生物制藥畢業(yè)論文

1、柏樹(shù)內(nèi)生真菌的分離與抑菌研究學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院專業(yè):制藥工程-生物制藥目 錄摘要iAbstractii1.前言11.1 植物內(nèi)生真菌11.1.1內(nèi)生菌概念1 植物內(nèi)生真菌11.2 植物內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀及應(yīng)用2抗腫瘤活性物質(zhì)2抗菌活性物質(zhì)2產(chǎn)酶的內(nèi)生菌3抗蟲(chóng)抑菌類物質(zhì)3植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)3產(chǎn)香氣的內(nèi)生真菌4生物防治4其他作用41.3 白蟻及白蟻的危害4白蟻4白蟻的危害51.4 白蟻的防治7物理防治法7化學(xué)防治法7生物防治法81.5 本試驗(yàn)研究的目的及意義82.材料與方法102.1 材料及設(shè)備102.1.1 分離內(nèi)生菌所用樹(shù)木及指示菌102.2.2培養(yǎng)基102.2.3 主要儀器設(shè)備102.2 試驗(yàn)方

2、法11 內(nèi)生真菌的分離11 內(nèi)生真菌的純化11 搖瓶培養(yǎng)12 牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)123.結(jié)果與分析143.1 柏樹(shù)木內(nèi)生真菌的分離143.2 活性篩選結(jié)果144.討論185.結(jié)論19參考文獻(xiàn)20附錄22致謝23摘 要植物內(nèi)生真菌作為生活在植物組織內(nèi)部的一大類微生物，在其生活史的一定階段或全過(guò)程中對(duì)宿主不表現(xiàn)出明顯病癥。在長(zhǎng)期共同進(jìn)化過(guò)程中，植物內(nèi)生菌與宿主植物之間形成了一種共生關(guān)系。香柏和羅森繪具有天然的抗白蟻特性，按照基因可互相傳遞的原則推測(cè)，香柏的內(nèi)生菌可以產(chǎn)生對(duì)白蟻有抑制作用的活性物質(zhì)。因此本實(shí)驗(yàn)旨在從具有天然抗白蟻樹(shù)木的樹(shù)枝、樹(shù)皮中分離出能抗白蟻的內(nèi)生真菌。利用白蟻體內(nèi)共生菌作指示菌，采

3、用牛津杯法做抑菌試驗(yàn)，得到抑菌功能效果好的菌株HDF-I-217 和HDF-I-232。下一步將對(duì)該兩株菌進(jìn)行鑒定，提取其代謝產(chǎn)物用于防治白蟻，這將具有極大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。關(guān)鍵詞內(nèi)生真菌；白蟻；分離AbstractAs a big group of microbe inhabiting in the tissues of living plants, the endophytic fungi have nosignifieantly negative effects on the host plants during their whole life history or some phase

4、s. During the long process of the common evolution, a symbiosis system formed between endophytes and host.Port-orford-cedar and eastern red cedar have the natural character of anti-termite. According to the principle of the genes mutually transmitting between the plant and the endophytes, it is supp

5、osed that the endophyte from Port-orford-cedar can produce active compound which has inhibition for termite.So the research separates the endophytic fungifrom the branch and the pill of the natural anti-termite trees.We obtained the dominance endophytes named HDF-I-217 and HDF-I-232 by the cylinder

6、plate method in the microbiostatic experiment, they can inhibit the microbes which live in the termite gut. The next step we will identify the two fungi and extract metabolites for preventing and controlling termite, which will have a greatdevelopment of value.Key wordsendophytic fungi; termite; iso

7、lation1.前言1.1植物內(nèi)生真菌 內(nèi)生菌概念對(duì)內(nèi)生菌的定義認(rèn)識(shí)是不斷發(fā)展的。首先由De Bary提出，內(nèi)生菌是指生活在植物組織內(nèi)的微生物，以區(qū)分那些生活在植物表面的表生菌(Epiphyte)；后來(lái)Carroll將內(nèi)生菌定義為生活在地上部分、活的植物組織內(nèi)并不引起明顯病害癥狀的真菌，突出強(qiáng)調(diào)內(nèi)生菌與植物的互惠共生關(guān)系，因此，這個(gè)內(nèi)生菌概念不包含植物致病菌和菌根菌1。目前，內(nèi)生菌概念是由Stone等提出的，是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌，被感染的宿主植物(至少暫時(shí))不表現(xiàn)出外在病癥，可通過(guò)組織學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物

8、組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物DNA的方法來(lái)注明其內(nèi)生2。也就是說(shuō)我們可以把植物內(nèi)生菌理解為生活于植物組織內(nèi)的正常菌群，不僅包括互惠共利的內(nèi)共生微生物，也包括潛伏在宿主植物體內(nèi)的病原菌3。植物內(nèi)生真菌植物內(nèi)生菌主要有細(xì)菌、真菌和放線菌。內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是指那些在其生活史中的某一段時(shí)期生活在植物組織內(nèi)，對(duì)植物組織沒(méi)有引起明顯病害癥狀的真菌。近年來(lái)的研究表明，內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物。植物與內(nèi)生真菌呈互利共生的關(guān)系：一方面，植物為內(nèi)生真菌提供光合產(chǎn)物和礦物質(zhì)；另一方面，內(nèi)生真菌產(chǎn)生的代謝物，或能刺激植物的生長(zhǎng)發(fā)育，或能提高宿主植物對(duì)生物脅迫或非生物脅迫的抵抗能

9、力。這些代謝物中的一部分，正是應(yīng)用前景廣闊的新型生物活性物質(zhì)，有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值4。1.2植物內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀及應(yīng)用內(nèi)生真菌廣泛存在于健康植物組織內(nèi)部，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。內(nèi)生真菌產(chǎn)生的各種活性物質(zhì)，在生物制藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、工業(yè)發(fā)酵等方面都表現(xiàn)出美好的應(yīng)用前景，受到世界各國(guó)專家的廣泛關(guān)注。利用內(nèi)生真菌發(fā)酵實(shí)現(xiàn)生物活性物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)，可以提高產(chǎn)量、降低產(chǎn)品成本，滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的需求；同時(shí)有利于珍稀、瀕危藥用植物資源的保護(hù)，對(duì)減少野生藥用植物多樣性的破壞具有重要意義。藥用植物具有豐富的物種多樣性，是人類生存與發(fā)展的重要自然資源。各種藥用植物中蘊(yùn)藏著非常豐富的內(nèi)生真菌。通過(guò)與藥用植物

10、的“協(xié)同進(jìn)化”，某些內(nèi)生真菌具有了產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)的能力?？鼓[瘤活性物質(zhì)植物中極低的含量和植物資源的有限是人類規(guī)模利用這些化合物所面臨的主要困難。這造就了從紅豆杉等植物中去尋找能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌。從紅豆杉的內(nèi)生真菌中不僅分離出了紫杉醇，現(xiàn)已從紅豆杉及其近緣植物分離到了許多種產(chǎn)紫杉烷類化合物的內(nèi)生菌。落羽松(Taxodium distchum)、榧樹(shù)(Torreya grandifolia)、銀杏(Ginkgo biloba)、禿柏(Toxodium distichum)以及一種松樹(shù)(Wollemia nobilis)中都分離到了能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生菌，這為紫杉醇的來(lái)源問(wèn)

11、題提供了很好的解決辦法5。以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)株作為模型，對(duì)喜樹(shù)內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行體外抗腫瘤活性試驗(yàn)，結(jié)果表明從喜樹(shù)的樹(shù)皮和樹(shù)枝中均分離了能產(chǎn)生抑制CHO細(xì)胞增殖活性的內(nèi)生真菌6。郭智勇等7從三種紅樹(shù)林內(nèi)生真菌Paecilomyces sp.(treel-7)，4557，ZZF65中分到九個(gè)環(huán)肽類的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中得到的環(huán)Pro-Leu具有強(qiáng)的抗癌活性及特殊的抗菌活性而被稱為滅癌素?？咕钚晕镔|(zhì)多種藥用植物本身具有抗菌消炎作用，因此其內(nèi)生真菌也是篩選抗病原菌菌株的理想途徑，已有多種藥用植物內(nèi)生真菌被研究過(guò)抑菌活性。從黃花夾竹桃分離到的內(nèi)生真菌中有17株具有抑菌活性，其中一株

12、木霉(Trichoderm sp.)抑菌活性最強(qiáng)，抗菌譜最廣1。Wagenaar等8從薄荷的一株內(nèi)生真菌Phomopsis longicolla的培養(yǎng)物中，分離提取出一種新的抗生素dicerandrols，它具有很強(qiáng)的殺菌作用。目前人們已知的抗生素遠(yuǎn)不能滿足需求，植物內(nèi)生真菌是一個(gè)未開(kāi)發(fā)的新領(lǐng)域，它們所產(chǎn)生的抗生素活性成分往往是新穎的。因此，開(kāi)發(fā)植物內(nèi)真生菌為尋找新的抗生素提供了具有廣闊的前景。產(chǎn)酶的內(nèi)生菌近年來(lái)，關(guān)于內(nèi)生菌產(chǎn)酶的報(bào)道越來(lái)越多，利用內(nèi)生菌產(chǎn)生的酶體系經(jīng)過(guò)篩選可用于有機(jī)合成、新藥開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域，是豐富天然產(chǎn)物的又一新途徑。內(nèi)生真菌產(chǎn)生細(xì)胞壁分解酶，用以克服宿主防御異物的天然屏障，還能

13、產(chǎn)生果膠酶、纖維素酶、醋酶等胞外酶。有些酶具有較高的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。2001年Stamford等人發(fā)現(xiàn)從薯蕷屬蠶豆中分離出來(lái)的內(nèi)生放射形擬諾卡菌可以產(chǎn)生耐熱性-淀粉酶；次年，又發(fā)現(xiàn)玉米葉中的內(nèi)生真菌鏈孢子囊菌在pH8.0的淀粉-Czapek培養(yǎng)基上可以高效產(chǎn)生耐熱葡萄糖淀粉酶9。抗蟲(chóng)抑菌類物質(zhì)內(nèi)生真菌可增強(qiáng)宿主對(duì)病蟲(chóng)害的抵抗能力，這是因?yàn)橛械膬?nèi)生真菌在宿主內(nèi)和純培養(yǎng)中產(chǎn)生有毒物質(zhì)，如有機(jī)胺類，麥角生物堿等。這些內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物可對(duì)植物致病菌和有害昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性。國(guó)內(nèi)外關(guān)于內(nèi)生真菌在農(nóng)藥領(lǐng)域的研究與開(kāi)發(fā)尚處于起步階段，報(bào)道極少，因此值得深入研究與開(kāi)發(fā)。從藥用植物海金沙中篩選抗小麥赤霉菌、番茄早疫霉

14、菌、番茄灰霉菌等植物病原真菌的內(nèi)生真菌，并進(jìn)行活性物質(zhì)檢測(cè)。結(jié)果表明80以上的內(nèi)生真菌對(duì)3種農(nóng)作物病原真菌具有較強(qiáng)的抗菌活性10。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)內(nèi)生真菌長(zhǎng)期和宿主植物生活在一起，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有很重要的作用。內(nèi)生真菌能產(chǎn)生促進(jìn)植物生長(zhǎng)的物質(zhì)如植物生長(zhǎng)素、赤霉素以及細(xì)胞激動(dòng)素等，直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)。內(nèi)生真菌也能通過(guò)增強(qiáng)植物吸收N、P等營(yíng)養(yǎng)元素，或與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間或直接產(chǎn)生拮抗物質(zhì)而抑制病原菌，從而間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，金線蓮等4種蘭科藥用植物的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、玉米素(Z)、玉米素核苷(ZR)等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑12。產(chǎn)香氣的內(nèi)生

15、真菌從香料植物香茅草上分離到一株產(chǎn)香內(nèi)生菌XCY-1，液體發(fā)酵后分析鑒定其發(fā)酵液的揮發(fā)性成分，共鑒定出74個(gè)化合物，其中有乙縮醛二乙醇、檸檬烯、月桂烯、月桂醛等多種香料物質(zhì)。產(chǎn)香內(nèi)生菌給新的香料資源開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)13。生物防治植物內(nèi)生真菌的專一性很強(qiáng)，除了對(duì)其宿主植物及取食或感染宿主植物的生物起作用外，對(duì)其他生物沒(méi)有直接影響，而且內(nèi)生真菌還可通過(guò)人工接種被導(dǎo)入不同的植物并可通過(guò)宿主的種子進(jìn)行遺傳；內(nèi)生真菌分布于植物組織內(nèi)，有足夠的碳源、氮源，而且受到植物組織的良好保護(hù)，具有更穩(wěn)定的生存環(huán)境，更易于發(fā)揮作用，因而具有作為生物農(nóng)藥的優(yōu)良特性。蘭琪等14從苦皮藤(Celastrus angula

16、tus)植株中分離到39株內(nèi)生真菌，其中3株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的丙酮提取物對(duì)番茄灰霉病等6種病菌的菌絲生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用。在盆栽試驗(yàn)中，內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的丙酮提取物對(duì)供試病菌的治療和保護(hù)作用均在50以上，有的內(nèi)生真菌在一定條件下可成為拮抗菌。由此可見(jiàn)，內(nèi)生真菌可能成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥和增產(chǎn)菌。但內(nèi)生真菌提高植物抗病性的機(jī)制，以及內(nèi)生真菌如何影響寄主防御相關(guān)的酶系活性還不清楚。其他作用藥用植物內(nèi)生真菌具有一些其他有益的生理作用，如除草活性、抗結(jié)核、抗瘧、免疫抑制作用、抗氧化，降解纖維素、保鮮等12。1.3白蟻及白蟻的危害白蟻白蟻屬于昆蟲(chóng)綱(Insects)等翅目(Isoptera)，

17、是地球上最古老的社會(huì)性昆蟲(chóng)，距今大約有2.5億年的歷史。全世界有大約2600種白蟻，我國(guó)有500余種。白蟻在分類上的地位和名稱經(jīng)歷了100多年的不穩(wěn)定。從解剖學(xué)和社會(huì)組織性特征可以把白蟻分為兩大類群，即低等白蟻，包括澳白蟻科(Mastotermitidae)、木白蟻(Kalotermitidae)、草白蟻科(Hodotezmitzdae)、原白蟻科(Termopsidae)、鼻白蟻科(Rhinotermitidae)、齒白蟻科(Serritermitidae)和高等白蟻即白蟻科(Termitidae)共七個(gè)科。高等白蟻較低等白蟻有更細(xì)致的內(nèi)外部解剖學(xué)特征和更強(qiáng)的社會(huì)組織性。低等白蟻吃木質(zhì)性食物

18、(吃草的草白蟻除外)，腸內(nèi)有原生動(dòng)物和細(xì)菌共生；白蟻科占白蟻總數(shù)的75，吃樹(shù)、草、凋落物和含礦物質(zhì)的土壤，有豐富的腸細(xì)菌共生，但原生動(dòng)物很少見(jiàn)15。白蟻?zhàn)鳛樯鐣?huì)性昆蟲(chóng)的類群之一，低等白蟻與腸道微生物共生是其特征，很多研究者經(jīng)常選擇其作為研究材料。白蟻腸道呈螺旋狀，其中存在著原生動(dòng)物，發(fā)酵性螺旋體，同型產(chǎn)乙酸細(xì)菌，甲烷細(xì)菌和硫酸鹽還原菌，它們對(duì)白蟻消化木質(zhì)纖維素類食物有著重要作用16。白蟻的危害作為森林“分解者”，白蟻對(duì)森林的物質(zhì)循環(huán)起了很大作用；反之，作為木材害蟲(chóng)，它給人類帶來(lái)了各種危害。白蟻是喜溫性昆蟲(chóng)，只要具備了適宜的溫度，濕度和食物等條件，就能很快的繁殖，擴(kuò)散。白蟻的繁殖危害可造成嚴(yán)重的

19、損失，全世界每年直接和間接的損失達(dá)數(shù)十億美元。由于白蟻危害的嚴(yán)重性和廣泛性而引起了人們的重視。在歐洲，散白蟻(Reticulitermes)造成的財(cái)產(chǎn)損失最大，僅法國(guó)每年損失就達(dá)2億歐元。在意大利、西班牙、葡萄牙和希臘，白蟻對(duì)建筑的侵害也很嚴(yán)重，很多具歷史意義的建筑被嚴(yán)重?fù)p壞。隨著歐洲經(jīng)濟(jì)復(fù)蘇，在5年內(nèi)，年除害處理費(fèi)用至少達(dá)到10億歐元。.1白蟻對(duì)建筑物的破壞白蟻對(duì)建筑物的破壞，特別是對(duì)磚木結(jié)構(gòu)、木結(jié)構(gòu)建筑的破壞，由于其隱蔽在木結(jié)構(gòu)內(nèi)部破壞或破壞其承重部位，往往造成房屋突然倒塌，導(dǎo)致財(cái)產(chǎn)損失和人員傷亡，引起人們的極大關(guān)注。近年來(lái)，隨著鋼筋混凝土建筑的增多，被白蟻破壞造成倒塌的危險(xiǎn)性的比率是在逐

20、步降低。但是，新的大廈內(nèi)部木結(jié)構(gòu)仍可遭受白蟻破壞。白蟻不僅危害木結(jié)構(gòu)，而且它分泌的蟻酸也可以腐蝕金屬。因此，新建房屋必須進(jìn)行白蟻預(yù)防處理。.2白蟻對(duì)堤壩的破環(huán)在我國(guó)南方諸省、區(qū)的堤壩白蟻危害極為普遍，堤壩白蟻主要危害種類是土白蟻屬和大白蟻屬，在中國(guó)有廣泛的分布。尤其是長(zhǎng)江流域及其以南的江河堤圍和山塘水庫(kù)，普遍遭受白蟻的危害，常常出現(xiàn)蟻患險(xiǎn)情和災(zāi)難。這些白蟻在堤壩內(nèi)2-3m甚至更深處，修筑直徑達(dá)lm以上的巢，密集營(yíng)巢，蟻道四通八達(dá)，有些蟻道甚至穿通堤壩的內(nèi)外坡。當(dāng)汛期水位升高時(shí)，常常出現(xiàn)管涌、滑坡、垮壩險(xiǎn)情。.3白蟻對(duì)農(nóng)作物的危害白蟻可以危害花生、木薯、桑、茶、玉米、小麥、水稻等農(nóng)作物，尤其對(duì)甘

21、蔗的危害十分嚴(yán)重。另外，白蟻對(duì)楊梅、山核桃、杉木、樟樹(shù)、按樹(shù)、刺槐、垂柳、懸鈴木、白楊、重陽(yáng)木、拐棗等林木、果樹(shù)等的危害也具有相當(dāng)?shù)膹V泛性和嚴(yán)重性。在南方丘陵地區(qū)，杉木林基地的蟻害率一般達(dá)4060。在廣州市郊區(qū)，公路兩旁的按樹(shù)蟻害率達(dá)90以上。.4白蟻對(duì)通訊設(shè)備的破壞埋地塑料電纜和通訊設(shè)備也常遭白蟻蛀食。在南方，白蟻造成的通訊電纜故障占總故障率60，廣東省則高達(dá)80。電力電纜被白蟻咬穿護(hù)層后，還易引起短路，導(dǎo)致電力轉(zhuǎn)送中斷，甚至釀成火災(zāi)。據(jù)報(bào)道，我國(guó)南方已有12個(gè)省、市、自治區(qū)，發(fā)現(xiàn)白蟻破壞埋地塑料電纜情況。.5白蟻對(duì)其他物品的危害白蟻還能危害圖書(shū)、文物、織物、武器、賬冊(cè)、錢幣、地下電纜等，造

22、成重大損失。.6白蟻對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害據(jù)統(tǒng)計(jì)世界上的白蟻群每年向大氣排放2000萬(wàn)噸蟻酸，蟻酸產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)，污染大氣，此項(xiàng)污染已超過(guò)了汽車和工業(yè)煙霧對(duì)環(huán)境造成的污染。目前各國(guó)腫瘤專家認(rèn)為：空氣越污染，癌癥的發(fā)病率就越高。由此看來(lái)白蟻是個(gè)不可忽視的禍根17。1.4白蟻的防治物理防治法使用簡(jiǎn)單工具、機(jī)械及利用光、熱、電等來(lái)防治白蟻的方法，它具有殺蟻直接、不造成環(huán)境污染、不破壞木材等被處理物的特點(diǎn)，特別適用于文物、木竹制品等白蟻的防治。主要有：人工挖取白蟻巢，利用射線，熱能，電能防治白蟻以及燈光誘殺等。物理屏障技術(shù)，主要是利用砂子、玄武巖石子顆粒、金屬網(wǎng)、金屬板和PVC板等物質(zhì)作為物理或機(jī)械屏障，防止

23、白蟻進(jìn)入建筑物內(nèi)造成危害的方法。是利用白蟻只能通過(guò)1 mm以上的空隙，但不能用口器搬運(yùn)直徑大于1 mm的石頭顆粒的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)障礙物阻止白蟻通過(guò)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)主要是能預(yù)防白蟻進(jìn)入建筑物內(nèi)進(jìn)行為害，而不是驅(qū)趕或滅殺接近建筑物的白蟻；可結(jié)合建筑物施工時(shí)完成，花費(fèi)不高，對(duì)環(huán)境友好。不足的是未能阻止分飛的蟻群進(jìn)入建筑物。在澳大利亞、加拿大和美國(guó)的夏威夷，這種技術(shù)投入商業(yè)運(yùn)用已超過(guò)10年，申請(qǐng)了多個(gè)專利。物理屏障法可根據(jù)需要采用以下幾種屏障材料：篩網(wǎng)，石頭顆粒，防護(hù)板，防水膜和鋼結(jié)構(gòu)等18。物理防治雖然具有無(wú)污染、無(wú)殘留、無(wú)毒害等優(yōu)點(diǎn)，且有的措施還能在短時(shí)間內(nèi)使白蟻死亡，但是，由于使白蟻死亡的有效物質(zhì)（

24、光、電、熱、射線等）均要直接作用到白蟻，才能使白蟻死亡，致死物在蟻群中不能增值傳染，不能依靠白蟻間相互感染消滅整個(gè)蟻群。因而，物理防治較適宜于局部處理，不能廣泛應(yīng)用于白蟻防治，難以達(dá)到長(zhǎng)久有效的要求?；瘜W(xué)防治法化學(xué)防治因其毒殺效果好，驅(qū)避強(qiáng)烈，所以仍然是目前最主要、最普遍研究的白蟻防治方法。在防治過(guò)程中一般是利用化學(xué)防治劑的觸殺、胃毒、熏蒸等作用來(lái)殲滅白蟻。目前常用的白蟻防治方法主要有：粉劑毒殺法，潑澆法，毒餌誘殺法，熏蒸法等. 藥劑的毒力是化學(xué)防治的核心，在防治過(guò)程中，藥劑無(wú)增值作用。而高效低毒對(duì)化學(xué)防治來(lái)講，是一項(xiàng)難以克服的矛盾。現(xiàn)在的化學(xué)防治研究，也只能提高藥劑的利用率，降低防治工作的損

25、耗量，無(wú)法避免使用毒劑，只能使實(shí)際用藥量盡可能接近防治所需的最小用藥量。目前我國(guó)及各國(guó)市場(chǎng)上常用的白蟻防治劑主要有：砷制劑、金屬鹽類、無(wú)機(jī)酸類、有機(jī)氯(氟)類、有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲(chóng)菊酯類、硅烷類、有機(jī)雜環(huán)類和昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等。砷制劑是無(wú)機(jī)白蟻防治劑的重要品種，主要品種如亞砷酸(As2O3)、砷酸鉛、亞砷酸鈉等。亞砷酸俗稱砒霜，是一種強(qiáng)胃毒劑。利用白蟻的互相吮舐習(xí)性，還可制成各種誘殺劑使用。該藥是我國(guó)目前使用量最大的滅蟻劑，但在潮濕環(huán)境下滅蟻效果不佳。目前，隨著人們環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，逐漸被淘汰。有機(jī)氯(氟)藥劑其主要品種如氯丹(chlordane)等。氯丹的觸殺、胃毒、熏蒸作用強(qiáng)烈，且殘

26、效期長(zhǎng)，廣泛用于新建房屋的白蟻預(yù)防，是我國(guó)過(guò)去使用量最大的白蟻預(yù)防藥劑。但是，由于這些藥物的強(qiáng)殘留作用和高汽化性，我國(guó)現(xiàn)在已經(jīng)停止生產(chǎn)并禁止使用。硫酰氟(sulfurylfluoride)和溴甲烷是目前我國(guó)被允許使用的2種熏蒸劑，但溴甲烷在發(fā)達(dá)國(guó)家已于2005年被禁止使用，發(fā)展中國(guó)家則需在2015年完全淘汰。有機(jī)磷類代表為毒死蜱(chlorpyrifos)，是一種有機(jī)磷類高效白蟻防治劑。觸殺、胃毒和熏蒸作用強(qiáng)烈，而且長(zhǎng)效、廣譜、低殘留。毒死蜱是國(guó)內(nèi)目前最有可能替代氯丹的較理想藥劑，也是目前國(guó)外使用最多的白蟻預(yù)防藥劑。此外，擬除蟲(chóng)菊酯類藥劑是目前世界上品種最多的白蟻預(yù)防藥劑，以氯菊酯(perme

27、thrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、氰戊菊酯(fenvalerate)等菊酯類為有效成分為代表的白蟻防治劑，已在美國(guó)甚至全世界都占有較大的市場(chǎng)比例19。生物防治法隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和人們對(duì)白蟻習(xí)性的了解，生物防治白蟻將是未來(lái)白蟻防治的主流。利用生物源物質(zhì)作為白蟻防治劑對(duì)白蟻進(jìn)行控制和減滅的技術(shù)稱為生物源物質(zhì)防治技術(shù)。這一技術(shù)由于可選種類多樣、作用方式獨(dú)特和環(huán)境和諧性良好等優(yōu)點(diǎn)而受到產(chǎn)業(yè)界和大眾的重視。植物是未來(lái)殺白蟻劑的寶庫(kù)，它的提取物對(duì)白蟻具有毒殺、驅(qū)避和拒食作用。已有越來(lái)越多的殺蟲(chóng)植物活性物質(zhì)用于白蟻防治。伊可兒等20從83種樹(shù)木提取液中，篩選出29種樹(shù)木提取液對(duì)白蟻均有較

28、強(qiáng)的忌避活性效果。利用可引起白蟻致病致死的病原微生物(真菌、細(xì)菌、病毒等)在蟻群中感染、傳播，而達(dá)到防治白蟻的目的。目前微生物防治雖然還處于試驗(yàn)研究階段，但是國(guó)內(nèi)外科技工作者通過(guò)不懈努力，已取得可喜的成果。黃曲霉Aspergillus flavus、白僵菌Beauveria bassiana、綠僵菌Metarhiziumanisopliae等對(duì)白蟻的毒力也較高21。目前，利用這類真菌防治白蟻申請(qǐng)了多個(gè)專利?；旌鲜褂美ハx(chóng)病原線蟲(chóng)的Xenorhabdus、Photorhabdus共生細(xì)菌和病原真菌球孢白僵菌或金龜子綠僵菌可防治白蟻，并申請(qǐng)了專利22，23。微生物(真菌、細(xì)菌、病毒等)具有選擇性強(qiáng)的

29、特點(diǎn)，只要選擇只對(duì)寄主(白蟻等昆蟲(chóng))有作用，對(duì)人、畜和農(nóng)作物等無(wú)害、無(wú)污染的微生物，就能達(dá)到低毒的要求。另一方面，微生物在使寄主致病致死的過(guò)程中，本身也在急劇繁殖，具有增殖作用。而且，白蟻是營(yíng)巢居的集群生活，相互間有交哺，舔舐的習(xí)性，特別是“對(duì)病蟻舔唰至死為止”的特性，為微生物在蟻群中感染傳播提供有利條件，使微生物防治有可能達(dá)到高效的要求。1.5 本試驗(yàn)研究的目的及意義香柏具有天然的抗白蟻、抗腐蝕等特性，且已從這種樹(shù)中分離到香榧醇、香柏酮等十多種具有抗白蟻?zhàn)饔梦镔|(zhì)。按照基因可互相傳遞的原則推測(cè)，這些抗白蟻物質(zhì)可能由其內(nèi)生菌產(chǎn)生，而使香柏具有抗白蟻的功能。本試驗(yàn)從柏樹(shù)中分離內(nèi)生真菌，以在白蟻體內(nèi)

30、分離的產(chǎn)纖維素酶、木質(zhì)素酶的共生菌作指示菌，利用牛津杯法對(duì)分離到的內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物做抑菌試驗(yàn)，篩選出抑菌效果好的菌株。以篩選到的菌株代謝產(chǎn)物來(lái)殺滅白蟻，為白蟻的微生物防治開(kāi)辟出新的途徑，不僅達(dá)到了防治白蟻的目的，也解決傳統(tǒng)方法對(duì)環(huán)境的毒害問(wèn)題。2.材料與方法2.1 材料及設(shè)備2.1.1分離內(nèi)生菌所用樹(shù)木及指示菌柏樹(shù)(Port-orford-cedar)樹(shù)枝、樹(shù)皮；指示菌：細(xì)菌HDB-II-003、HDB-II-005，真菌HDF-I-006、HDF-I-008（白蟻腸道內(nèi)分解纖維素的內(nèi)生菌，由本實(shí)驗(yàn)室從黑翅土白蟻腸道內(nèi)分離并保存） 培養(yǎng)基（1）分離培養(yǎng)基：樹(shù)木浸汁20mL，瓊脂20g，蒸餾水

31、980mL，pH 自然；（2）真菌分離培養(yǎng)基：酵母膏1g，樹(shù)木浸汁20mL，瓊脂20g，鏈霉素終濃度30.0µg/mL,蒸餾水980mL，pH4.8；（3）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1000ml，pH7.0-7.2，固體培養(yǎng)基加入2的瓊脂；（4）半固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中加入0.6瓊脂，加熱溶解，分裝小瓶，每瓶25mL；（5）查氏培養(yǎng)基：蔗糖30g，NaN032.0g，KCl O.5g，MgS04O.5g，F(xiàn)eS04 O.O1g，K2HP041.0g，蒸餾水1000ml，pH自然，固體培養(yǎng)基加入2的瓊脂；（6）

32、半固體查氏培養(yǎng)基：查氏液體培養(yǎng)基中加入0.6的瓊脂，加熱溶解，分裝小瓶，每瓶25mL；（7）水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂20g，蒸餾水1000m1，pH自然；以上培養(yǎng)基在1.05kg/cm2，121，20min高壓蒸汽滅菌后備用。 主要儀器設(shè)備電子天平：梅特勒托利多儀器上海有限公司全自動(dòng)滅菌鍋（SANYO Electric Co.Ltd.）；柜式恒溫冷凍搖床HQL300A：中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠超凈臺(tái)SWCJ2FD：蘇凈集團(tuán)安泰公司電熱恒溫培養(yǎng)箱Q/BKYY28-200：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生化培養(yǎng)箱LRH250A：廣東省醫(yī)療器械廠保鮮柜LC156：海爾集團(tuán)低速離心機(jī)LD52A：北京醫(yī)用離心機(jī)廠光學(xué)顯微

33、鏡SA3000：北京泰克儀器有限公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG9140A：上海一恒科技有限公司2.2 試驗(yàn)方法 內(nèi)生真菌的分離用滅菌解剖刀分別取主干和側(cè)枝的樹(shù)皮、韌皮部和木質(zhì)部，切成薄層小塊(兩端均需有切口)，約1cm×1.5cm大小，用自來(lái)水將表面清洗干凈晾干，無(wú)菌操作置于75乙醇消毒35min，后用無(wú)菌水沖洗34次，0.1升汞消毒30s，再用75乙醇消毒1min，無(wú)菌水沖洗34次，將橫截面切段接入已倒好的分離培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿置于28培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)35d。大約 35d后在分離培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌，然后三區(qū)劃線法把菌接入真菌分離培養(yǎng)基，分離出單菌落。 內(nèi)生真菌的純化接種物培養(yǎng)23d后，其

34、邊緣長(zhǎng)出菌絲，用接種針挑取切口處新長(zhǎng)出的菌絲，及時(shí)轉(zhuǎn)接至查氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落出現(xiàn)后，按以下方法逐步純化，對(duì)菌株編號(hào)后，轉(zhuǎn)至查氏斜面培養(yǎng)基上，于28培養(yǎng)箱中培養(yǎng)34d，然后放入4冰箱保存。2.2.2.1平板劃線分離法先用滅菌的接種環(huán)挑取少許菌，在瓊脂平板上劃Z線至平板三分之一處，此為一區(qū)，一區(qū)要密些，然后灼燒接種環(huán)，將接種環(huán)冷卻后，劃二區(qū)，劃線要與一區(qū)交叉一次，同理劃三區(qū)與二區(qū)交叉一次。三區(qū)要?jiǎng)澋姆稚⑿?，以便容易分離出單菌落。2.2.2.2稀釋涂布平板法（1）倒平板 將查氏固體培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至5560時(shí)，倒平板。（2）制備菌懸液將待測(cè)菌接入裝有10mL無(wú)菌水的試管中，振搖約20min，

35、用一支1mL無(wú)菌吸管吸取1mL菌液，加入到盛有9mL無(wú)菌水的試管中，混合均勻。然后用另一無(wú)菌移液槍從此試管吸取1mL混合液加入另一瓶盛有9mL無(wú)菌水的試管中，混合均勻。以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同濃度的菌懸液。（3）涂布將上述培養(yǎng)基的平板底面分別標(biāo)記上10-5、10-6、10-7、10-8四種稀釋梯度，然后用無(wú)菌移液槍分別由10-5、10-6、10-7、10-8四管中吸取0.1mL菌液對(duì)號(hào)放入相應(yīng)的平板中，用無(wú)菌玻璃涂布棒輕輕涂勻，靜置510min。（4）培養(yǎng)將平板倒置于28培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2448h。（5）挑菌落將培養(yǎng)后長(zhǎng)出單個(gè)

36、菌落的平板分別調(diào)取少許菌體接種到查氏斜面上，28培養(yǎng)箱中培養(yǎng)34d，4冰箱保藏。 搖瓶培養(yǎng)無(wú)菌操作條件下，將分離出的內(nèi)生真菌用接種環(huán)接種于盛有200mL查氏液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶?jī)?nèi)，每菌株1瓶，在28，140r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)711d。 牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn).1培養(yǎng)基（1）水瓊脂培養(yǎng)基：作為雙層培養(yǎng)基的底層（23mm），使之與上層的半固體培養(yǎng)基結(jié)合緊密，在去掉牛津杯加入發(fā)酵液后，發(fā)酵液不會(huì)外泄；（2）查氏半固體培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)真菌；（3）牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)細(xì)菌。.2立牛津杯制備水瓊脂平板：滅菌后的水瓊脂培養(yǎng)基分別裝于已滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)（約15mL），冷凝后在培養(yǎng)基上均勻

37、放置2個(gè)已滅菌的牛津杯。.3菌懸液的制備預(yù)先把指示菌在室溫下活化2h，然后在超凈臺(tái)上用接種環(huán)刮取兩環(huán)菌種置于30mL無(wú)菌水中，搖勻，制成菌懸液。.4雙層培養(yǎng)基的制備在無(wú)菌條件下，用移液槍吸取1mL菌懸液加入到盛有25mL半固體培養(yǎng)基的小三角瓶中，其中細(xì)菌指示菌加入到牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基，真菌指示菌加入到查氏半固體培養(yǎng)基，混勻后，倒入已立有牛津杯的水瓊脂培養(yǎng)皿中備用。.5發(fā)酵液的制備將搖瓶培養(yǎng)的真菌發(fā)酵液，在無(wú)菌條件下，倒入已滅菌的離心管中，3500rpm離心12min。棄去沉淀，取上清液置于已滅菌的三角瓶?jī)?nèi)。.6 抑菌實(shí)驗(yàn)待上層半固體培養(yǎng)基冷凝后，用鑷子沾取酒精經(jīng)火焰滅菌后，將雙層培養(yǎng)基中

38、的牛津杯輕輕拔出（要保持邊緣圓滑）。用移液槍將150L已制備好的發(fā)酵液注入到牛津杯留下的孔內(nèi)。室溫放置34h后放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)菌指示菌28培養(yǎng)16h左右，真菌指示菌28培養(yǎng)48h左右，測(cè)其抑菌效果。3.結(jié)果與分析3.1 柏樹(shù)木內(nèi)生真菌的分離把處理過(guò)的木塊置入含有樹(shù)木浸汁的水瓊脂培養(yǎng)基，同時(shí)另取同樣處理過(guò)的小木塊在對(duì)照培養(yǎng)基平板上滾動(dòng)擦拭，此平板與分離平板一起培養(yǎng)，以檢驗(yàn)樹(shù)木小塊表面消毒是否徹底。小木塊置入水瓊脂培養(yǎng)基，可最大程度減少染菌的機(jī)會(huì)。通過(guò)觀察，發(fā)現(xiàn)對(duì)照培養(yǎng)基上沒(méi)有生長(zhǎng)任何微生物，證明分離到的微生物為植物的內(nèi)生菌。本試驗(yàn)從柏樹(shù)木中分離獲得了34株內(nèi)生真菌，編號(hào)為HDF-I-211至

39、HDF-I-244。3.2活性篩選結(jié)果從34株內(nèi)生真菌中選取第711d發(fā)酵液進(jìn)行處理，分別對(duì)細(xì)菌指示菌HDB-II-003、HDB-II-005，真菌指示菌HDF-I-006、HDF-I-008作抑菌試驗(yàn)，測(cè)試其抑菌活性。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4-1、表4-2。結(jié)果表明有4株菌株分別為HDF-I-217、HDF-I-224 、HDF-I-232、HDF-I-241的代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌指示菌有較好程度的抑菌活性，有5株菌株HDF-I-217、HDF-I-219、HDF-I-232、HDF-I-237、HDF-I-242的代謝產(chǎn)物對(duì)真菌指示菌有較好程度的抑菌活性。綜合以上結(jié)果編號(hào)HDF-I-217、HDF-I-

40、232抑菌效果最好。菌株HDF-I-232抑菌效果見(jiàn)附錄。表4-1 內(nèi)生真菌活性篩選抑菌結(jié)果Table 4-1 The screening results of bacteriostasis for endogenous fungi指示菌菌種第7 d第8 d第9 d第10 d第11 d細(xì)菌-003細(xì)菌-005細(xì)菌-003細(xì)菌-005細(xì)菌-003細(xì)菌-005細(xì)菌-003細(xì)菌-005細(xì)菌-003細(xì)菌-005HDF-I-211HDF-I-212HDF-I-213HDF-I-214HDF-I-215HDF-I-216HDF-I-217+HDF-I-218HDF-I-219HDF-I-220HDF-I-

41、221HDF-I-222HDF-I-223HDF-I-224+HDF-I-225HDF-I-226HDF-I-227HDF-I-228HDF-I-229HDF-I-230HDF-I-231HDF-I-232+HDF-I-233HDF-I-234HDF-I-235HDF-I-236HDF-I-237HDF-I-238HDF-I-239HDF-I-240HDF-I-241+HDF-I-242HDF-I-243HDF-I-244注：0<(平均抑菌圈直徑)<6mm；+：6mm <<10mm；+：10mm<<16mm；+：16mm<<26mm；+：26mm

42、表4-2 內(nèi)生真菌活性篩選抑菌結(jié)果Table 4-2 The screening results of bacteriostasis for endogenous fungi 指 示菌菌 種第7 d第8 d第9 d第10 d第11 d真菌-006真菌-008真菌-006真菌-008真菌-006真菌-008真菌-006真菌-008真菌-006真菌-008HDF-I-211HDF-I-212HDF-I-213HDF-I-214HDF-I-215HDF-I-216HDF-I-217+HDF-I-218HDF-I-219+HDF-I-220HDF-I-221HDF-I-222HDF-I-223HDF-

43、I-224HDF-I-225HDF-I-226HDF-I-227HDF-I-228HDF-I-229HDF-I-230HDF-I-231HDF-I-232+HDF-I-233HDF-I-234HDF-I-235HDF-I-236HDF-I-237+HDF-I-238HDF-I-239HDF-I-240HDF-I-241+HDF-I-242+HDF-I-243HDF-I-244注：0<(平均抑菌圈直徑)<6mm；+：6<<10mm；+：10mm<<16mm；+：16mm<<26mm；+：26mm4.討 論近年來(lái)，內(nèi)生菌由于其獨(dú)特的生理特性及在自然界

44、中重要的生態(tài)學(xué)作用，引起了人們廣泛的關(guān)注。植物內(nèi)生菌是一類次生代謝產(chǎn)物豐富、應(yīng)用前景廣闊的資源微生物。從對(duì)植物內(nèi)生菌的存在、分布、種類、到內(nèi)生菌的生理特性，各類研究競(jìng)相開(kāi)展并頗有成效。而內(nèi)生真菌作為微生物中的重要類群，若能對(duì)其進(jìn)行合理的開(kāi)發(fā)與利用，從中尋找并發(fā)現(xiàn)新型先導(dǎo)化合物，則將成為開(kāi)發(fā)新藥物、研制新農(nóng)藥的重要途徑。在分離過(guò)程中，HDF-I-219的分離出現(xiàn)了一些困難，在視野中的菌形態(tài)并不均一，經(jīng)過(guò)多次的梯度稀釋、劃線分離后，得到了純的單菌落。因此，在菌的分離過(guò)程中，要嚴(yán)格堅(jiān)持無(wú)菌操作，操作時(shí)要有細(xì)心耐心。本試驗(yàn)在分離內(nèi)生真菌過(guò)程中，為檢查材料表面消毒的效果，做如下對(duì)照試驗(yàn)：將上述同樣表面消

45、毒過(guò)的小塊直接置于分離培養(yǎng)基平板上作對(duì)照培養(yǎng)處理，結(jié)果若對(duì)照材料周圍均無(wú)任何真菌長(zhǎng)出，證明表面消毒徹底，從而保證了所分離出的真菌是植物的內(nèi)生真菌而不是空氣中的或組織塊表面附生的微生物。有些內(nèi)生真菌專一性地寄生在植物體內(nèi)，不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，即使使用不同的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，也不能確保把生活在植物組織內(nèi)的所有真菌全部分離出來(lái)。有些已分離到的內(nèi)生真菌在人工培養(yǎng)基上不產(chǎn)生可育性孢子，就會(huì)由于菌絲體的死亡而造成菌種丟失，因此不能準(zhǔn)確地反映出植物組織內(nèi)生菌的數(shù)量和種群。提高內(nèi)生菌所產(chǎn)生的抗菌化合物的產(chǎn)量，將來(lái)可以采取常規(guī)誘變、基因工程等手段選育高產(chǎn)菌株以及優(yōu)化培養(yǎng)基成分、研究發(fā)酵條件和代謝調(diào)控等方法提高

46、抗白蟻化合物的產(chǎn)量。植物內(nèi)生真菌的研究存在許多問(wèn)題，只有通過(guò)對(duì)內(nèi)生真菌全面系統(tǒng)的研究，并借助于其它學(xué)科的研究方法和手段，進(jìn)一步完善其基礎(chǔ)理論，才能推動(dòng)植物內(nèi)生真菌研究的不斷深入，豐富微生物資源。植物內(nèi)生真菌這一資源將得到更多更合理的開(kāi)發(fā)與利用，為醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)的發(fā)展做出巨大貢獻(xiàn)。5.結(jié) 論5.1從柏樹(shù)中分離得到34株內(nèi)生真菌；5.2菌株HDF-I-217、HDF-I-224、HDF-I-232、HDF-I-241的代謝產(chǎn)物對(duì)白蟻腸道內(nèi)生細(xì)菌具有抑菌活性；5.3菌株HDF-I-217、HDF-I-219、HDF-I-232、HDF-I-237、HDF-I-242的代謝產(chǎn)物對(duì)白蟻腸道內(nèi)生真菌具有抑菌活性；5.4綜合以上篩選結(jié)果菌株HDF-I-217、HDF-I-232抑菌效果最好。參考文獻(xiàn)1 張曉瑞.植物內(nèi)生菌及其開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究進(jìn)展J.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展.2007，7(11):1747-1750.2Stone J K, Bacon C W, White J F. An o