EColi_感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化、提取與酶切鑒定

1、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)5454E.Coli E.Coli 感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒DNADNA的轉(zhuǎn)化、提取與酶切鑒定的轉(zhuǎn)化、提取與酶切鑒定 制作人：劉如石制作人：劉如石一一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵髮?shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?1、通過(guò)本實(shí)驗(yàn)了解和掌握氯化鈣法制備大腸桿菌感通過(guò)本實(shí)驗(yàn)了解和掌握氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒DNADNA轉(zhuǎn)化受體菌細(xì)胞的原理與技術(shù)；轉(zhuǎn)化受體菌細(xì)胞的原理與技術(shù)；2 2、了解質(zhì)粒了解質(zhì)粒DNA的特性，掌握堿裂解法從大腸桿菌的特性，掌握堿裂解法從大腸桿菌細(xì)胞中分離、提取質(zhì)粒細(xì)胞中分離、提取質(zhì)粒DNA的方法；的方法；3、掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電、掌握

2、限制性內(nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法；泳的操作方法； 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)了解大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備、通過(guò)本實(shí)驗(yàn)了解大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備、DNA轉(zhuǎn)化、限制性內(nèi)切酶在分子生物學(xué)研究中的意義與作轉(zhuǎn)化、限制性內(nèi)切酶在分子生物學(xué)研究中的意義與作用。用。二二.實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 1 1、感受態(tài)細(xì)胞制備、感受態(tài)細(xì)胞制備: :所謂所謂感受態(tài)感受態(tài)是指受體細(xì)胞處是指受體細(xì)胞處于容易吸收外源于容易吸收外源DNADNA的一種生理狀態(tài)，可以通過(guò)物理的一種生理狀態(tài)，可以通過(guò)物理與化學(xué)方法誘導(dǎo)形成，也可以自然形成，在基因工與化學(xué)方法誘導(dǎo)形成，也可以自然形成，在基因工程技術(shù)中通常采用誘導(dǎo)的方法。用于轉(zhuǎn)化的受體菌程技術(shù)

3、中通常采用誘導(dǎo)的方法。用于轉(zhuǎn)化的受體菌細(xì)胞一般是細(xì)胞一般是限制限制- -修飾系統(tǒng)（修飾系統(tǒng)（Restriction-Restriction-ModificationModification）缺陷的變異株，以防止對(duì)導(dǎo)入的外缺陷的變異株，以防止對(duì)導(dǎo)入的外源源DNADNA的切割，用符號(hào)的切割，用符號(hào)R R- -M M- -表示。其基本原理是：細(xì)表示。其基本原理是：細(xì)菌處于菌處于00的的CaClCaCl2 2低滲溶液中，會(huì)膨脹成球形，細(xì)胞低滲溶液中，會(huì)膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒膜的通透性發(fā)生變化，轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒DNADNA形成形成抗抗DNaseDNase的羥基的羥基-

4、-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)經(jīng) (4) (4)、有不同來(lái)源的限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別相同的序列，、有不同來(lái)源的限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別相同的序列，甚至切割的位點(diǎn)也相同，稱為甚至切割的位點(diǎn)也相同，稱為同裂酶同裂酶或或異源同工酶異源同工酶，如，如Hpa IIHpa II與與Msp IMsp I；有的識(shí)別位點(diǎn)不同，但對(duì)；有的識(shí)別位點(diǎn)不同，但對(duì)DNADNA切割后可產(chǎn)切割后可產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為生相同的粘性末端，稱為同尾酶同尾酶，如，如BamHBamH I I與與BglBgl IIII。色，可確定色，可確定DNA在膠中的位置。在膠中的位置。 影響瓊脂糖凝膠電泳影響瓊脂糖凝膠電

5、泳DNADNA遷移率的因素：遷移率的因素： DNADNA的分子大??；的分子大??； 瓊脂糖濃度；瓊脂糖濃度； DNADNA構(gòu)象；構(gòu)象； 電場(chǎng)強(qiáng)度；電場(chǎng)強(qiáng)度； 堿基組成與溫度；嵌入染料的存在；電泳緩沖液的組成。堿基組成與溫度；嵌入染料的存在；電泳緩沖液的組成。 三實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備：三實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備：1 1、用品與與儀器：、用品與與儀器： 超凈工作臺(tái)、電熱恒溫水浴、分光光度計(jì)、恒溫培養(yǎng)超凈工作臺(tái)、電熱恒溫水浴、分光光度計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、移液器、微型離心管等、臺(tái)式冷凍高速箱、恒溫振蕩器、移液器、微型離心管等、臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、旋渦震蕩器、電泳儀、電泳槽、紫外透射儀，凝離心機(jī)、旋渦震蕩器、電泳

6、儀、電泳槽、紫外透射儀，凝膠成像儀、冰箱、制冰機(jī)等；膠成像儀、冰箱、制冰機(jī)等； 1.5mL 1.5mL 與與0.5mL Eppendorf 0.5mL Eppendorf 管、管、tiptip頭頭 、燒杯、量、燒杯、量筒筒四操作步驟四操作步驟: ( (一一) ) 感受態(tài)細(xì)胞的制備：感受態(tài)細(xì)胞的制備： 1 1、從新活化的、從新活化的E.coliE.coli DH5 DH5平板上挑取一平板上挑取一單菌落單菌落，接種于接種于3 35ml LB5ml LB液體培養(yǎng)中，液體培養(yǎng)中，3737振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期期( (12h左右左右) )； 2 2、將該菌懸液以、將該菌懸液以1:1001

7、:1001:501:50轉(zhuǎn)接于轉(zhuǎn)接于100ml LB100ml LB液體液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，3737振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開(kāi)始出現(xiàn)混濁振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開(kāi)始出現(xiàn)混濁后，每隔后，每隔202030min30min測(cè)一次測(cè)一次ODOD600600，至，至ODOD600600為為0.30.30.50.5時(shí)停時(shí)停止培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)裝到止培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)裝到1.5 mL1.5 mL離心管中；離心管中； 3 3、培養(yǎng)物于冰上放置、培養(yǎng)物于冰上放置20min20min； 4 4、 0 044，4000g4000g離心離心10min10min，棄去上清液，加入，棄去上清液，加入1 1 mLmL冰冷的冰冷的0.1mo

8、10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液，小心懸浮細(xì)胞溶液，小心懸浮細(xì)胞, , 冰浴冰浴2020分鐘；分鐘；CaClCaCl2 2純度至關(guān)重要，不同廠家，純度至關(guān)重要，不同廠家，甚至同一廠家不同批號(hào)的產(chǎn)品均影響感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率甚至同一廠家不同批號(hào)的產(chǎn)品均影響感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率 5、04， 4000g離心離心10min，倒凈上清培養(yǎng)液，倒凈上清培養(yǎng)液，再用再用1.0 mL1.0 mL冰冷的冰冷的0.1mo10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液溶液輕輕懸浮輕輕懸浮細(xì)胞，細(xì)胞，冰浴冰浴20min20min； 6 6、 04， 4000g離心離心10min，棄去上清液，加入棄去上清液，

9、加入100 L100 L冰冷的冰冷的0.1mo10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液，溶液，小心懸浮細(xì)胞小心懸浮細(xì)胞，冰，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液；上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液； 8 8、制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，、制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，如果在如果在4 4放置放置1224h，其轉(zhuǎn)化效率可以增高，其轉(zhuǎn)化效率可以增高46倍倍；也可加入占總體積也可加入占總體積1515左右高壓滅菌過(guò)的甘油，混勻后左右高壓滅菌過(guò)的甘油，混勻后分裝于分裝于1.5ml1.5ml離心管中，置于離心管中，置于-70-70條件下，可保存半年條件下，可保存半年至一

10、年。至一年。（二）質(zhì)粒（二）質(zhì)粒DNADNA的轉(zhuǎn)化：的轉(zhuǎn)化： 1 1、每、每100L100L感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入1L1L質(zhì)粒質(zhì)粒DNA,DNA,輕輕輕輕搖勻，同時(shí)設(shè)置三組對(duì)照：搖勻，同時(shí)設(shè)置三組對(duì)照：( (1)1)不加質(zhì)粒，不加質(zhì)粒，(2)不加受體不加受體菌，菌， (3)加已知具有轉(zhuǎn)化活性的質(zhì)粒加已知具有轉(zhuǎn)化活性的質(zhì)粒DNA，具體操作按具體操作按下表進(jìn)行：下表進(jìn)行：*陽(yáng)性對(duì)照，用已知具有轉(zhuǎn)化活性的pGEX-PDIP-r質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化 五五. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告：實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告： 1、轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算、轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算 ： 轉(zhuǎn)化子總數(shù)菌落數(shù)（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積轉(zhuǎn)化子總數(shù)菌落數(shù)（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂涂板菌液體積）板菌液體積） 轉(zhuǎn)化