酵母雙雜實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)和注意事項(xiàng)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上酵母雙雜（Yeast two-hybrid）實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)和注意事項(xiàng)一. 酵母雙雜的原理 1989年，Song和Field建立了第一個(gè)基于酵母的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白間相互作用的遺傳系統(tǒng)。很多真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分割開的結(jié)構(gòu)域，即DNA特異結(jié)合域（DNA-binding domain，BD）與轉(zhuǎn)錄激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響。但一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,否則無(wú)法完成激活功能。不同來(lái)源激活因子的BD區(qū)與AD結(jié)合后則特異地激活被BD結(jié)合

2、的基因表達(dá)。基于這個(gè)原理，可將兩個(gè)待測(cè)蛋白分別與這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白，并共表達(dá)于同一個(gè)酵母細(xì)胞內(nèi)。如果兩個(gè)待測(cè)蛋白間能發(fā)生相互作用，就會(huì)通過(guò)待測(cè)蛋白的橋梁作用使AD與BD形成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄激活因子并激活相應(yīng)的報(bào)告基因表達(dá)。通過(guò)對(duì)報(bào)告基因表型的測(cè)定可以很容易地知道待測(cè)蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用。 酵母雙雜交系統(tǒng)由三個(gè)部分組成：(1)與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白(bait)。(2)與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白(prey)。(3)帶有一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因的宿主菌株。常用的報(bào)告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株則具有相應(yīng)的缺陷型。雙雜交質(zhì)

3、粒上分別帶有不同的抗性基因和營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因。這些有利于實(shí)驗(yàn)后期雜交質(zhì)粒的鑒定與分離。根據(jù)目前通用的系統(tǒng)中BD來(lái)源的不同主要分為GAL4系統(tǒng)和LexA系統(tǒng)。后者因其BD來(lái)源于原核生物，在真核生物內(nèi)缺少同源性，因此可以減少假陽(yáng)性的出現(xiàn)。二.所用的載體及相關(guān)信息1. pGBKT7載體的圖譜和相關(guān)信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1147 of the GAL4 DNA bindingdomain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high lev

4、els from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m

5、 ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7載體的圖譜和相關(guān)信息pGADT7-T encodes a fusio

6、n of the SV40 large T-antigen (a.a. 86708) and the GAL4 AD (a.a. 768881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三實(shí)驗(yàn)主要流程 A.需要準(zhǔn)備的藥品和設(shè)備1.兩種酵母菌

7、種(AH109,Y187)2.酵母培養(yǎng)所需的藥品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution單缺-T,-L(clontech公司) 二缺-T/-L (clontech公司) 四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母轉(zhuǎn)化所需的藥品: 10×TE buffer 10×LiAc 40%PEG carrier DNA4.酵母顯色所需要的藥品: x-a-GAL5.其他儀器設(shè)備: 30恒溫培養(yǎng)箱 30搖床. 水浴鍋

8、分光光度計(jì)BDNA-BD和DN-AD fusion protein 載體的分別構(gòu)建。1 純化基因片段。2 用相應(yīng)的酶對(duì)DNA-BD載體進(jìn)行酶切和純化。3 連接酶切片段和載體，轉(zhuǎn)化到E.coli 。4 通過(guò)內(nèi)切酶分析或PCR對(duì)載體進(jìn)行分析鑒定。以上步驟基本同一般載體的構(gòu)建。C. BD自激活作用的檢測(cè)。1.把載體轉(zhuǎn)化到AH109和Y187中。把轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在三種培養(yǎng)基中生長(zhǎng),用空的DNA-BD載體作陰性對(duì)照。SD/-Trp/x-Gal、 SD/-His/-Trp/x-Gal、SD/-Ade/-Trp /x-Gal。 2.分析結(jié)果如果轉(zhuǎn)化克隆是藍(lán)色，在SD/-His/-Trp、 SD/-Ade/-Trp

9、 上可以生長(zhǎng)，說(shuō)明其自身激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄，則不能用做誘餌蛋白。D.融合蛋白毒性的測(cè)試 比較帶有DNA-BD 融合蛋白載體和空的DNA-BD 載體的Y187和AH109的轉(zhuǎn)化子菌系在液體培養(yǎng)中的生長(zhǎng)效率。如果bait菌系生長(zhǎng)速率要明顯慢很多，則此bait蛋白可能有毒性。在SD/-Trp上篩選，如下準(zhǔn)備過(guò)夜培養(yǎng): 挑一個(gè)較大的克?。?-3mm）在50ml SD/-Trp/Kan（20 ug/ml）培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。30°，250-270rpm培養(yǎng)16-24h。檢查培養(yǎng)液的OD600值，它應(yīng)當(dāng)0.8。若小于，則DNA-BD fusion可能有毒性。如果沒有妨礙生長(zhǎng)，則是非毒性的，可以用來(lái)做雙雜

10、交篩選。E.酵母的小規(guī)模轉(zhuǎn)化方法1. 在1ml的YPD培養(yǎng)基中，接種酵母AH109(或Y187)。2. 震蕩，打散細(xì)胞。3. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到20mlYPD中，錐形瓶的規(guī)格為250ml比較合適，較多地空氣有利于酵母生長(zhǎng)。30振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，OD600>1.6 /不大于2.0即可。4. 取合適的菌液至100mlYPD中，使OD600在0.2-0.3之間。250rpm振蕩培養(yǎng)3小時(shí)，直到OD600在0.4-0.6之間。5. 菌液移入50ml離心管中，室溫下1000g,離心5分鐘。6. 去上清，用25ml無(wú)菌水重懸細(xì)胞。7. 室溫下1000g,離心5分鐘。再去上清液，用1.5ml 1×

11、TE/1×LiAc輕輕重懸細(xì)胞，制成感受態(tài)酵母菌。8. 分裝感受態(tài)細(xì)胞，100l為一管。在每管中加入0.1g的carrier DNA和0.1g目的質(zhì)粒。輕輕混合均勻。9. 加入0.6mlPEG/LiAc，高速振蕩10秒鐘。10. 30,250rpm搖床,搖30分鐘。11. 每管加入70l的DMSO,輕輕的混勻,不要?jiǎng)×艺鹗帯?2. 在42水浴鍋中,熱激15分鐘。13. 在冰上冷卻12分鐘。14. 在室溫下.14000rpm高速離心5秒,去上清液。15. 用0.5ml的1×TE buffer懸浮細(xì)胞。16. 以適量的菌液涂平板,在30下,培養(yǎng)2-4天。F.轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算 數(shù)出

12、稀釋平板上的克隆數(shù)目：克隆數(shù)*1000=#轉(zhuǎn)化數(shù)/3ug 載體。預(yù)期結(jié)果：1×106轉(zhuǎn)化數(shù)/3ug 載體。G.酵母質(zhì)粒的抽提1 細(xì)胞沉淀在250µl 抽提液中懸浮2 加入20µl 0.45-0.55mm玻璃珠，重復(fù)懸浮震蕩。3 加入250µl 酚：氯仿，混勻。4 15000g，離心3min。5 取上清，加入3倍體積無(wú)水乙醇，混勻。6 15000g，離心5min。用70%乙醇洗滌沉淀。7 20µl無(wú)菌水溶解。質(zhì)粒抽提液：10 mM Tris-Hcl，1 mM EDTA，200 Mm NaCl，PH8.0四.幾個(gè)重要的問題的說(shuō)明和一些實(shí)驗(yàn)中的心得體

13、會(huì)注意問題一: 載體的構(gòu)建需要考慮到移碼問題。在酵母雙雜中，所用到的蛋白都是融合蛋白，基因本身的起始密碼子ATG是不起作用的,所以特別要考慮到移碼問題。無(wú)論是AD-基因，還是BD-基因，都是如此。在融合蛋白之間可以有一段連接序列，但必須是三的倍數(shù)，確保目的基因在表達(dá)時(shí)不會(huì)移碼。注意問題二：酵母感受態(tài)制備的心得。 酵母感受態(tài)的制備是個(gè)很重要和精細(xì)的過(guò)程。感受態(tài)的狀態(tài)不佳，極大地影響到酵轉(zhuǎn)化的效率。這里有兩點(diǎn)要注意。a.原始菌種接種的量。 在1ml YPD培養(yǎng)基中，接種AH109的克隆時(shí)，大于2-3mm的大克隆，接種一個(gè)；大小在2-3mm之間的克隆，接種2-3個(gè)；小于2mm的克隆，不能用于正常的接

14、種，重新劃板活化之后再行接種。b.酵母轉(zhuǎn)接時(shí)的OD值掌握。 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母菌轉(zhuǎn)接到100ml的YPD中，經(jīng)驗(yàn)量: 1.6OD600 的原菌液，取4ml左右。 2.0OD600 的原菌液，取4ml左右。 OD600 大于2.0， 原菌液就不能使用了，影響活性。注意問題三：PEG濃度的改良。 一般經(jīng)典的酵母操作手冊(cè)上，在酵母轉(zhuǎn)化時(shí)，用到的PEG的濃度都是40%。經(jīng)過(guò)我的多次試驗(yàn)，40%的PEG所得到的轉(zhuǎn)化效率不是最高的，35%的濃度為最好。 其配方改良如下： PEG 50% 8ml 改良為 PEG50% 7ml 10×LiAC 1ml - 10×LiAC 1.5ml 10&#

15、215;TE 1ml 10×TE 1.5ml降低5% PEG濃度可以提高轉(zhuǎn)化效率。注意問題四：轉(zhuǎn)化所用的質(zhì)粒的量。 在酵母轉(zhuǎn)化的時(shí)候，所用質(zhì)粒的濃度和純度都是很重要的指標(biāo)。經(jīng)驗(yàn)濃度為200ng/l以上，純度則是盡可能的高。質(zhì)粒的總量需要在1g 以上。注意問題五：AH109,Y187酵母菌種的保存和使用問題。酵母的菌種長(zhǎng)期不用的保存在-80冰箱中。但經(jīng)常要使用的菌種保存在4冰箱的平板上最好。把克隆長(zhǎng)到3mm大小的酵母菌種平板保存在4冰箱里，要用時(shí)就可以隨時(shí)挑克隆了。但平板的保存時(shí)限為一個(gè)月，每個(gè)月需要重新劃線轉(zhuǎn)移一次平板，以保證其活性。直到酵母相關(guān)實(shí)驗(yàn)全部完成為止。注意問題六：酵母菌落

16、的顏色問題。正常的酵母菌落顏色是純白色的，但經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的酵母常常帶有一定的微紅色。Y187的菌種基本不會(huì)變紅，顏色是正常的。而AH109的菌種中Ade 基因容易突變，從而導(dǎo)致酵母顏色的改變。但微紅色的酵母基本上不影響下一步的操作。AH109經(jīng)過(guò)酵母單轉(zhuǎn)化之后，在平板上會(huì)有微紅色，但共轉(zhuǎn)化之后就沒有紅色了。注意問題七：酵母雙雜Mating的時(shí)間掌握。一般認(rèn)酵母雙雜Mating的時(shí)間為16-24個(gè)小時(shí)。我經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，Mating的時(shí)間上限為28 個(gè)小時(shí)，下限為14個(gè)小時(shí)。以18個(gè)小時(shí)為最佳，低于14個(gè)小時(shí)的Mating是一定失敗的。酵母Mating的時(shí)間，是一個(gè)重要的試驗(yàn)參數(shù)。注意問題八：pCL1，pGBKT7-T和pGBKT7-53的陽(yáng)性對(duì)照的問題。pCL1載體不能用做互作對(duì)照，互作對(duì)照使用BKT7-T和pGBKT7-53。同時(shí)轉(zhuǎn)入后個(gè)載體的酵母可以在相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。注意問題九