HPLC培訓(xùn)教材2

1、色譜流動相概念介紹色譜流動相概念介紹 流動相導(dǎo)論流動相導(dǎo)論v溶劑系統(tǒng)可以是一種或多種水溶液 或有機溶劑攜帶樣品流經(jīng)色譜柱至檢測器 當與樣品發(fā)生相互作用時，樣品則發(fā)生分離 v選擇溶劑需考慮的問題 極性與溶劑強度 純度、過濾、除氣 與其他溶劑的互溶性 緩沖溶液與pH等梯度或梯度洗脫分析 流動相的要求v流動相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)流動相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。v純度純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關(guān)，特別是當溶劑所含雜質(zhì)在柱

2、上積累時。v必須與檢測器匹配必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。v粘度要低（應(yīng)粘度要低（應(yīng)2cp100 一一般般用用裝裝柱柱機機 制制備備柱柱 25-100 半半制制備備柱柱 5-25 毫毫克克級級至至克克級級制制備備 分分析析柱柱 2-5 典典型型為為4.6 mm 細細徑徑管管柱柱 0.8-0.2 金金屬屬柱柱或或PEEK柱柱 毛毛細細管管柱柱 0.05-0.5 填填充充柱柱或或開開管管柱柱 微微徑徑管管柱柱 納納米米管管柱柱 100 um、傳質(zhì)速度慢、柱效低中期：

3、薄殼型硅膠固定相v玻璃珠涂敷硅膠顆粒層 v30-40 um、孔徑均一，滲透性好， 溶質(zhì)擴散性快 v高效、分離快速，但樣品負載量低后期：全多孔微粒v2000溶于水溶于水分子量分子量2000溶于溶于 THF分子量分子量4 倍則更加保險倍數(shù)進進 樣樣進進 樣樣 量量全定量環(huán)進樣全定量環(huán)進樣準確，但浪費樣品至少需要2.5倍進樣體積的樣品部分定量環(huán)進樣部分定量環(huán)進樣進樣量 進樣環(huán)體積的一半無層流效應(yīng)的影響誤差來源于進樣針及操作人員使用內(nèi)標法將可以提高進樣的準確度檢檢 測測 器器 作用：作用：檢測色譜柱流出物組份濃度的變化理想的檢測器：理想的檢測器： 靈敏度高 對所有溶質(zhì)都有快速的相應(yīng) 不引起柱外譜帶擴展

4、 線性范圍寬 對樣品無破壞性 檢測器響應(yīng)對流量及溫度變化不敏感檢檢 測測 器器 分分 類類按檢測對象分類按檢測對象分類 整體性檢測器：檢測流動相的總體物理性質(zhì) 如：示差折光檢測器、電導(dǎo)檢測器 靈敏度低、易受溫度影響的波動、不適合梯度洗脫 溶質(zhì)性檢測器：測量溶質(zhì)的某種特性或物化性質(zhì)的變化 如：紫外檢測器、熒光檢測器 流動相不能有紫外吸收按選擇性分類按選擇性分類 選擇性檢測器：紫外檢測器、熒光檢測器、電導(dǎo)檢測器 通用性檢測器：示差折光檢測器檢檢 測測 器器 分分 類類v1）按原理分：為光學(xué)檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射）、熱學(xué)檢測器（如吸附熱）、電化學(xué)檢測器（如極譜、庫侖、安培）、電學(xué)

5、檢測器（電導(dǎo)、介電常數(shù)、壓電石英頻率）、放射性檢測器（閃爍計數(shù)、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測器。v2）按測量性質(zhì)分：為通用型和專屬型（又稱選擇性）。v通用型檢測器測量的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，它對溶劑和溶質(zhì)組分均有反應(yīng)，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。v專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質(zhì)，如紫外、熒光檢測器，它們只對有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。v3）按檢測方式分：濃度型和質(zhì)量型。v濃度型檢測器的響應(yīng)與流動相中組分的濃度有關(guān)，質(zhì)量型檢測器的響應(yīng)與單位時間內(nèi)通過檢測器的組分的量有關(guān)。v4）檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。檢測器的噪音和漂

6、移檢測器的噪音和漂移 噪音和漂移反應(yīng)了檢測器的穩(wěn)定性噪音和漂移反應(yīng)了檢測器的穩(wěn)定性 噪音噪音 無溶劑通過檢測器時，輸出信號的變化 電路及泵的脈沖引起短噪音，不影響色譜峰的分辨率，但影響檢測限 長噪音來自檢測器本身、或流動池有氣泡，溫度及流量的變化也會引起長噪音 漂移漂移 基線隨時間增加朝單一方向偏移 電源電壓不穩(wěn)、溫度及流動相發(fā)生緩慢變化 對分析誤差及檢測能力有影響檢測器的技術(shù)指標檢測器的技術(shù)指標靈敏度靈敏度 檢測器的主要性能指標，樣品進入檢測器的響應(yīng)信號 靈敏度越高檢測限越低檢測限檢測限 兩倍噪音時所需要的樣品量 檢測限小、檢測性能強、檢測時所需要的樣品少線性范圍線性范圍 檢測信號與被檢測物

7、呈線性關(guān)系的范圍 下限定義為兩倍噪音紫外紫外- -可見波長檢測器可見波長檢測器應(yīng)用范圍最廣泛的檢測器應(yīng)用范圍最廣泛的檢測器 大約占使用的70% 紫外光區(qū)：190370nm；可見光區(qū)：370700nm特點特點 靈敏度高、噪音低、線性范圍寬 為溶質(zhì)型檢測器、對流速和溫度的變化不敏感 為選擇性檢測器，必須使用無紫外吸收的溶劑作流動相為濃度型檢測器 為非破壞性檢測器，可與制備色譜或其他設(shè)備串聯(lián) 結(jié)構(gòu)簡單、維護方便I0IAbsorbedradiationTransmitted radiationIncident radiationReflectionbv A = log ( ) = a b cIoI紫外

8、紫外- -可見波長檢測器工作原理可見波長檢測器工作原理朗伯朗伯- -比爾定律：比爾定律：吸光度與化合物的濃度成正比檢測器流通池檢測器流通池ProStar 325 檢測器檢測器雙光程設(shè)計雙光程設(shè)計 適合高低濃度的檢測 可用于制備色譜的線性放大 可更換式流量池 不需要復(fù)雜的校準程序示差折光檢測器示差折光檢測器 v通用型檢測器 溶劑選擇合適幾乎可測所有的物質(zhì) v原理折射率：光在真空的速度和在某介質(zhì)中的速度之比光 光由一種介質(zhì)進入另一種介質(zhì)時發(fā)生折射現(xiàn)象 折射率隨溫度升高而降低 同一介質(zhì)對不同波長的光有不同折射率 示差折光檢測器的特點示差折光檢測器的特點 v屬通用型檢測器響應(yīng)值取決于柱后流出液折射率變

9、化 適合檢測 v無紫外吸收的物質(zhì) v流動相溶劑具有高紫外吸收 v濃度敏感型檢測器 響應(yīng)信號與溶質(zhì)濃度成正比 v中等靈敏度檢測器 不適合痕量分析 示差折光檢測器的特點（續(xù)）示差折光檢測器的特點（續(xù)）v對壓力、溫度變化相當敏感 需配置柱溫箱 v最常用的溶劑是水 不適合梯度洗脫 v檢測要求 流動相組成須恒定 控制恒溫 控制壓力恒定 v出口處不可以加限流 裝置 v檢測器串聯(lián)時，RI應(yīng) 放在最后 水甲醇和水水甲醇和水CH3CN混合物折射率混合物折射率 泵的維護保養(yǎng)（每日）泵的維護保養(yǎng)（每日）v每日維護保養(yǎng)檢查并記錄壓力是否在正常范圍 使用完畢后清洗流程 v先以水清洗v再以 ACN 或 MeOH 清洗v并

10、且將有機溶劑保留在系統(tǒng)中 v避免細菌滋生v每周維護保養(yǎng) 若使用緩沖溶液必須清洗比例閥若 v先以水清洗v再以 ACN 或 MeOH 清洗以水清洗 piston seal檢查溶劑瓶過濾頭是否暢通 v每月維護保養(yǎng)以超聲波、蒸餾水清洗溶劑瓶 檢查 prime 是否困難以觀察出口閥濾膜是否堵塞 泵的維護保養(yǎng)（每周、月）泵的維護保養(yǎng)（每周、月）六通閥使用和維護注意事項v樣品溶液進樣前必須用0.45m濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。v轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。v為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，

11、每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。 泵的簡易故障排除泵的簡易故障排除v分析柱壓力每日記錄 v電源開啟失敗檢查插頭、電線及保險絲 v開啟后儀器自檢 若失敗，請記錄 Error Log （視機型而定）檢查操作手冊泵的簡易故障排除泵的簡易故障排除 壓力過壓力過高高v壓力過高混合室 0.5um 濾膜阻塞，更換濾膜 色譜柱或預(yù)柱的 frit 阻塞， 倒沖或更換 frit，樣品與溶劑需 過濾不恰當?shù)牧魉?，檢查管柱 ID以及溶劑程序 高黏度溶劑，開發(fā)方法、改變 溶劑黏度 管路系統(tǒng)阻塞，從檢測器往輸液泵檢查，找出問題點。 輸液泵簡易故障排除輸液泵簡易故障排除

12、壓力過低v壓力顯示過低 未進行 prime，入口管路存在空氣 purge 和 prime 閥未關(guān)好 系統(tǒng)漏，檢查接頭處 活塞漏，觀察溶劑是否從泵頭 后面漏出 出口或入口單向閥損壞 、更 換新閥比例閥阻塞，操作時聽不到比例閥 工作的聲音 溶劑瓶中的溶劑太少，檢查入口管線是否有氣泡 溶劑瓶內(nèi)過濾頭阻塞，更換或清潔濾頭 與檢測器有關(guān)的故障及其排除v1）流動池內(nèi)有氣）流動池內(nèi)有氣v基線上出現(xiàn)許多線狀“峰”，v這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡需要對流動相進行充分的除氣，檢查整個色譜系統(tǒng)是否漏氣，氣泡停留在流動池內(nèi)也可能使噪音增大，v2）流動池被污染）流動池被污染v無論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移。

13、v可以使用適當溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴重，就需要依次采用磷酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進行清洗、更換窗口。v3）光源燈出現(xiàn)故障）光源燈出現(xiàn)故障v紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時，可能產(chǎn)生嚴重噪音，基線漂移，出現(xiàn)平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時需要更換光源燈。v4）倒峰）倒峰v檢測器的極性接反了，v用示差折光檢測器時，如果組分的折光指數(shù)低于流動相的折光指數(shù)，也會出現(xiàn)倒峰，這就需要選擇合適的流動相。v紫外檢測器，如果流動相中含有紫外吸收的雜質(zhì)，無吸收的組分就會產(chǎn)生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動相。v在死時間附近的尖銳峰往往是由于進樣時的壓

14、力變化，或者由于樣品溶劑與流動相不同所引起的 氣泡引起的問題氣泡引起的問題 v色譜峰保留時間、面積改變 溶劑瓶內(nèi)氣泡產(chǎn)生，引起輸液不良 泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，引起輸液不良 氣泡引起的問題氣泡引起的問題 色譜峰變形v色譜峰變形色譜柱內(nèi)氣泡產(chǎn)生、滯留 引起峰變形氣泡引起的問題氣泡引起的問題 噪聲v針狀、鋸齒狀噪聲峰流通池內(nèi)氣泡產(chǎn)生、滯留 引起基線噪聲 氣泡引起的問題氣泡引起的問題 基線波動大v紫外檢測器基線波動大 氣泡存在，其中氧溶解量過 多造成檢測不良 紫外、熒光、示差折光檢測 器 保留時間漂移保留時間漂移 系統(tǒng)有漏 流速變化 柱穩(wěn)變化（或室穩(wěn)變化），確認 柱溫箱溫度 不正確的梯度洗脫程序 色譜柱的固定相已發(fā)生改變 樣品流出色譜柱后，再生時間 不足（柱后衍生）溫度的影響v柱子的恒溫精度要求在0.10.5之間，v不同的檢測器對溫度的敏感度不