第一節(jié)基因工程的概述

1、第一章 基因工程 第一節(jié) 基因工程的概述【學(xué)習(xí)目標(biāo)】1、簡述基因工程的概念含義，簡述基因工程的誕生歷程，認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論突破和技術(shù)創(chuàng)新2、簡述基因工程的原理，說出DNA重組技術(shù)的基本工具及其作用、特點(diǎn)，簡述基因工程基本操作程序，以及各步驟的一般方法、原理，模擬重組DNA分子的操作過程【課前預(yù)習(xí)】1、 基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，在通過人工和等方法，對生物的基因進(jìn)行 和 ， 然后導(dǎo)入 并使重組基因在中表達(dá)，產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物的技術(shù)。因而又叫DNA重組技術(shù)。基因工程是在水平上操作、改變生物遺傳性狀的技術(shù)，包括基因的 、 以及在受體細(xì)胞內(nèi)的 和過程。2、 為基因

2、工程的創(chuàng)立作出了重要的理論鋪墊，而 的發(fā)現(xiàn)，則直接促進(jìn)了基因工程的誕生。 1973年，美國科學(xué)家 將不同來源的兩種DNA分子體外重組，并首次實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá)。 3、“分子手術(shù)刀”：。其作用的特點(diǎn)是：其產(chǎn)生的DNA末端有兩種形式：和?！胺肿俞樉€”將雙鏈DNA片段縫合起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的。4、 “運(yùn)載工具”。通常利用質(zhì)粒作為載體。作為載體必須具備以下條件：載體DNA必需有一個或多個的切割位點(diǎn)；載體DNA必需能在受體細(xì)胞中；載體DNA必需帶有特殊的基因。5、 基因工程的基本操作步驟包括：、6、 PCR是一項在生物復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。目的基因受熱形成，與結(jié)合，

3、在的作用下延伸形成DNA?！竟餐骄俊恐R點(diǎn)一：關(guān)于基因工程基因工程的別名DNA重組技術(shù)或轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作環(huán)境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切或合成拼接導(dǎo)入表達(dá)結(jié)果人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)物變異類型基因重組意義打破生殖隔離（克服不同生物遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙），在基因水平上定向改變生物的遺傳信息，并通過工程化的手段為人類提供有用的產(chǎn)品和服務(wù)【思考題1】（10全國2）下列敘述符合基因工程概念的是AB淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合，雜交瘤細(xì)胞中含有B淋巴細(xì)胞中的抗體基因B將人的干擾素基因重組到質(zhì)粒后導(dǎo)入大腸桿菌，獲得能產(chǎn)生人干擾素的菌株C用紫外線照射青霉菌，使其DNA發(fā)生改變，通過

4、篩選獲得青霉素高產(chǎn)菌株D自然界中天然存在的噬菌體自行感染細(xì)菌后其DNA整合到細(xì)菌DNA上（一）DNA重組技術(shù)的基本工具1、 “分子手術(shù)刀”限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶能將外來的DNA切斷，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息。它在切割DNA時，特異性識別核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上進(jìn)行切割，這種能被特意性識別的切割部位都具有回文序列。這種酶主要在原核生物中存在，有何意義？這給我們在基因工程中有什么啟發(fā)？【思考題2】下列關(guān)于限制酶的說法正確的是A、限制酶廣泛存在于各種生物中，但微生物中很少B、一種限制酶只能識別一種特

5、定的核苷酸序列C、不同的限制酶切割DNA后都會形成黏性末端D、限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氫鍵【思考題3】（10浙江卷）在用基因工程技術(shù)構(gòu)建抗除草劑的轉(zhuǎn)基因煙草過程中，下列操作錯誤的是A.用限制性核酸內(nèi)切酶切割煙草茶葉病毒的核酸B.用DNA連接酶連接經(jīng)切割的抗除草劑基因和載體C.將重組DNA分子導(dǎo)入原生質(zhì)體D. 用含除草劑的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞【思考題4】（07廣東）現(xiàn)有一長度為1000堿基對（by）的DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶Eco R1酶切后得到的DNA分子仍是1000 by，用Kpn1單獨(dú)酶切得到400 by和600 by兩種長度的DNA分子，用EcoRI,Kpnl同時酶切

6、后得到200 by和600 by兩種長度的DNA分子。該DNA分子的酶切圖譜正確的是D2、“分子針線”DNA連接酶DNA連接酶是將雙鏈DNA片段”縫合”起來,恢復(fù)被限制性核酸內(nèi)切酶切開了兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵. DNA連接酶與DNA聚合酶的相同點(diǎn)是：兩者都是形成磷酸二酯鍵；成分都屬于蛋白質(zhì)。不同點(diǎn)：DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵將兩個缺口同時連接起來，不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵【思考題5】下圖為DNA分子的切割和連接過程。（1）EcoRI是一種酶，其識別序列是，切割位點(diǎn)是與之間的鍵。切割結(jié)

7、果產(chǎn)生的DNA片段末端形式為。（2）不同來源DNA片段結(jié)合，在這里需要的酶應(yīng)是連接酶，此酶的作用是在與之間形成鍵，而起“縫合”作用的。3、“運(yùn)載工具”目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體目的基因的載體是基因的運(yùn)輸工具，在基因操作過程中，使用目的基因的載體有兩個目的：一是用它作為運(yùn)載工具，將目的基因送到宿主細(xì)胞中去；二是利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。因此作為目的基因的載體必須具備三個條件：一是能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制，二是具有多個限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)，以便與外源基因連接，三是具有某些標(biāo)記基因，以便進(jìn)行篩選。實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因

8、工程操作?！舅伎碱}6】作為基因的運(yùn)輸工具載體，必須具備的條件及理由是A、能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復(fù)制，以便提供大量的目的基因B、具有多個限制酶切點(diǎn)，以便于目的基因的表達(dá)C具有某些標(biāo)記基因，以便為目的基因的表達(dá)提供條件D、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存，以便于進(jìn)行篩選（二）基因工程的基本操作程序1、獲得目的基因DNA復(fù)制和PCR技術(shù)DNA復(fù)制主要在細(xì)胞內(nèi)完成，以DNA的兩條鏈為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成兩個完全相同的DNA分子的過程。復(fù)制的條件是：以DNA雙鏈為模板，以四中脫氧核苷酸為原料，需要線立體供應(yīng)能量，還需要多種酶，如解旋酶、DNA聚合酶等。PCR技術(shù)是一項在生物體外復(fù)制

9、特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。它遵循的原理與DNA復(fù)制原理相同，條件是有一段以知目的基因的核苷酸序列和根據(jù)核苷酸序列合成的引物，原料是四種脫氧核苷酸，也需要多種酶，如（耐高溫的）DNA聚合酶，此酶和普通DNA聚合酶相比，要耐高溫。結(jié)果使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增PCR擴(kuò)增是獲取目的基因的一種非常有用的方法，也是進(jìn)行分子鑒定和檢測的一種很靈敏的方法。【思考題7】下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是 從基因文庫中獲取目的基因 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 反轉(zhuǎn)錄法 通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成A B C D【思考題8】下列有關(guān)PCR過程的敘述中，不正確的是A變性過程中破壞的是D

10、NA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，也可以利用解旋酶來實(shí)現(xiàn)B復(fù)制過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對原則完成C延伸過程中需要DNA聚合酶、能量、四種核糖核苷酸DPCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需要的酶最適溫度較高2、制備重組DNA分子（基因表達(dá)載體的構(gòu)建）基因工程的核心目的基因和質(zhì)粒相結(jié)合形成重組質(zhì)粒的過程是：（1）：用一種的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個有黏性末端的切口；（2）：用同一種限制性內(nèi)切酶切斷目的基因，產(chǎn)生相同的黏性末端；（3）：將切下的目的基因片段插入到質(zhì)粒的切口處，在加入適量的DNA連接酶，使質(zhì)粒與目的基因結(jié)合成重組質(zhì)粒。不同的受體細(xì)胞及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同

11、，基因表達(dá)載體的構(gòu)建上也會有所差別（如啟動子不同等）。重組DNA（基因表達(dá)載體）組成：目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)【思考題9】制備重組DNA分子的目的是什么？使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下代，同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用?！舅伎碱}10】（09上海理綜卷）科學(xué)家運(yùn)用基因工程技術(shù)將人胰島素基因與大腸桿菌的質(zhì)粒DNA分子重組，并且在大腸桿菌體內(nèi)獲得成功表達(dá)。圖示a處為胰島素基因與大腸桿菌質(zhì)粒DNA結(jié)合的位置，它們彼此能結(jié)合的依據(jù)是A基因自由組合定律B半保留復(fù)制原則C基因分離定律D堿基互補(bǔ)配對原則【思考題11】科學(xué)家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力

12、，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)人棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。由以上過程推知，作為目的基因的運(yùn)載體應(yīng)具備的結(jié)構(gòu)是 A目的基因、啟動子 B目的基因、終止子 C目的基因、啟動子、終止子 D目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因【思考題12】（09浙江卷）下列關(guān)于基因工程的敘述，錯誤的是A目的基因和受體細(xì)胞均可來自動、植物或微生物B限制性核酸

13、內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶C人胰島素原基因在大腸桿菌中表達(dá)的胰島素原無生物活性D載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細(xì)胞和促進(jìn)目的基因的表達(dá)3、轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞（將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞） 轉(zhuǎn)化的方法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)、基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)、花粉管通道技術(shù)、顯微注射技術(shù)【思考題13】采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是( )將毒素蛋白注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，導(dǎo)人細(xì)菌，用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng) 將編碼毒素蛋白的DNA序列，與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵 A、

14、 B、 C、 D、4、篩選出獲得目的基因的受體細(xì)胞、培養(yǎng)受體細(xì)胞并誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)（目的基因的檢測與鑒定）檢測質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，需利用質(zhì)粒上某些標(biāo)記基因（抗性基因）的特性，即對已經(jīng)導(dǎo)入質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒、本身無相應(yīng)特性的受體細(xì)胞進(jìn)行檢測，根據(jù)受體細(xì)胞是否具有相應(yīng)的特性來確定重組質(zhì)粒是否進(jìn)入受體細(xì)胞。例如質(zhì)粒上有抗四環(huán)素和抗氨芐青霉素這兩個特性基因，用含四環(huán)素或氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基，受體細(xì)胞凡能生長則表明質(zhì)粒導(dǎo)入成功?；虺晒Ρ磉_(dá)的標(biāo)志是受體細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄、翻譯過程合成出目的基因的相應(yīng)的蛋白質(zhì)，可通過抗原-抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測。也可通過個體生物學(xué)水平的鑒定：如抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定

15、等。【思考題14】用某人的胰島素基因制成的DNA探針，檢測下列物質(zhì)，能形成雜交分子的是該人胰島A細(xì)胞中的DNA 該人胰島B細(xì)胞的mRNA該人胰島A細(xì)胞的mRNA 該人肝細(xì)胞的DNAA B C D【課堂鞏固】1生命活動中起催化作用的酶都具有一定的專一性，下列四種酶作用的部位分別是限制性內(nèi)切酶 解旋酶 腸肽酶 ATP水解酶A氫鍵、磷酸二酯鍵、氨基、高能磷酸鍵B磷酸二酯鍵、堿基、肽鍵、高能磷酸鍵C磷酸二酯鍵、氫鍵、氨基、磷酸鍵D磷酸二酯鍵、氫鍵、肽鍵、高能磷酸鍵2下圖是將人的生長激素基因?qū)爰?xì)菌B細(xì)胞內(nèi)制造“工程菌”的示意圖。已知細(xì)菌B細(xì)胞內(nèi)不含質(zhì)粒A，也不含質(zhì)粒A上的基因。判斷下列說法正確的是 A

16、將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌B常用的方法是顯微注射法或基因槍法 B將完成導(dǎo)入過程后的細(xì)菌涂布在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，能生長的只是導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的細(xì)菌C將完成導(dǎo)入過程后的細(xì)菌涂布在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，能生長的就是導(dǎo)入了質(zhì)粒A的細(xì)菌D目的基因成功表達(dá)的標(biāo)志是受體細(xì)胞能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長3限制酶是一種核酸內(nèi)切酶，可識別并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下圖為四種限制酶BamH、EcoR、Hind和Bgl的識別序列和切割位點(diǎn)BamH EcoR Hind Bgl GGATCC GAATTC AAGCTT AGATCT CCTAGG CTTAAG TTCGAA TCTAGA切割出來的DNA黏性末

17、端可以互補(bǔ)配對的是ABamH和EcoRBBamH和 HindCBamH和BglDEcoR和 Hind4關(guān)于限制性內(nèi)切酶的說法中，正確的是（多選）A主要從真核生物中分離純化出來B能在特定的位點(diǎn)上切割DNA分子 C對目的基因和運(yùn)載體必需用兩種特定的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，產(chǎn)生特定的黏性末端D一種限制性內(nèi)切酶只能識別一種特定的核苷酸序列5用于判斷目的基因是否轉(zhuǎn)移成功的方法中，屬于分子檢測的是（多選）A通過害蟲吃棉葉看其是否死亡B目的基因片段與DNA探針能否形成雜交帶C目的基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA與DNA探針能否形成雜交帶D目的基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)能否與抗體形成雜交帶6.（09上海卷）人體細(xì)胞內(nèi)含有抑制癌癥

18、發(fā)生的P53基因，生物技術(shù)可對此類基因的變化進(jìn)行檢測。（1）目的基因的獲取方法通常包括_和_。（2）上圖表示從正常人和患者體內(nèi)獲取的P53基因的部分區(qū)域。與正常人相比，患者在該區(qū)域的堿基會發(fā)生改變，在上圖中用方框圈出發(fā)生改編的堿基對，這種變異被稱為_。（3）已知限制酶E識別序列為CCGG,若用限制酶E分別完全切割正常人和患者的P53基因部分區(qū)域（見上圖），那么正常人的會被切成_個片段，而患者的則被切割成長度為_對堿基和_對堿基的兩種片段。（4）如果某人的P53基因部分區(qū)域經(jīng)限制酶E完全切割后，共出現(xiàn)170、220、290和460堿基對的四種片段，那么該人的基因型是_（以P+表示正?；颍琍n表示異?；颍?。7、（10江蘇卷）下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點(diǎn)，圈l、圈2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。請回答下列問題：（1） 一個圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)