基于納米復(fù)合材料的應(yīng)用

1、摘 要目的 藥物敏感性試驗(yàn)簡稱藥敏試驗(yàn)，旨在了解病原微生物對各種抗生素的敏感程度，指導(dǎo)臨床合理選用抗生素的種類和用量，以做到利用藥物對疾病進(jìn)行更加準(zhǔn)確的治療。由于在實(shí)踐操作中所進(jìn)行的各種標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗(yàn)的周期較長，一般需要耗用幾十個(gè)小時(shí)，且操作過程較復(fù)雜，需要有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證。因此，建立靈敏、快速和操作簡單的藥物敏感性試驗(yàn)方法在科研應(yīng)用方面具有非常重要的意義。本研究以普魯士藍(lán)(PB)為光學(xué)探針，大腸埃希氏菌(E. coli)為模型微生物所構(gòu)建一種新型的光學(xué)體外藥敏試驗(yàn)方法，用于快速的檢測出藥物有效性及篩選出抗菌新化合物，彌補(bǔ)現(xiàn)有的方法缺陷。方法實(shí)驗(yàn)以K3Fe(CN)6為電子受體，定

2、量轉(zhuǎn)移微生物呼吸作用所產(chǎn)生的電子，自身被還原為K4Fe(CN)6，與后續(xù)加入的FeCl3反應(yīng)生成普魯士藍(lán)(PB)。當(dāng)微生物的活性受到抑制時(shí)，其呼吸作用會(huì)減弱，相應(yīng)生成的PB的量也會(huì)減少。因此，可通過700nm處測定PB的吸光度確定受試微生物活性變化。通過考察Fe(CN)64-的生成量，確定體系的稀釋倍數(shù)和FeCl3的加入量；通過考察吸光度值與E. coli固定時(shí)間的關(guān)系，確定氧化石墨烯(GO)固定E. coli的最佳時(shí)間；通過比較固定化E. coli在Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基和磷酸緩沖溶液中活性隨存儲(chǔ)時(shí)間的變化趨勢，確定最佳存儲(chǔ)條件；根據(jù)吸光度值的變化，將最優(yōu)條件下制備的GO固

3、定E. coli顆粒用于檢測阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星、萬古霉素、頭孢噻肟鈉5種抗生素的有效性。結(jié)果4h培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，45 mmol/LK3Fe(CN)6足夠用于轉(zhuǎn)移微生物呼吸作用產(chǎn)生的電子，但生成的K4Fe(CN)6量過多，導(dǎo)致生成的PB沉淀，因此應(yīng)在加入FeCl3之前，將培養(yǎng)液稀釋至5 mmol/L。當(dāng)固定時(shí)間為16 h時(shí)，以具有表面GO結(jié)構(gòu)的石墨顆粒為載體的E. coli固定效果最好。培養(yǎng)相同的時(shí)間，在PBS中保存的GO固定E. coli的吸光度值比其在培養(yǎng)基中保存時(shí)的吸光度值小。以GO固定E. coli為受體的光學(xué)方法進(jìn)行藥物的有效性檢測中，抗生素對菌體活性的影響與接觸時(shí)間和抗生素種

4、類相關(guān)。阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星和頭孢噻肟鈉均可對E. coli產(chǎn)生明顯抑制作用；相比之下，萬古霉素的作用較弱。結(jié)論 與一般的藥物有效性檢測方法不同，在優(yōu)化條件下的基于GO固定E. coli的PB光學(xué)檢測方法更加簡便、快捷、低耗、價(jià)廉，同時(shí)具有較好的靈敏度。所以，該方法在抗菌類藥物的檢測和臨床診斷方面具有一定的應(yīng)用潛力。關(guān)鍵詞：藥敏實(shí)驗(yàn)；普魯士藍(lán)；光學(xué)方法；抗生素；藥物有效性 ABSTRACTObjective The drug susceptibility test referred to as the drug sensitivity test, which is designed

5、to understand the sensitivity of pathogenic microorganism to various antibiotics in order to guide clinical rational selection of the types and dosage of antibiotics. So the drug susceptibility test ensures a more accurate use of drug to treat the objective disease. However, the testing cycle of var

6、ious standard drug susceptibility tests are so long, even spending dozens of hours. Otherwise, the standard drug susceptibility test is often needing complex operations and professionals to repeatedly verify the accuracy of the test results. Therefore, establishment of a rapid, sensitive and simple

7、drug susceptibility test is of great significant in scientific research and application. .This study applies a common dye - Prussian blue (PB) as a optical probe and Escherichia coli (E. coli) as a model microorganism to build a novel optical drug susceptibility test in vitro for rapid detection of

8、drug effectiveness and screening of new antibacterial compounds. We expect that this novel method is making up the defects of existing drug susceptibility test. Methods In our test, K3Fe(CN)6 that was as a electron carrier was used to transfer the electrons from bacterial respiration. Then reduction

9、 product of K4Fe(CN)6 was mixed with an addition of FeCl3 to generate prussian blue (PB). The bacterial respiration should be weakened when the bacterial activities were inhibited. So the production of PB was reduced. Therefore, the bacterial activities could be measured at PB absorbance of 700 nm.

10、Production of Fe(CN)64- was studied to ensure a suitable dilution ration of our system and additional concentration of FeCl3. The relationship between absorbance value and immobilized time was studied to screen an optimum immobilized time of E. coli on GO. Two different stored methods, such as Luria

11、-Bertani (LB) culture and phosphoric acid buffer solution, were respectively studied to screen an optimum stored condition. Finally, our optimum conditions were used to prepare GO immobilized E. coli for detecting the effectivenesses of antibiotics, such as amikacin, gentamicin, levofloxacin, vancom

12、ycin and cefotaxime sodium. Results K3Fe(CN)6 of 45 mmol/L was enough to transfer all electrons from bacterial respiration within 4 h incubation time. But the production of K4Fe(CN)6 was too many to produce stable PB solution. So the incubation culture should be diluted and ensured the content of K4

13、Fe(CN)6 of 5 mmol/L before addition of FeCl3 solution. The optimum immobilized time of E. coli was 16 h when the graphite particles was modified with GO structure on its surface. At the same incubation time, the PB absorbance produced by respiration of E. coli that was stored in the PBS was lower th

14、an E. coli that was stored in the LB culture. The GO immobilized E. coli was as testing model to apply into test of drug effectiveness with optical method. All results showed that the effectivenesses of antibiotics on the bacterial activities were related to the contact time and the kinds of used an

15、tibiotics. The antibiotics of amikacin, gentamicin, levofloxacin and cefotaxime sodium all showed obviously inhibitions on the respiration of E. coli. Comparing with other four kinds of antibiotics mentioned above, the effectiveness of vancomycin was weaker. Conclusion It was different from general

16、drug effectiveness detection method, the PB optical detection method with GO immobilized E. coli was simpler, lower consumption, rapider and cheaper, well with good sensitivity. So our study has a cetrain potential in the detection and clinical diagnosis of antibacterial drugs. Keywords: Drug suscep

17、tibility test; Prussian blue; Optical methods; Antibiotics; Drug effectiveness前 言隨著抗菌藥物在我們?nèi)粘Ｉ钪械膹V泛使用，導(dǎo)致越來越多的細(xì)菌開始對藥物產(chǎn)生耐藥性，給由細(xì)菌導(dǎo)致的疾病的治療帶來了非常大的困難。目前致病性耐藥菌已成為大家廣泛關(guān)注的一個(gè)問題，要解決這一嚴(yán)峻的問題不僅需要我們有不亂使用抗生素的意識，同時(shí)也需要研發(fā)出新的更有效的抗生素開對抗細(xì)菌以及耐藥菌。但是現(xiàn)在生產(chǎn)抗生素的技術(shù)發(fā)展非常的緩慢，相關(guān)的研究也不是很規(guī)范，達(dá)不到現(xiàn)在醫(yī)藥生產(chǎn)企業(yè)對藥品生產(chǎn)效率的要求，影響了企業(yè)對新藥的研發(fā)進(jìn)程。研發(fā)新藥時(shí)需要建立藥

18、物量-效曲線關(guān)系模型以及確定所治療疾病。研發(fā)抗菌藥物，確定目標(biāo)疾病與篩選微生物和劑量確定是分不開的。測藥物對微生物抑制作用的大小所用的方法為藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)，他是估計(jì)藥物對細(xì)菌抑制作用的比較方便的方法，且由于其具有較好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，所以被用于初期篩選新藥以及監(jiān)測抗菌藥物療效和檢測細(xì)菌耐藥性。在對藥物進(jìn)行敏感實(shí)驗(yàn)時(shí)宜用陰性對照的方法，但是近年來在藥物的提取，合成以及后來的藥物敏感性檢測中有較大量的使用，所以一般的陰性對照試驗(yàn)對藥敏實(shí)驗(yàn)的安全和準(zhǔn)確已不能保障。新藥的研發(fā)除了需要時(shí)間，大量的人力物力，還要克服成功率低，具有相對較高的風(fēng)險(xiǎn)，周期和投入等實(shí)際問題?，F(xiàn)在紙片擴(kuò)散法仍然是作為抗菌藥物進(jìn)行

19、有效性檢測的體外測試方法，但紙片擴(kuò)散法的實(shí)驗(yàn)周期相對較長，需要消耗大量的試劑且需要專業(yè)的工作人員操作，給藥物的研發(fā)增加了很多的任務(wù)。因此我們需要尋找能克服上述缺點(diǎn)的一種方法來完成對臨床進(jìn)行藥效監(jiān)測和研發(fā)新的抗菌藥。例如，PCR技術(shù)。這些新的藥敏實(shí)驗(yàn)方法能夠更快速，更靈敏的獲取耐藥性微生物的信息。雖然新型的藥物檢測方法相對于傳統(tǒng)方法在靈敏度、準(zhǔn)確度方面有優(yōu)勢，但是新型的藥敏實(shí)驗(yàn)方法需要更高的實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。本實(shí)驗(yàn)采用光學(xué)方法，以鐵氰化鉀做為反應(yīng)體系，通過微生物的呼吸作用使之發(fā)生電子轉(zhuǎn)移生成亞鐵氰化鉀，然后根據(jù)其與三氯化鐵生成普魯士藍(lán)進(jìn)行光學(xué)檢測。通過探究微生物使用的濃度，培養(yǎng)的時(shí)間以及所給的營養(yǎng)物質(zhì)對

20、靈敏度的影響確定適宜的檢測條件。并應(yīng)用哌拉西林、阿莫西林、慶大霉素、阿米卡星和左氧氟沙星5種常見抗生素對20株E. coli臨床分離物的實(shí)際檢測。然后與傳統(tǒng)的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)部分1 儀器和試藥1.1 材料和試劑磷酸氫二鈉 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，磷酸二氫鉀 天津市博迪化工有限公司，硼酸 沈陽市聯(lián)邦試劑廠，無水碳酸鈣天津永晟精細(xì)化工有限公司，葡萄糖 北京化工廠，鐵氰化鉀 天津博迪化工股份有限公司，谷氨酸，鹽酸左氧氟殺星氯化鈉注射液 黑龍江科倫制藥有限公司 批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字 H20055367，硫酸慶大霉素注射液 河南潤弘制藥股份有限公司 批準(zhǔn)文號 H41020318，硫酸阿

21、米卡星注射液 江蘇吳中醫(yī)藥集團(tuán)有限公司蘇州制藥廠 批準(zhǔn)文號H32021408 ，注射用鹽酸萬古霉素 浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠 批準(zhǔn)文號H20033366，頭孢噻肟鈉 哈藥集團(tuán)制藥總廠 批準(zhǔn)文號H23021721，3,5-二氯苯酚(DCP) 沈陽市聯(lián)邦試劑廠。實(shí)驗(yàn)用的E. coli來自于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬一院，經(jīng)活化后用15%甘油置冰箱中冷凍保存。1.2 溶液配制Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g L-1，酵母粉5.0g L-1，NaCl 10.0g L-1，用0.1mol L-1 NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2，120°C滅菌20 min，待

22、用。PBS：0.12mol L-1 Na2HPO4，0.08mol L-1 KH2PO4。 GGA：葡萄糖150mg L-1，谷氨酸150mg L-1。K3Fe(CN)6儲(chǔ)備液：采用去離子水配制330mmol L-1 K3Fe(CN)6，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天使用。1.3 實(shí)驗(yàn)儀器電化學(xué)工作站820C 才華儀器有限公司，CJJ79-1磁力加熱攪拌器， 電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；721紫外分光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司；潔凈工作臺SW-CJ-1E(潔凈等級100級) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。2 方法和結(jié)果2.1 石墨烯顆粒的制備GO不僅具有很好的電子傳導(dǎo)速度(1000

23、m/s)，其結(jié)構(gòu)和組成的特殊性也使得該材料的光學(xué)性能、生物相容性和機(jī)械強(qiáng)度等性質(zhì)較為優(yōu)越，所以在生物傳感領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。本文通過制備具有表面GO結(jié)構(gòu)的載體，固定E. coli，用于開發(fā)抗生素類藥物有效性檢測的光學(xué)微生物傳感技術(shù)。準(zhǔn)確稱取150g石墨棒將其切成15cm左右長度放置于500mL中，用量筒準(zhǔn)確量取200mL濃硫酸，將其緩慢倒入燒杯中浸沒石墨棒，充分反應(yīng)20min。準(zhǔn)確稱取NaNO2和KMnO4各5g備用。先將NaNO2投入石墨棒-濃硫酸反應(yīng)體系中，并迅速轉(zhuǎn)移至冰水浴中保存；投入已準(zhǔn)備好的KMnO4，用玻璃棒持續(xù)攪拌。待石墨棒表面出現(xiàn)大量的孔隙且攪拌費(fèi)力時(shí)，立即將燒杯放入溫水浴中1min

24、，再轉(zhuǎn)移至80的水浴鍋中，直至燒杯壁上有大量的氣泡附著時(shí),加入200mL的去離子水停止反應(yīng)。加入10%鹽酸后，將表面具有大量GO結(jié)構(gòu)的石墨棒趁熱過濾，并用去離子水洗滌數(shù)次至無SO42-為止。將表面具有大量GO結(jié)構(gòu)的石墨棒封入透析袋，置于裝有去離子水的大燒杯中浸沒，隔兩小時(shí)換一次水，并用pH試紙測定其酸堿度。待pH近中性，取出短棒，放入恒溫?fù)u床于37烘干后，切成3cm左右的顆粒置于燒杯中備用。2.2 GO固定大腸桿菌顆粒的制備在無菌條件下將0.2mL E. coli菌種接種到已滅菌的300mL LB培養(yǎng)基中后，向培養(yǎng)基中投入切粒整齊的具有表面GO結(jié)構(gòu)的石墨顆粒，以滅菌錫紙封口，并置于恒溫?fù)u床中培

25、養(yǎng)。達(dá)到預(yù)定培養(yǎng)時(shí)間后,以滅菌藥匙撈出GO固定E. coli顆粒，備用。2.3 電化學(xué)方法測試Fe(CN)64-的濃度新鮮配330mmol/LK3Fe(CN)6儲(chǔ)備液并將其存放在冰箱里保存，取4支1mL心管分別加入0.1mL的45mmol L-1 的K3Fe(CN)6溶液，0.1mL的220mg L-1的GGA溶液，然后用新鮮配置的PBS溶液將其稀釋至1mL。向4支小離心管中分別投入已經(jīng)18h培養(yǎng)的GO固定E. coli顆粒后，置于37°C的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，分別于1h、2h、3h和4h一管進(jìn)行測試。根據(jù)前人研究表明，E. coli呼吸作用所產(chǎn)生的電子可通過Fe(CN)63-轉(zhuǎn)移至微生

26、物體外，同時(shí)Fe(CN)63-轉(zhuǎn)變成 Fe(CN)64-，因此可采用電化學(xué)工作站結(jié)合計(jì)時(shí)電流法檢測培養(yǎng)液經(jīng)不同培養(yǎng)時(shí)間所含F(xiàn)e(CN)64-的量。置外加電壓為450mV，工作電極為Pt微陣列電極，參比電極為Ag/AgCl(飽和KCl)電極，對電極為鉑電極，響應(yīng)時(shí)間為15s如下圖2.3a所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，極限電流值也在不斷增大，說明培養(yǎng)液中所含的Fe(CN)64-的量在不斷增加。以5mmol/L K4Fe(CN)6的極限電流值為參考，計(jì)算不同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)，培養(yǎng)液中所含F(xiàn)e(CN)64-的濃度(圖2.1b)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間分別為1h、2h、3h和4h時(shí)，所測得的電流值分別為3.202e-8A、7

27、.969e-8A、9.832e-8A、12.62e-8A ，5mmol/L K4Fe(CN)6的電流值為2.000e-8A，由比例關(guān)系可求得相對應(yīng)時(shí)間內(nèi)因微生物呼吸作用產(chǎn)生Fe(CN)64-的濃度分別為8.004mmol/L、19.92mmol/L、24.58mmol/L、31.55mmol/L。因K4Fe(CN)6與FeCl3反應(yīng)所生成普魯士藍(lán)的摩爾比為1:1，所以可根據(jù)上述計(jì)算結(jié)果得出需要加入的FeCl3量。但根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)加入FeCl3的濃度超過5mmol/L時(shí)，普魯士藍(lán)絮凝，因此應(yīng)適當(dāng)稀釋含有Fe(CN)64-的培養(yǎng)液后再加入FeCl3，使之生成穩(wěn)定的普魯士藍(lán)溶液。Fig2a The

28、 curve of relationship between incubation time and limiting current圖2a 培養(yǎng)時(shí)間和計(jì)時(shí)電流的關(guān)系曲線 Fig2b The curve of relationship between incubation time and potassium ferrocyanide concentration.圖2b 培養(yǎng)時(shí)間和亞鐵氰化鉀濃度的關(guān)系曲線2.4 篩選GO固定E. coli的最佳反應(yīng)時(shí)間在無菌條件下將0.2mLE. coli菌種接種到已滅菌的300mLLB培養(yǎng)基中后，向培養(yǎng)基中投入切粒整齊的具有表面GO結(jié)構(gòu)的石墨顆粒，以滅菌錫紙

29、封口，并置于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6h、8h、10h、12h、16h、18h、20h和24h。達(dá)到培養(yǎng)時(shí)間后,以滅菌藥匙撈出GO固定E. coli顆粒，備用。將已固定細(xì)菌的GO顆粒置于由0.1mL、0.15g/LGGA溶液，0.1mL、0.045mol/L K3Fe(CN)6溶液以及0.8mLPBS溶液所組成的培養(yǎng)液中反應(yīng)1h。PBS溶液是由 0.12mol?L-1 Na2HPO4以及0.08mol?L-1 KH2PO4配制而成。根據(jù)2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，制備普魯士藍(lán)溶液前應(yīng)對培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋：用槍頭精確吸取培養(yǎng)液0.2mL，加入1mL的去離子水稀釋，然后加入新鮮配置的0.08mol/L的FeCl3溶液2mL

30、，搖勻，生成普魯士藍(lán)。利用紫外分光光度計(jì)于700nm處測定普魯士藍(lán)的吸光度，因普魯士藍(lán)的生成量與微生物的活性成正比關(guān)系，因此可根據(jù)所測得的吸光度值篩選GO固定E. coli的最佳反應(yīng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖2.3所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，吸光度值也在增加；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為18h時(shí)，其吸光度值達(dá)到最大；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于18h時(shí)，其吸光度值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而下降，應(yīng)是由于E. coli逐漸增加，培養(yǎng)物質(zhì)逐漸匱乏而導(dǎo)致菌體活性下降所致。所以由實(shí)驗(yàn)可得，采用表面氧化技術(shù)制備的GO顆粒固定E. coli的最佳生長時(shí)間為18h，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用18h作為固定化時(shí)間。Fig2.4 The curve of absor

31、bance value changes depending on time spend of GO immobilized E. coli圖2.4 吸光度值隨GO固定E. coli的反應(yīng)時(shí)間變化曲線2.5 不同的保存條件對E. coli活性的影響將已經(jīng)18h培養(yǎng)，收獲的GO固定E. coli顆粒分別置于已滅菌的PBS溶液或原培養(yǎng)基中保存，用于保存的溶液必須完全浸沒GO固定E. coli顆粒。分別于保存的1d-10d無間斷的在兩種保存條件下各隨機(jī)選取4粒GO固定E. coli顆粒作為測試對象，采用如2.4所述光學(xué)方法檢測E. coli的菌株活性。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖2.5-1和2.5-2所示，同一保存

32、條件下，吸光度值隨著在K3Fe(CN)6體系中培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，說明增加培養(yǎng)時(shí)間可有效提高Fe(CN)64-的生成量；雖然經(jīng)相同的K3Fe(CN)6體系培養(yǎng)1h、2h、3h和4h，但隨著存儲(chǔ)時(shí)間的增加，采用不同存儲(chǔ)方式的GO固定E. coli顆粒產(chǎn)生的Fe(CN)64-的量均明顯下降，表現(xiàn)為所對應(yīng)的吸光度值與前一天相比均有所降低；此外，經(jīng)相同的保存時(shí)間，相同的培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)條件，在培養(yǎng)基中保存的GO固定E. coli顆粒的活性優(yōu)于PBS中保存的GO固定E. coli顆粒的活性，表現(xiàn)為培養(yǎng)基中保存的GO固定E. coli顆粒所產(chǎn)生的吸光度值更高。相對于單純的PBS保存，培養(yǎng)基可持續(xù)供給固定化

33、E. coli營養(yǎng)物質(zhì)，所以，于培養(yǎng)液中保存的菌株活性持續(xù)的時(shí)間較長。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可觀察到，保存時(shí)間和保存條件均會(huì)對固定化E. coli的活性產(chǎn)生影響，因此在應(yīng)用中應(yīng)慎重選擇微生物的保存方法，并明確規(guī)定保存時(shí)間。Fig.2.5-1 The curve of absorbance value changes depending on incubation time of GO immobilized E. coli stored in PBS solution at different storage time. 圖2.5-1 經(jīng)不同存儲(chǔ)時(shí)間，存儲(chǔ)于PBS溶液中的GO固定E. coli吸光度值隨培

34、養(yǎng)時(shí)間變化曲線Fig2.5-2 The curve of absorbance value changes depending on incubation time of GO immobilized E. coli stored in culture at different storage time.圖2.5-2經(jīng)不同存儲(chǔ)時(shí)間，存儲(chǔ)于培養(yǎng)基中的GO固定E. coli吸光度值隨培養(yǎng)時(shí)間變化曲線2.6 不同種類和濃度的藥物對大腸桿菌活性的影響分別選取阿米卡星，慶大霉素、左氧氟沙星、萬古霉素、頭孢噻肟鈉考察GO固定E. coli對各類抗生素的靈敏度。阿米卡星的有效性檢測：配制好母液800 mg/

35、L，設(shè)置6個(gè)濃度梯度，即0mg/L 、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L、12mg/L。分別吸取母液0mL、0.05mL、0.075mL、0.1mL、0.125mL、0.15mL于12個(gè)離心管中，每只離心管中再加入0.1mL 0.15g/LGGA、0.1mL 0.045mol/L K3Fe(CN)6溶液，用采用滅菌的PBS緩沖溶液補(bǔ)齊培養(yǎng)液至1mL，每個(gè)濃度梯度設(shè)置2個(gè)樣品。加入GO固定E. coli，置于恒溫?fù)u床中反應(yīng)1h，稀釋后補(bǔ)入FeCl3，制備普魯士藍(lán)溶液，用紫外分光光度計(jì)于700nm處測定其吸光度，求每個(gè)濃度梯度吸光度的平均值，進(jìn)而監(jiān)測E. coli的活性變化。慶大霉素

36、的有效性檢測：配制好母液400mg/L，設(shè)置6個(gè)濃度梯度，即0mg/L 、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L。分別吸取母液0mL、0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL于12個(gè)離心管中，每個(gè)濃度梯度設(shè)置2個(gè)樣品，后續(xù)方法與阿米卡星的有效性測試方法相同。左氧氟沙星的有效性檢測：配置好母液400mg/L，分別設(shè)置6個(gè)濃度梯度，0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L。分別吸取母液0mL、0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL于12個(gè)離心管中，每個(gè)濃度梯度設(shè)置2個(gè)樣品，后續(xù)操作與上述阿米卡星有效性測試方法相同。萬古

37、霉素的有效性檢測：配制好母液400mg/L，設(shè)置6個(gè)濃度梯度，即0mg/L 、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L。分別吸取母液0mL、0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL于12個(gè)離心管中，每個(gè)濃度梯度設(shè)置2個(gè)樣品，后續(xù)操作與上述阿米卡星有效性測試方法相同。頭孢噻肟鈉的有效性檢測：配制好母液400mg/L,設(shè)置6個(gè)濃度梯度，即0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L。分別吸取母液0mL、0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL于12個(gè)離心管中，每個(gè)濃度梯度設(shè)置2個(gè)樣品，后續(xù)操作與上述阿米卡星有效

38、性測試方法相同?；赑B光學(xué)方法測定抗生素有效性的原理：當(dāng)有抗生素藥物存在時(shí)，大腸桿菌的呼吸受到抑制，因而產(chǎn)生的Fe(CN)64-少于大腸桿菌正常呼吸所產(chǎn)生的電子，這表明PB生成量的多少取決于抗生素對微生物呼吸的抑制程度，所以可通過肉眼觀察或利用可見光分光光度計(jì)測定吸光度以確定PB產(chǎn)量的減少，進(jìn)而確定抗生素的有效性。不同抗生素藥物的抑制作用與E. coli的呼吸作用的關(guān)系用吸光度值變化率表示：由圖2.6.1-2.6.5可知，隨著阿米卡星，慶大霉素、左氧氟沙星、萬古霉素和頭孢噻肟鈉5種抗生素濃度的增加，其對細(xì)菌的抑制率也在不斷增加。當(dāng)達(dá)到半數(shù)抑菌率時(shí)，阿米卡星的濃度為12mg/L；慶大霉素為8m

39、g/L；左氧氟沙星為10mg/L；頭孢噻肟鈉為3mg/L。但在0mg/L-10mg/L的測量濃度范圍內(nèi)，萬古霉素的抑菌率均低于40%。根據(jù)藥理作用，萬古霉素主要用于葡萄球菌（包括耐青霉素和耐新青霉素株）和難辨梭狀芽胞桿菌等致病菌所導(dǎo)致的疾病治療，對厭氧菌和革蘭氏陰性細(xì)菌效果并不明顯，因此對E. coli的抑制作用較其它抗生素差。可見，本文研究的基于普魯士藍(lán)的光學(xué)測試方法不僅可有效區(qū)分各種抗生素類藥物的靶向微生物，同時(shí)給出有效作用濃度。Fig2.6-1 FDifferent concentrations of amikacin inhibition rate of e. coli activit

40、y圖2.6-1 圖不同濃度的阿米卡星對大腸桿菌活性的抑制率Fig2.6-2 Different concentrations of gentamicin inhibition rate of e. coli activity圖2.6-2 不同濃度的慶大霉素對大腸桿菌活性的抑制率Fig2.6-3 Different concentrations of levofloxacin inhibition rate of e. coli activity圖2.6-3 不同濃度的左氧氟沙星對大腸桿菌活性的抑制率Fig2.6-4 Different concentrations of vancomycin

41、inhibition rate of e. coli activity圖2.6-4 不同濃度的萬古霉素對大腸桿菌活性的抑制率Fig2.6-5 Different concentrations of cefotaxime sodium inhibition rate of e. coli activity圖2.6-5 不同濃度的頭孢噻肟鈉對大腸桿菌活性的抑制率3 分析和討論3.1 不同保存條件對大腸桿菌活性的影響本文通過考察保存環(huán)境和保存時(shí)間對固定菌體活性的影響確定最佳保存條件。實(shí)驗(yàn)表明：經(jīng)10d的保存周期，GO固定E. coli的活性隨著時(shí)間的延長，其變化幅度逐漸減??；但是隨著保存時(shí)間延長，相

42、對于PBS中保存的固體顆粒，在培養(yǎng)基中保存的具有表面GO結(jié)構(gòu)的石墨顆粒出現(xiàn)了融化的現(xiàn)象，可能是因?yàn)檩d體長時(shí)間放置在有機(jī)液態(tài)環(huán)境中，受到腐蝕所致。所以在進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)或在后續(xù)技術(shù)應(yīng)用開發(fā)時(shí)應(yīng)關(guān)注保存條件對GO固定E. coli的活性和顆粒完整度的整體影響，否則會(huì)造成結(jié)果的不準(zhǔn)確。3.2 大腸桿菌的濃度、培養(yǎng)時(shí)間和普魯士藍(lán)生成量的分析與討論據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，K3Fe(CN)6的濃度過高將會(huì)對細(xì)胞的呼吸產(chǎn)生抑制作用，使細(xì)胞膜受到損傷，所以在使用的時(shí)候應(yīng)控制其濃度此外，K3Fe(CN)6的作用是接受微生物呼吸所產(chǎn)生的電子，需要考慮在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，其用量是否足夠。因此，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)本文選用K3Fe(CN)6的濃度為

43、45mmol L-1。在實(shí)驗(yàn)過程中，直接將同濃度的FeCl3與生成的Fe(CN)64-混合時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的普魯士藍(lán)沉淀。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，控制FeCl3與生成的Fe(CN)64-的濃度為5mmol L-1時(shí)，生成的普魯士藍(lán)才能穩(wěn)定存在，因此需要對培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，降低Fe(CN)64-的濃度后，再添加FeCl3。同時(shí)，不同的培養(yǎng)時(shí)間所產(chǎn)生的Fe(CN)64-的濃度是不一樣的，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，F(xiàn)e(CN)64-的濃度會(huì)逐漸越大。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為1h，F(xiàn)e(CN)64-的濃度較小，當(dāng)加入FeCl3時(shí)，沒有出現(xiàn)明顯的普魯士藍(lán)；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為2h時(shí)，由微生物呼吸作用所轉(zhuǎn)移的電子增多，由此所生成的Fe(CN)

44、64-的濃度也相應(yīng)增大，與FeCl3反應(yīng)所生成的普魯士藍(lán)也比較明顯；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間增加至3h和4h時(shí)，加入FeCl3后溶液顏色明顯加深，甚至出現(xiàn)了普魯士藍(lán)沉淀，因此需要提前稀釋?？梢姡贕O固定E. coli光學(xué)方法的建立還應(yīng)充分考慮培養(yǎng)時(shí)間和生成Fe(CN)64-的生成量，以確定合適的稀釋濃度。經(jīng)微生物呼吸作用產(chǎn)生的K4Fe(CN)6不僅與培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)，還與與E. coli的濃度和活性相關(guān)。本文通過建立吸光度隨E. coli在具有表面GO結(jié)構(gòu)的石墨顆粒上的培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系曲線，獲得以下結(jié)論：第一，在16h之內(nèi)，E. coli的活性隨著時(shí)間的增大而增大；第二，E. coli的活性達(dá)增大至一定的程度

45、后，會(huì)隨著時(shí)間的增大而減小，因?yàn)樘峁┙o菌體的營養(yǎng)物質(zhì)和生長空間有限，同時(shí)營養(yǎng)物的傳導(dǎo)也會(huì)隨著菌體的增加而受到限制；第三，16h可作為E. coli在具有表面GO結(jié)構(gòu)的石墨顆粒上固定的最佳時(shí)間，在此培養(yǎng)時(shí)間下，E. coli出現(xiàn)活性的峰值，以便于通過呼吸作用轉(zhuǎn)移更多的電子，生成更多的Fe(CN)64-，當(dāng)與FeCl3反應(yīng)時(shí)能夠呈現(xiàn)出明顯的普魯士藍(lán)，增加測定的準(zhǔn)確度和靈敏度。4 結(jié)論通過監(jiān)測 Fe(CN)64-濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢，確定電子轉(zhuǎn)移受體K3Fe(CN)6在4h培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)被還原量低于45mmol/L，但加入FeCl3后會(huì)引起沉淀，因此應(yīng)對培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，保證Fe(CN)64-的濃

46、度低于5mmol/L；通過考察吸光度值隨GO固定E. coli的反應(yīng)時(shí)間的變化趨勢，確定以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)16h時(shí)，經(jīng)GO固定的E. coli的活性最優(yōu)；通過考察GO固定E. coli顆粒分別在LB培養(yǎng)基和PBS溶液中存儲(chǔ)周期和活性關(guān)系，確定LB培養(yǎng)基更適合保存固定化E. coli，且隨著存儲(chǔ)周期的延長，E. coli的活性損失逐漸趨于平穩(wěn)。將新鮮制備的GO固定E. coli顆粒用于檢測阿米卡星，慶大霉素、左氧氟沙星、萬古霉素和頭孢噻肟鈉5種抗生素，只有萬古霉素對菌株的活性抑制較弱，其余種可用于革蘭氏陰性菌抗生素均表現(xiàn)出較好的抑菌作用?？梢?，本文所研究的基于GO固定E. coli的光學(xué)技術(shù)可有效

47、區(qū)分抗生素的靶向作用微生物和有效性；營養(yǎng)物質(zhì)對E. coli活性的保持尤其重要，為了確保技術(shù)的靈敏度和應(yīng)用性，菌體儲(chǔ)存過程中應(yīng)注意營養(yǎng)物質(zhì)的供給。因此，GO固定E. coli的光學(xué)技術(shù)在抗生素有效性檢測實(shí)時(shí)監(jiān)測和檢測領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用價(jià)值。參考文獻(xiàn)1 曾婷, 郝麗, 謝逸欣, 等. PCR技術(shù)在細(xì)菌耐藥性中的應(yīng)用研究J. 醫(yī)藥論壇雜志, 2013, 34(1): 69.2 Patel PA, Robicsek A, Grayes A, et al. Evaluation of Multiple Real-Time PCR Tests on Nasal Samples in a Large MR

48、SA Surveillance ProgramJ. American Journal of Clinical Pathology,2015,143(5):652-658.,3 Zee AVD, Roorda L, Bosman G, et al. Multi-centre evaluation of real-time multiplex PCR for detection of carbapenemase genes OXA-48,VIM,IMP,NDM and KPCJ.Bmc Infectious Diseases, 2014, 14(2): 304-313.4 戰(zhàn)旗, 王蕊, 李爽,

49、等. 中藥抗菌作用研究現(xiàn)狀J. 山東中醫(yī)雜志, 2014(8).5 楊露, 謝曉芳, 胡榮. 麻黃附子細(xì)辛湯聯(lián)合抗生素的體外抗大腸埃希菌作用研究J. 中藥與臨床, 2015, 11(3): 35-38.6 卞永娟. 呼吸道感染細(xì)菌培養(yǎng)及藥物敏感性試驗(yàn)J. 中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用, 2015, 9(22): 254-255.7 孔祥菊. 某院2013年臨床分離細(xì)菌體外藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果分析J. 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床, 2015(5): 62-64.8 李昌勤, 趙琳, 楊宇婷, 等. 丹參生品及不同炮制品的體外抗菌活性研究J. 中成藥. 2011, 33(11): 1948-1951.9 張赟彬, 郭媛. 三

50、種方法提取八角茴香精油及其抗菌活性研究J. 德州學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 28(2): 1-8.10 Lu-Ming LI, Yuan XY, Wang MY, et al. The integron-gene cassette system and the mechanism of bacterial drug resistance: research progressJ. Chinese Journal of Microecology, 2014, 26(2): 246-248.致 謝在忙碌而充實(shí)的本科實(shí)習(xí)生活快要結(jié)束的時(shí)候，首先我要把我最誠摯的謝意和最崇高的敬意送給我的實(shí)習(xí)老師劉暢副教授，

51、感謝劉老師的辛勤耕耘，你的努力讓我收獲到了知識的果實(shí)，讓我明白了知識的重量，讓我擁有了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲袘B(tài)度。在實(shí)驗(yàn)的過程中也經(jīng)歷過失敗，但劉老師深刻而細(xì)致的教導(dǎo)讓我在不斷探索中最終獲得了實(shí)驗(yàn)的成功，完成了本科實(shí)習(xí)論文。其實(shí)這不僅僅是一份簡單的本科實(shí)習(xí)論文，更重要的是包含了劉老師誨人不倦的指導(dǎo)，所以再一次誠摯的感謝劉老師。感謝我的家人們在我本科實(shí)習(xí)階段給與我的鼓勵(lì),關(guān)心和照顧。感謝爸爸媽媽給與我無微不至的關(guān)心與照顧，謝謝你們。感謝我的同學(xué)韓笑、孫悅、在實(shí)習(xí)實(shí)驗(yàn)及論文的寫作中給予我的的熱心幫助！綜述基于微生物固定化技術(shù)的細(xì)菌耐藥性檢測方法的研究1、微生物固定化技術(shù)微生物固定化技術(shù)是20世紀(jì)發(fā)展起來的一項(xiàng)

52、新興技術(shù)，它利用物理或化學(xué)方法將游離微生物如真菌、細(xì)菌等限定在特定的空間內(nèi)，保持生物活性并且可以多次循環(huán)使用。1.1微生物固定化隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，環(huán)境污染問題也變得日益嚴(yán)峻，污染范圍越來越廣，因此有必要發(fā)展更加簡便、實(shí)用、高效且價(jià)廉的環(huán)境污染監(jiān)測和治理的新方法。在此實(shí)際需要的基礎(chǔ)上，就環(huán)境污染中的水污染這一方面開啟了生物處理廢水的研究，并且已發(fā)展成為有效治理水環(huán)境污染的一大熱點(diǎn)。目前固定技術(shù)大致有共價(jià)結(jié)合法、吸附法、包埋法、交聯(lián)法四種。吸附法是一種傳統(tǒng)的微生物固定方法，利用帶電微生物與載體之間靜電的相互作用使微生物細(xì)胞固定。傳統(tǒng)的吸附載體包括活性炭和硅膠等物理吸附法。共價(jià)結(jié)合法是將菌體活化

53、，然后利用固定相載體表面與微生物細(xì)胞的表面功能基團(tuán)（如羥基、酚羥基、咪?基、劉汲、羧基、氨基等）形成的共價(jià)鍵相結(jié)合，從而對細(xì)胞形成固定化。交聯(lián)固定法是利用多功能或雙功能試劑，直接與微生物表面的反應(yīng)基團(tuán)發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，通過形成共價(jià)鍵來固定微生物，其彼此交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化微生物，其結(jié)合力為共價(jià)鍵。常用的交聯(lián)試劑有三羥甲基丙烷等。包埋法是用物理方法將微生物細(xì)胞包埋在水不溶性的載體凝膠聚合物細(xì)孔的網(wǎng)狀空間內(nèi)。它能讓產(chǎn)物更好的擴(kuò)散，可以篩漏出雜質(zhì)，還能阻止細(xì)胞的泄漏與流失。本文所使用的即是包埋法，這種方法的操作對微生物細(xì)胞的生物活性影響相對較小且操作的方法相對簡單，而且其固定微生物細(xì)胞的強(qiáng)度高，所以其在目前的研究中具有非常廣泛的應(yīng)用。3、細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的原因和檢測方