屬于I型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3部分組成，TLRs僅識(shí)別表達(dá)在病原微生物上的高度保守的結(jié)構(gòu)基序，宿主通過TLRs感受入侵的外來分子，產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答。TLRs主要表達(dá)在具有免疫功能的組織和細(xì)胞中，不同的TLR

25、s識(shí)別的配基各不相同，TLR2能識(shí)別許多種病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern, PAMP），包括細(xì)菌脂多糖（LPS）、肽聚糖和胞壁酸；TLR3識(shí)別病毒雙鏈RNA；TLR4可識(shí)別細(xì)菌的LPS；TLR5識(shí)別細(xì)菌鞭毛蛋白；TLR7和TLR8能識(shí)別一些人工合成的抗病毒小分子；TLR9識(shí)別細(xì)菌CpG DNA。TLRs能監(jiān)視與識(shí)別病原體結(jié)構(gòu)成分，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)特異性基因表達(dá)，分泌細(xì)胞因子或趨化因子，這是TLRs活化最重要的效應(yīng)。TLRs信號(hào)還能募集活化NK細(xì)胞、DC，促進(jìn)DC向T細(xì)胞提呈抗原，啟動(dòng)T細(xì)胞應(yīng)答?；罨疶細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子

26、（如IFN-）又進(jìn)一步活化單核巨噬細(xì)胞，借助TLR的橋梁作用，固有免疫和適應(yīng)性免疫被緊密聯(lián)系起來。Xu等35研究發(fā)現(xiàn)HBV感染者外周血中TLR7在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均顯著降低，TLR9 mRNA水平降低但TLR9蛋白表達(dá)水平反而升高。TLRs蛋白表達(dá)水平與HBV DNA相關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者pDC的數(shù)量以及pDC表面TLR9表達(dá)水平較健康對(duì)照顯著下降，分泌IFN-的能力也受損36。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TLR3和TLR4能夠活化小鼠肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-及其它炎性介質(zhì)，發(fā)揮抑制HBV復(fù)制的功能37。而作為TLR家族中較早被發(fā)現(xiàn)的TLR2和TLR4，它們?cè)贖BV感染機(jī)體后數(shù)量和功能上的研究仍然

27、存在很多爭(zhēng)議。有研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血單核細(xì)胞、肝臟Kuffer細(xì)胞及肝細(xì)胞表面TLR2的表達(dá)顯著下降，但TLR4并無明顯變化38-40。但也有研究存在截然相反的發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為隨著乙型肝炎患者病情嚴(yán)重程度的增加，外周血單核細(xì)胞TLR2、TLR4表達(dá)水平和外周血TNF-的水平呈依次顯著升高，且TLR2/4的表達(dá)強(qiáng)度與TNF-的水平呈明顯正相關(guān)41。對(duì)CHB患者肝臟進(jìn)行免疫組化研究也發(fā)現(xiàn)，CHB患者肝臟組織中TLR2和TLR4的表達(dá)明顯升高，與肝臟組織的炎癥活動(dòng)密切相關(guān)42, 43。我室也對(duì)HBV感染者外周血TLR2和TLR4的表達(dá)進(jìn)行了研究，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HBV感染者（包括急性乙肝患者、

28、慢性乙肝患者及慢性HBV攜帶者）外周血CD14+單核細(xì)胞表面TLR2和TLR4的表達(dá)較健康對(duì)照者顯著升高，提示HBV感染可能通過上調(diào)TLR2和TLR4的表達(dá)影響機(jī)體的固有免疫應(yīng)答。為證實(shí)本研究結(jié)果，我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV全基因序列的HepGHBeAg刺激后TLR2的表達(dá)明顯升高，而CHB患者則無明顯變化，由于HBeAg在HBV感染早期就可在血清中檢測(cè)到，因此在病毒感染早期HBeAg可能作為主要的炎癥免疫應(yīng)答因子誘導(dǎo)TLR2的高表達(dá)，一旦形成慢性感染，HBeAg可能成為耐受原（tolerogen），維持機(jī)體免疫耐受的狀態(tài)，導(dǎo)致CHB患者的TLR2對(duì)HBe

29、Ag刺激不產(chǎn)生應(yīng)答，提示HBeAg在HBV不同的感染狀態(tài)下可能發(fā)揮免疫原（immunogen）和耐受原的雙重功能。人群遺傳背景和感染HBV病毒基因型的差異可能導(dǎo)致了不同研究機(jī)構(gòu)出現(xiàn)相反的結(jié)果，這些相反的結(jié)果仍需要大規(guī)模的隊(duì)列研究去驗(yàn)證。HCV與TLRs關(guān)系的研究取得了振奮人心的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，由于TLR7和TLR9在清除HCV感染中發(fā)揮重要作用，利用TLRs受體激動(dòng)劑作為免疫調(diào)節(jié)劑治療慢性HCV感染進(jìn)入了人們的視線。但是TLRs受體激動(dòng)劑的開發(fā)卻喜憂參半。CPG 10101（Actilon）是一種人工合成的TLR9的激動(dòng)劑，Coley 制藥公司在健康受試者中進(jìn)行了有關(guān)CPG 10101的藥物安

30、全性、藥代動(dòng)力學(xué)及免疫效應(yīng)的隨機(jī)、雙盲試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)皮下注射試驗(yàn)劑量的CPG 10101未發(fā)生嚴(yán)重不良事件，并且能有效的刺激TLR9的生物學(xué)活性，機(jī)體中抗病毒細(xì)胞因子2'-5'寡腺苷酸合成酶（2,5-oligoadenylate synthetase，2,5-OAS）持續(xù)數(shù)天高水平44。應(yīng)用CPG 10101治療慢性丙型肝炎的多中心Ib期臨床試驗(yàn)隨之進(jìn)行。60例HCV感染者（其中50例為HCV 1亞型病毒感染）被隨機(jī)分組，接受安慰劑或不同劑量CPG 10101皮下注射，研究發(fā)現(xiàn)，接受0.75mg/kg CPG 10101注射后24小時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生IFN-g誘導(dǎo)蛋白-10、IFN-和2

31、,5-OAS均較基線水平顯著上升。HCV RNA在CPG 10101注射組治療后顯著降低，呈劑量依賴性，在0.75mg/kg組降低最為明顯 45。但是，在 2007 年 1 月，Coley公司中止了CPG 10101的臨床開發(fā)，因?yàn)樵贗I期臨床試驗(yàn)中，該化合物并未能明顯降低患者的 HCV 病毒載量。艾沙托立賓（Isatoribine）是選擇性TLR7的激動(dòng)劑，研究發(fā)現(xiàn)，每日靜脈注射艾沙托立賓800mg，連續(xù)治療7天后血清中HCV RNA的水平明顯下降，長(zhǎng)期療效也較好，僅發(fā)生了輕微的病毒學(xué)逆轉(zhuǎn)46。這似乎讓人們?cè)俅慰吹搅诵滦兔庖咧苿┲委烪CV感染的曙光，Anadys制藥公司和諾華公司也開始了對(duì)艾

32、沙托立賓的口服前體藥物ANA975的臨床試驗(yàn)，但由于發(fā)現(xiàn)了動(dòng)物毒性，兩家公司不得不在2007年8月停止了ANA975的臨床試驗(yàn)。盡管有上述這些失敗，一種可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平和持久的內(nèi)源性干擾素的新型免疫系統(tǒng)激活劑正在慢性HCV感染患者中進(jìn)行期試驗(yàn)。Idera制藥公司開發(fā)的IMO-2125是一個(gè)新合成的以DNA為基礎(chǔ)的TLR9激動(dòng)劑47。IMO-2125 獲得了很好的臨床前結(jié)果，可以比之前的化合物更有效地刺激靈長(zhǎng)類動(dòng)物IFN- 和IL-2的釋放。以這些結(jié)果為基礎(chǔ)，在2007年9月Idera公司開始了IMO-2125 治療 HCV 的期臨床試驗(yàn)，參加試驗(yàn)的是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療無反應(yīng)的慢性 HCV 感染者。考察

33、的方面包括 HCV RNA 水平和免疫系統(tǒng)的激活。我們對(duì)這種新型TLR激動(dòng)劑的效果拭目以待。三、結(jié)語近年來，固有免疫細(xì)胞和分子在肝臟疾病中的研究逐漸成為熱點(diǎn)深入了解這些細(xì)胞和分子在肝炎病毒感染中的功能、分布特點(diǎn)、相互作用和機(jī)制，特別是在肝臟原位的作用特點(diǎn)，將有助于我們闡明HBV持續(xù)感染的免疫耐受機(jī)制，并為發(fā)展針對(duì)HBV感染的免疫治療提供新的思路。參考文獻(xiàn)1. Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 1998;392:245-522. Beckebaum S, Cicinnati

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