單個(gè)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)檢測(cè)方法的確認(rèn)

1、單個(gè)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)檢測(cè)方法的確認(rèn)單個(gè)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)檢測(cè)方法的確認(rèn)National Association of Testing Authorities(NATA)概要概要 基本情況基本情況 單個(gè)實(shí)驗(yàn)室方法確認(rèn)的接受單個(gè)實(shí)驗(yàn)室方法確認(rèn)的接受 什么是確認(rèn)方法？什么是確認(rèn)方法？ 什么是方法確認(rèn)？什么是方法確認(rèn)？ 化學(xué)檢測(cè)方法確認(rèn)需要十個(gè)步驟化學(xué)檢測(cè)方法確認(rèn)需要十個(gè)步驟例如例如: 確認(rèn)一個(gè)方法去檢測(cè)動(dòng)物組織中抗生素的殘留確認(rèn)一個(gè)方法去檢測(cè)動(dòng)物組織中抗生素的殘留基本情況基本情況 NATA Technical Note 17 (new version) IUPAC Harmonized Guidelines fo

2、r Single Lab. Validation LGC (UK) In-house Method Validation a Guide for Chemical Laboratories標(biāo)準(zhǔn)方法標(biāo)準(zhǔn)方法 Organisation for International Standardisation (ISO) American Society for Testing Materials (ASTM) Association of Official Agricultural Chemists (AOAC) Standards Australia British StandardsPublicat

3、ion of Standard Methods a specialist, core business of the organisations concerned標(biāo)準(zhǔn)方法標(biāo)準(zhǔn)方法 要通過(guò)很多實(shí)驗(yàn)室的合作研究來(lái)確認(rèn)要通過(guò)很多實(shí)驗(yàn)室的合作研究來(lái)確認(rèn).過(guò)程慢過(guò)程慢 在方法需要與方法建立之間有很長(zhǎng)的時(shí)間滯后性在方法需要與方法建立之間有很長(zhǎng)的時(shí)間滯后性方法驗(yàn)證方法驗(yàn)證Method Verification 沒(méi)有方法確認(rèn)這么嚴(yán)格沒(méi)有方法確認(rèn)這么嚴(yán)格 是否實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行都得要專(zhuān)門(mén)的標(biāo)準(zhǔn)方法是否實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行都得要專(zhuān)門(mén)的標(biāo)準(zhǔn)方法?單個(gè)實(shí)驗(yàn)室方法確認(rèn)的承認(rèn)單個(gè)實(shí)驗(yàn)室方法確認(rèn)的承認(rèn) EU (Decision 2002/

4、657/EU) Codex Committees Methods of Analysis and Sampling Residues of Veterinary Drugs in Foods Pesticide Residues National Regulators APVMA AQIS FSANZ NRS States & Territories 貿(mào)易伙伴貿(mào)易伙伴T(mén)rading Partners 什么是確認(rèn)方法什么是確認(rèn)方法? 該方法被證明適用于該目的該方法被證明適用于該目的 使用該方法所測(cè)得結(jié)果可靠使用該方法所測(cè)得結(jié)果可靠; 結(jié)果合理可用于作決定結(jié)果合理可用于作決定什么是方法確認(rèn)

5、什么是方法確認(rèn)? 系統(tǒng)評(píng)價(jià)一個(gè)方法，提供客觀證據(jù)證明該方法能夠滿系統(tǒng)評(píng)價(jià)一個(gè)方法，提供客觀證據(jù)證明該方法能夠滿足特定檢測(cè)目標(biāo)的需要。足特定檢測(cè)目標(biāo)的需要。 證明該方法是符合證明該方法是符合NATA要求的。要求的。 方法確認(rèn)方法確認(rèn)16107893542VALIDATED METHOD61078935421步驟步驟1: 方法的具本要求方法的具本要求為特定明確用途的特殊需求為特定明確用途的特殊需求.需要對(duì)所發(fā)展的方法需要對(duì)所發(fā)展的方法的檢測(cè)對(duì)象有的具本要求。的檢測(cè)對(duì)象有的具本要求。什么是方法的需要什么是方法的需要? 你要檢測(cè)什么你要檢測(cè)什么? 在什么樣品基質(zhì)中在什么樣品基質(zhì)中? 你需要檢測(cè)到什么濃

6、度水平你需要檢測(cè)到什么濃度水平? 對(duì)結(jié)果你需要有多大可靠性對(duì)結(jié)果你需要有多大可靠性? 多少濃度范圍多少濃度范圍? 是否客戶還有其它特殊需要是否客戶還有其它特殊需要?例如：具本要求例如：具本要求: 動(dòng)物組織中抗生素殘留檢測(cè)動(dòng)物組織中抗生素殘留檢測(cè)自由自由化合物化合物 或或 結(jié)合化合物結(jié)合化合物?僅母體僅母體, 或母體加代謝物或母體加代謝物?特殊動(dòng)物組織特殊動(dòng)物組織, 如如. 豬的腎臟豬的腎臟調(diào)整檢測(cè)限調(diào)整檢測(cè)限, 所需的定量限（所需的定量限（ LOQ）?在定量限（在定量限（ LOQ）或）或 MRL值上的可接受的確證限值上的可接受的確證限?樣品里的預(yù)期濃度樣品里的預(yù)期濃度?所需的檢測(cè)周期所需的檢測(cè)

7、周期?多個(gè)的還是單個(gè)樣品多個(gè)的還是單個(gè)樣品?步驟步驟 1: 方法的具本要求方法的具本要求對(duì)這些具本要求的確認(rèn)將根本定義方法的范圍對(duì)這些具本要求的確認(rèn)將根本定義方法的范圍步驟步驟 1: 方法的具體要求方法的具體要求為了確認(rèn)方法的具本要求為了確認(rèn)方法的具本要求,還有哪些方法的工作特性還有哪些方法的工作特性需要發(fā)展呢需要發(fā)展呢?以下九個(gè)步驟以下九個(gè)步驟VALIDATED METHODDEVELOP SPECS6107893542步驟步驟 2: 方法選擇性方法選擇性在在(與樣品一起提取出的與樣品一起提取出的)干擾存在下檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性干擾存在下檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性目標(biāo)目標(biāo): 沒(méi)有重大干擾沒(méi)有重大干擾 方法

8、內(nèi)在的選擇性變化方法內(nèi)在的選擇性變化 通過(guò)分析含有可能干擾的樣品來(lái)檢查通過(guò)分析含有可能干擾的樣品來(lái)檢查例如：方法選擇性例如：方法選擇性: 動(dòng)物組織中抗生素的殘留檢測(cè)動(dòng)物組織中抗生素的殘留檢測(cè)進(jìn)行系列在日常檢測(cè)中可能碰到的樣品基質(zhì)試驗(yàn)進(jìn)行系列在日常檢測(cè)中可能碰到的樣品基質(zhì)試驗(yàn)用交叉反應(yīng)法檢查用交叉反應(yīng)法檢查(如免疫測(cè)定法如免疫測(cè)定法)VALIDATED METHODDEVELOP SPECS61078954 SELECTIVITY3步驟步驟 3: 線性范圍線性范圍對(duì)方法而言是用一個(gè)計(jì)算模型去定義儀器響應(yīng)與濃度對(duì)方法而言是用一個(gè)計(jì)算模型去定義儀器響應(yīng)與濃度之間的關(guān)系之間的關(guān)系通常線性模型由圖表表示

9、通常線性模型由圖表表示測(cè)定線性范圍要求測(cè)定線性范圍要求: 6點(diǎn)校準(zhǔn)標(biāo)樣，每點(diǎn)重復(fù)測(cè)定兩次點(diǎn)校準(zhǔn)標(biāo)樣，每點(diǎn)重復(fù)測(cè)定兩次 在可能濃度的在可能濃度的0-150% 或或 50-150%嚴(yán)格評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)嚴(yán)格評(píng)價(jià)數(shù)據(jù), 不要只依賴不要只依賴 r2 值值R2 = 0.984Response vs ConcentrationR2 = 0.98402468101214160102030405060CONCENTRATIONRESPONSE步驟步驟 3: 線性范圍線性范圍對(duì)方法而言是用一個(gè)計(jì)算模型去定義儀器響應(yīng)與濃度對(duì)方法而言是用一個(gè)計(jì)算模型去定義儀器響應(yīng)與濃度之間的關(guān)系之間的關(guān)系通常線性模型由圖表表示通常線性模型由

10、圖表表示測(cè)定線性范圍測(cè)定線性范圍: 6點(diǎn)校準(zhǔn)標(biāo)樣，每點(diǎn)重復(fù)測(cè)定兩次點(diǎn)校準(zhǔn)標(biāo)樣，每點(diǎn)重復(fù)測(cè)定兩次 在可能濃度的在可能濃度的0-150% 或或 50-150%嚴(yán)格評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)嚴(yán)格評(píng)價(jià)數(shù)據(jù), 不要只依賴不要只依賴 r2 值值還要考慮可能的基質(zhì)效應(yīng)還要考慮可能的基質(zhì)效應(yīng)Response vs Concentration02468100246810CONCENTRATIONRESPONSEwith matrixwithout matrixResponse vs Concentration02468100246810CONCENTRATIONRESPONSE(additive effect)without m

11、atrixwith matrix 例如：線性范圍例如：線性范圍: 動(dòng)物組織中抗生素殘留檢測(cè)動(dòng)物組織中抗生素殘留檢測(cè) 所有方法應(yīng)用的基本原則所有方法應(yīng)用的基本原則 檢查所有目標(biāo)化合物的線性檢查所有目標(biāo)化合物的線性 范圍覆蓋期望濃度的范圍覆蓋期望濃度的 0150% 清楚基質(zhì)效應(yīng)清楚基質(zhì)效應(yīng)VALIDATED METHODDEVELOP SPECS6107895 SELECTIVITY LINEARITY4步驟步驟 4: 靈敏度靈敏度響應(yīng)變化與濃度變化的比例響應(yīng)變化與濃度變化的比例例如：靈敏度例如：靈敏度: 抗生素在動(dòng)物組織中的殘留檢測(cè)抗生素在動(dòng)物組織中的殘留檢測(cè) 可能每天變化可能每天變化 每天例行

12、檢查保證滿意的靈敏度每天例行檢查保證滿意的靈敏度 操作時(shí)帶入部分操作時(shí)帶入部分QC(質(zhì)量控制質(zhì)量控制)樣品樣品VALIDATED METHODDEVELOP SPECS610789 SELECTIVITY LINEARITY SENSITIVITY5步驟步驟 5: 精確度與準(zhǔn)確度精確度與準(zhǔn)確度兩部分內(nèi)容兩部分內(nèi)容;精確度精確度; 隨機(jī)誤差隨機(jī)誤差準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度(真實(shí)度真實(shí)度); 系統(tǒng)誤差系統(tǒng)誤差 (與真值的偏離與真值的偏離)步驟步驟 5: 精確度與準(zhǔn)確度精確度與準(zhǔn)確度精確度精確度 重復(fù)測(cè)定間的預(yù)期符合水平重復(fù)測(cè)定間的預(yù)期符合水平精確度的不同測(cè)定方法精確度的不同測(cè)定方法; 可重復(fù)性可重復(fù)性 可重現(xiàn)

13、性可重現(xiàn)性 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的重現(xiàn)性 (通常使用的最好反映通常使用的最好反映)通過(guò)對(duì)獨(dú)立準(zhǔn)備的合適樣品組分重復(fù)分析來(lái)測(cè)定通過(guò)對(duì)獨(dú)立準(zhǔn)備的合適樣品組分重復(fù)分析來(lái)測(cè)定 有典型分析濃度的真實(shí)樣品有典型分析濃度的真實(shí)樣品 添加回收添加回收 樣品樣品 步驟步驟5:精確度與準(zhǔn)確度精確度與準(zhǔn)確度 準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度 檢測(cè)結(jié)果與真值的接近程度檢測(cè)結(jié)果與真值的接近程度 (或者與公認(rèn)的參考值的接近程度或者與公認(rèn)的參考值的接近程度)通過(guò)含有已知濃度的樣品的重復(fù)分析來(lái)測(cè)定通過(guò)含有已知濃度的樣品的重復(fù)分析來(lái)測(cè)定; 添加回收添加回收 樣品樣品或其它不常用方法或其它不常用方法;即通過(guò)與已知系統(tǒng)偏差的參考方法來(lái)比較即通

14、過(guò)與已知系統(tǒng)偏差的參考方法來(lái)比較 例如例如:準(zhǔn)確度與精確度準(zhǔn)確度與精確度: 動(dòng)物組織中抗生素殘留檢測(cè)動(dòng)物組織中抗生素殘留檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)的重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)的重現(xiàn)性, 更適合用含有已知?dú)埩舻臉悠穪?lái)進(jìn)行更適合用含有已知?dú)埩舻臉悠穪?lái)進(jìn)行 回收率通常是重要的指標(biāo)回收率通常是重要的指標(biāo) CRMs 或或 RMs 很難得到很難得到 需要依賴添加回收樣品需要依賴添加回收樣品 100% 的回收率并不能保證結(jié)果的真實(shí)性的回收率并不能保證結(jié)果的真實(shí)性 對(duì)樣品中含有已知?dú)埩粑锏奶砑踊厥蘸苤匾獙?duì)樣品中含有已知?dú)埩粑锏奶砑踊厥蘸苤匾?可能的話通過(guò)可能的話通過(guò)PT? 確證回收率確證回收率VALIDATED METHOD

15、DEVELOP SPECS10789ACCURACY SELECTIVITY LINEARITYTRUENESS PRECISION SENSITIVITY6步驟步驟 6: 檢測(cè)限與定量限（檢測(cè)限與定量限（LOD & LOQ）檢測(cè)限檢測(cè)限能可靠檢測(cè)到的最低濃度能可靠檢測(cè)到的最低濃度 通常用在一種樣品基質(zhì)中的倍信噪比表示通常用在一種樣品基質(zhì)中的倍信噪比表示定量限定量限能檢測(cè)到的有可接受不確定度的最低濃度能檢測(cè)到的有可接受不確定度的最低濃度 通常通常,定量限是檢測(cè)限的倍定量限是檢測(cè)限的倍 沒(méi)必要對(duì)所有方法都要有確定的檢測(cè)限與定量限沒(méi)必要對(duì)所有方法都要有確定的檢測(cè)限與定量限步驟步驟 6: 檢

16、測(cè)限與定量限檢測(cè)限與定量限(LOD & LOQ)檢測(cè)限檢測(cè)限 標(biāo)準(zhǔn)溶液的信噪比標(biāo)準(zhǔn)溶液的信噪比(S/N)不是一個(gè)適當(dāng)?shù)挠?jì)算檢測(cè)限的方法不是一個(gè)適當(dāng)?shù)挠?jì)算檢測(cè)限的方法通過(guò)重復(fù)分析經(jīng)過(guò)所有測(cè)試步驟的樣品所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)而得通過(guò)重復(fù)分析經(jīng)過(guò)所有測(cè)試步驟的樣品所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)而得例：檢測(cè)限與定量限例：檢測(cè)限與定量限: 動(dòng)物組織中抗生素殘留檢測(cè)動(dòng)物組織中抗生素殘留檢測(cè) 非常重要典型的殘留檢測(cè)方法非常重要典型的殘留檢測(cè)方法 對(duì)確切的目標(biāo)有詳細(xì)的要求對(duì)確切的目標(biāo)有詳細(xì)的要求 對(duì)每一個(gè)的檢測(cè)對(duì)象有不同的檢測(cè)限與定量限對(duì)每一個(gè)的檢測(cè)對(duì)象有不同的檢測(cè)限與定量限 報(bào)告的結(jié)果表述為報(bào)告的結(jié)果表述為“未檢出未檢出”有重

17、要意義有重要意義NATA 要求對(duì)痕量有機(jī)物殘留進(jìn)行確證要求對(duì)痕量有機(jī)物殘留進(jìn)行確證 檢測(cè)限檢測(cè)限 = 能被有效檢測(cè)到與確證的最低濃度能被有效檢測(cè)到與確證的最低濃度 VALIDATED METHODDEVELOP SPECSLOD&LOQ1089ACCURACY SELECTIVITY LINEARITY SENSITIVITY7TRUENESS PRECISION步驟步驟 7: 線性范圍線性范圍方法的工作范圍，該方法下對(duì)結(jié)果有一個(gè)可接受的不確定方法的工作范圍，該方法下對(duì)結(jié)果有一個(gè)可接受的不確定度水平度水平 定量限定量限 線性校正范圍的高限（即最下限）線性校正范圍的高限（即最下限） 定量

18、限定量限 用在方法確認(rèn)中的最低濃度用在方法確認(rèn)中的最低濃度例：線性范圍例：線性范圍: 動(dòng)物組織中抗生素殘留檢測(cè)動(dòng)物組織中抗生素殘留檢測(cè) 定量限定量限 能可靠定量的最低濃度能可靠定量的最低濃度VALIDATED METHODDEVELOP SPECS10RANGE9LOD&LOQACCURACY SELECTIVITY LINEARITY SENSITIVITY8TRUENESS PRECISION步驟步驟 8: 方法適應(yīng)性方法適應(yīng)性方法中對(duì)微小變化的適應(yīng)性方法中對(duì)微小變化的適應(yīng)性 象象 pH, 溫度溫度, 流速流速,試劑濃度試劑濃度, 提取時(shí)間等的微小變化的影響提取時(shí)間等的微小變化的影

19、響. 方法的發(fā)展與實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重現(xiàn)性的研究將提醒化學(xué)家可能的潛方法的發(fā)展與實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重現(xiàn)性的研究將提醒化學(xué)家可能的潛在影響在影響 可能的影響可以通過(guò)一次或同時(shí)進(jìn)行的仔細(xì)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)來(lái)評(píng)可能的影響可以通過(guò)一次或同時(shí)進(jìn)行的仔細(xì)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)來(lái)評(píng)估估 介紹限制影響的控制方法介紹限制影響的控制方法例：方法適應(yīng)性例：方法適應(yīng)性: 動(dòng)物組織中抗生素殘留檢測(cè)動(dòng)物組織中抗生素殘留檢測(cè) 在方法發(fā)展中經(jīng)常在方法發(fā)展中經(jīng)常使用使用在方法發(fā)展和或確認(rèn)中研究任何確定的影響在方法發(fā)展和或確認(rèn)中研究任何確定的影響 必要的話必要的話, 介紹在可接受的限度內(nèi)減少影響的控制方法介紹在可接受的限度內(nèi)減少影響的控制方法 方法偏差方法偏差 方法修

20、正方法修正 內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)VALIDATED METHODDEVELOP SPECS10RANGELOD&LOQACCURACY SELECTIVITY LINEARITY SENSITIVITY RUGGEDNESS9TRUENESS PRECISION步驟步驟 9: 計(jì)算不確定度計(jì)算不確定度與計(jì)算結(jié)果關(guān)聯(lián)的一個(gè)參數(shù)，用于表示所得結(jié)果的離差情與計(jì)算結(jié)果關(guān)聯(lián)的一個(gè)參數(shù)，用于表示所得結(jié)果的離差情況況ISO 17025 和和 NATA要求要求 方法的不確定度知識(shí)對(duì)結(jié)果的比較以及判定結(jié)果的合法性或方法的不確定度知識(shí)對(duì)結(jié)果的比較以及判定結(jié)果的合法性或調(diào)整檢測(cè)限都是必要的調(diào)整檢測(cè)限都是必要的 好的確認(rèn)

21、結(jié)果會(huì)有一個(gè)合理的不確定度好的確認(rèn)結(jié)果會(huì)有一個(gè)合理的不確定度 不確定度的估算對(duì)于檢測(cè)對(duì)象及其結(jié)果的使用應(yīng)該是合理的不確定度的估算對(duì)于檢測(cè)對(duì)象及其結(jié)果的使用應(yīng)該是合理的例例:方法不確定度估算方法不確定度估算: 抗生素在動(dòng)物組織中的殘留抗生素在動(dòng)物組織中的殘留 估算定量限及其相關(guān)控制濃度結(jié)果的不確定度估算定量限及其相關(guān)控制濃度結(jié)果的不確定度 對(duì)方法所檢測(cè)的每一個(gè)化合物者估算其結(jié)果的不確度對(duì)方法所檢測(cè)的每一個(gè)化合物者估算其結(jié)果的不確度VALIDATED METHODDEVELOP SPECS MURANGELOD&LOQACCURACY SELECTIVITY LINEARITY SENSI

22、TIVITY RUGGEDNESS10TRUENESS PRECISION步驟步驟 10: 溯源溯源檢測(cè)結(jié)果必須要溯源到一定的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果必須要溯源到一定的標(biāo)準(zhǔn),通常是通過(guò)完整的關(guān)系通常是通過(guò)完整的關(guān)系鏈溯源到國(guó)家或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)鏈溯源到國(guó)家或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn),所有的步驟都有相應(yīng)的不確定度所有的步驟都有相應(yīng)的不確定度 沒(méi)有計(jì)算不確定度無(wú)法溯源沒(méi)有計(jì)算不確定度無(wú)法溯源 方法確認(rèn)對(duì)溯源而已是首要步驟方法確認(rèn)對(duì)溯源而已是首要步驟以下是量值溯源圖以下是量值溯源圖Traceable Chemical Test ResultsPhysical MeasurementsChemical Measurements例例:溯源溯源: 動(dòng)物組織中抗生素的殘留動(dòng)物組織中抗生素的殘留 保證分析所用標(biāo)準(zhǔn)品都被檢定過(guò)保證分析所用標(biāo)準(zhǔn)