褐藻酸裂解酶的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及應(yīng)用

1、褐藻酸裂解酶的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及應(yīng)用Hee Sook Kim，Choul-Gyun Lee and Eun Yeol Lee摘要 褐藻膠是一種線性多糖，由-D-甘露糖醛酸（M）與其差向異構(gòu)體-L-古洛糖醛酸（G）通過(guò)1，4糖苷鍵連接形成不同的結(jié)構(gòu)。褐藻酸裂解酶因其高粘度及凝膠作用可作為一種食品添加劑來(lái)改善食品的質(zhì)地。該酶可以通過(guò)-消除機(jī)制裂解糖苷鍵來(lái)降解褐藻膠，產(chǎn)生一個(gè)具有非還原末端的結(jié)構(gòu)。褐藻寡糖已被發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)以及巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子釋放的作用。褐藻膠可以通過(guò)褐藻酸裂解酶的內(nèi)切及外切作用，降解為含有不飽和鍵的單糖。因此，在不久的將來(lái)，褐藻酸裂解酶有潛力作為生物催化劑，以褐藻膠作為可再生

2、資源生產(chǎn)生化試劑及生物燃料。本文介紹了不同的褐藻酸裂解酶的結(jié)構(gòu)、功能并對(duì)褐藻酸裂解酶的應(yīng)用前景進(jìn)行了討論。關(guān)鍵詞 褐藻膠；褐藻酸裂解酶；褐藻寡糖；不飽和單糖1 介紹褐藻膠是一種線性多糖，其中其中-D-甘露糖醛酸（M）與其差向異構(gòu)體-L-古洛糖醛酸(G)通過(guò)1.4糖苷鍵按照不同順序連接而成，其中-L-古洛糖醛酸是-D-甘露糖醛酸的C5異構(gòu)體。這兩種糖醛酸可以形成聚甘露糖醛酸和聚古洛糖醛酸以及甘露糖醛酸與古洛糖醛酸的隨機(jī)聚合物。褐藻膠在自然界存量豐富，其作為藻類植物的組成成分，占到了藻類植物干重的44%。一些細(xì)菌也可以合成褐藻膠。目前，褐藻膠主要用作食品添加劑來(lái)改變食物的質(zhì)感，也被用作固定細(xì)胞及組

3、織的介質(zhì)。商品級(jí)的褐藻膠可通過(guò)從海洋大型藻類中提取的方式生產(chǎn)。褐藻酸裂解酶通過(guò)-切割糖苷鍵來(lái)降解褐藻膠，生產(chǎn)多種以不飽和糖醛酸作為非還原末端的寡糖以及不飽和糖醛酸單體。多種褐藻酸裂解酶已從海藻、海洋無(wú)脊椎動(dòng)物、海洋及部分土壤微生物中分離得到。褐藻酸裂解酶可以依據(jù)底物特異性分為PM特異性、PG特異性、PMG特異性。對(duì)于相應(yīng)的底物特異性，褐藻酸裂解酶具有內(nèi)切酶與外切酶兩種活性。褐藻寡糖已經(jīng)顯現(xiàn)出許多引人注目的生物活性，它可以促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)以及巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的釋放。因此，褐藻酸裂解酶作為制備功能性褐藻寡糖的生物催化劑引起了人們的注意。褐藻酸裂解酶自身也可作為藥物增強(qiáng)抗生素對(duì)銅綠假單胞菌的殺菌

4、功效來(lái)治療囊胞性纖維癥。不飽和的褐藻寡糖及不飽和糖醛酸單體可由褐藻酸裂解酶催化裂解得到。本文討論了褐藻酸裂解酶及其應(yīng)用，特別是分析與對(duì)比了不同褐藻酸裂解酶的結(jié)構(gòu)和功能，也討論了褐藻膠及褐藻酸裂解酶在未來(lái)的應(yīng)用前景。圖1 褐藻膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)。褐藻膠是一種由-D-甘露糖醛酸與其C5異構(gòu)體-L-古洛糖醛酸通過(guò)-1.4糖苷鍵按照不同順序連接形成的直鏈多糖。2 褐藻膠褐藻膠是一種帶有陰離子的多糖，由PM、PG、PMG組成，pKa 1.53.5。褐藻膠的生物功能主要是作為藻類的結(jié)構(gòu)支撐物，其機(jī)械強(qiáng)度及彈性受到古洛糖醛酸單體含量的影響。隨著古洛糖醛酸單體含量的增加，膠體強(qiáng)度逐漸增大。較低的古洛糖醛酸單體含量會(huì)

5、使褐藻膠更有彈性。商品級(jí)的褐藻膠可從海藻中提取出來(lái)，廣泛用于食品工業(yè)和生物技術(shù)。褐藻膠可作為凝膠劑生產(chǎn)凝膠狀食品，增加冰淇淋的粘度，也可作為化妝品的增稠劑。褐藻膠也可用作減肥食品的配料，因?yàn)樗荒鼙晃改c道消化，不能作為能量來(lái)源。褐藻膠可以結(jié)合二價(jià)陰離子，如鈣離子和鎂離子，產(chǎn)生凝膠作用。由于褐藻膠凝膠能力不受溫度影響并具有生物相容性，因而在許多生物技術(shù)的應(yīng)用中，它被用于固定細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，高含量的古洛糖醛酸可以形成強(qiáng)膠體粘度。溶劑的pH對(duì)凝膠的形成影響顯著，因?yàn)椴煌膒H可改變糖醛酸上離子的排布。褐藻膠在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛。它可作為治療消化不良藥物的制劑輔料，可用于燒傷和創(chuàng)傷的敷料，因?yàn)樗梢韵?/p>

6、較小疼痛。褐藻膠也可用作牙科的矯形材料。褐藻膠還有許多其他方面的應(yīng)用，例如作為螯合劑消除人體內(nèi)的重金屬及放射性毒素。由于不與染料發(fā)生反應(yīng)，它還可以作為增稠劑用于活性染料的染色過(guò)程。3 褐藻酸裂解酶3.1 褐藻酸裂解酶在褐藻膠的生物合成與生物降解中的功能多種褐藻酸裂解酶已從海洋交足類生物、褐藻、小球藻病毒、海洋及土壤微生物中發(fā)現(xiàn)并被克隆和表征。褐藻酸裂解酶在不合成褐藻膠與合成褐藻膠的生物中都被發(fā)現(xiàn)，在不合成褐藻膠的生物中，褐藻酸裂解酶在同化褐藻膠作為碳源的過(guò)程中起著重要作用。海洋及土壤微生物具有多于一種的褐藻酸裂解酶來(lái)降解結(jié)構(gòu)復(fù)雜的褐藻膠。一些海洋動(dòng)物在其消化道內(nèi)也存在褐藻酸裂解酶來(lái)降解褐藻膠并

7、將其作為碳源。在能夠合成褐藻膠的微生物中，褐藻酸裂解酶在褐藻膠的生物合成與生物降解中都起著重要作用。對(duì)于產(chǎn)酶微生物的遺傳研究已經(jīng)揭示了褐藻酸裂解酶的基因位于其他褐藻膠合成酶基因的片段上，在褐藻膠的生物合成中，褐藻酸裂解酶似乎對(duì)于控制聚合物長(zhǎng)度與優(yōu)化聚合反應(yīng)起到一定作用。在合成褐藻膠的銅綠假單胞菌的粘膜上，褐藻酸裂解酶可以通過(guò)降解生物膜上的褐藻膠來(lái)促進(jìn)細(xì)菌的擴(kuò)散。固氮菌產(chǎn)生的褐藻酸裂解酶可能與其孢子萌發(fā)有關(guān)。在細(xì)胞休眠期，凝膠形式的褐藻膠是胞囊外被保護(hù)層的一部分，在萌發(fā)期，褐藻酸裂解酶對(duì)于胞囊的破壞是必要的。一些微生物可以使用褐藻膠作為碳源。此條件下，微生物可依靠褐藻酸裂解酶對(duì)-1.4糖苷鍵的裂

8、解作用降解褐藻膠，產(chǎn)生具有非還原末端結(jié)構(gòu)的寡糖。褐藻膠聚合物通過(guò)內(nèi)切酶的作用降解為具有非還原末端的糖醛酸，內(nèi)切型褐藻酸裂解酶具有降解PM、PG、PMG的多種活性。褐藻寡糖可以通過(guò)外切型褐藻酸裂解酶的作用進(jìn)一步降解為單糖。這些單糖可在無(wú)酶催化的條件下生產(chǎn)DEH，然后轉(zhuǎn)化為KDG，通過(guò)依賴NADPH的KDE轉(zhuǎn)化酶的作用，將KDG轉(zhuǎn)化為KDPG。之后，KDPG被KDPG醛縮酶分解為丙酮酸與3-磷酸甘油醛這一糖酵解途徑的重要中間體。一般來(lái)講，依靠褐藻膠生長(zhǎng)的微生物使用胞外的褐藻酸裂解酶降解褐藻膠，然后將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，并通過(guò)細(xì)胞代謝來(lái)吸收它們。例如鞘脂單胞菌等一些細(xì)菌可使用細(xì)胞周質(zhì)中的ABC超

9、家族轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)直接吸收褐藻膠聚合物。負(fù)責(zé)吸收褐藻膠的外膜蛋白被證實(shí)在其表面有一個(gè)凹陷。整個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括三個(gè)部分，在細(xì)胞表面一個(gè)直徑0.020.1m的凹陷，細(xì)胞質(zhì)間隙的褐藻膠結(jié)合蛋白以及在細(xì)胞膜上的ABC超家族轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。當(dāng)褐藻膠被運(yùn)轉(zhuǎn)至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)之后，它被胞漿中的內(nèi)切型與外切型褐藻膠裂解酶降解，在鞘脂單胞菌中，多種褐藻酸裂解酶存在于胞漿中。而對(duì)于棕色固氮菌，褐藻酸裂解酶存在于細(xì)胞周質(zhì)表面。圖2 褐藻膠被內(nèi)切型與外切型褐藻酸裂解酶通過(guò)-消除機(jī)制降解。不飽和單糖可由外切型褐藻酸裂解酶降解褐藻膠或褐藻寡糖的方式得到，這種單糖可在沒有酶催化的條件下轉(zhuǎn)化為4-脫氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸。箭頭所指為相應(yīng)的褐

10、藻酸裂解酶的酶切位點(diǎn)。3.2褐藻酸裂解酶的結(jié)構(gòu)褐藻酸裂解酶是多糖裂解酶系的一種，多糖裂解酶系可歸類為22個(gè)家族，依據(jù)對(duì)其初級(jí)結(jié)構(gòu)疏水區(qū)域的分析，褐藻酸裂解酶屬于七個(gè)家族，PL-5、PL-6、PL-7、PL-14、PL-15、PL-17、PL-18。大多數(shù)細(xì)菌所產(chǎn)的褐藻酸裂解酶屬于PL-5與PL-7家族，兩種外切型褐藻酸裂解酶A1-IV （來(lái)源于鞘脂單胞菌） 以及Atu3025（來(lái)源于根瘤農(nóng)桿菌）被歸類為PL-15家族。依據(jù)基因克隆及測(cè)序分析，PL-5與PL-7序列的相似性得到了對(duì)比。基因序列的對(duì)比揭示了PL-5與PL-7序列的相似性相對(duì)較低。然而，精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、酪氨酸等對(duì)

11、催化作用的有重要影響的氨基酸在酶的活性中心大量存在。A1-、A1-、ALY-1、Atu3025的三維結(jié)構(gòu)已通過(guò)X射線衍射晶體分析技術(shù)探明。來(lái)源于鞘脂單胞菌的A1-酶包含351個(gè)氨基酸殘基。該酶具有PG特異性。在研究該酶的三維結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)幾乎全部有-螺旋以及一個(gè)位于（-）6-管道部位的通道式縫隙組成。這種（-）6-管道結(jié)構(gòu)的特征與在葡萄糖淀粉酶和纖維素酶中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)類似。與A1-相比，PL-7家族的褐藻酸裂解酶含有大量的-串聯(lián)并在-折疊區(qū)有一個(gè)深的縫隙。這種折疊與-葡聚糖酶中的類似。來(lái)源于鞘脂單胞菌的A1-被進(jìn)一步進(jìn)行了突變分析，與ALY-1相似，A1-也有大量的夾層狀的-折疊，這些氫鍵網(wǎng)

12、絡(luò)與在活性中心的三個(gè)毗連的-折疊形成的結(jié)合部分已被證明對(duì)控制酶的活性具有重要作用。通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在褐藻酸裂解酶A1-、A1-、ALY-1的催化位點(diǎn)上，酪氨酸、組氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺、精氨酸的含量很高。據(jù)推測(cè)，這些氨基酸形成了酶的催化活性中心。最近，PL-15家族的外切型褐藻酸裂解酶Atu3025的結(jié)構(gòu)已被查明。Atu3025可從分子外部降解褐藻膠、低聚糖形成不飽和單糖。Atu3025含有一個(gè)（-）6-管狀的結(jié)構(gòu)中心，反向平行的-折疊層作為其基本支架。一個(gè)長(zhǎng)度較短的-螺旋位于管道結(jié)構(gòu)上。在中心結(jié)構(gòu)域與C端結(jié)構(gòu)域連接處的一個(gè)構(gòu)象變化被證明對(duì)于外切降解作用非常重要。圖3 PL-5與PL-

13、7褐藻酸裂解酶的多序列對(duì)比。紅框表示位于活性位點(diǎn)的重要氨基酸，如精氨酸、天冬酰胺/谷氨酰胺、組氨酸和酪氨酸。圖4 來(lái)源于銅綠假單胞菌的褐藻酸裂解酶A1-III、A1-II的三維結(jié)構(gòu)以及與三糖底物結(jié)合的活性位點(diǎn)。A1-III結(jié)構(gòu)幾乎全部有-螺旋以及一個(gè)位于（-）6-管道部位的通道式縫隙組成。但是A1-II含有大量的-串聯(lián)并在夾層狀的-折疊區(qū)有一個(gè)深的縫隙。兩者的活性中心都含有酪氨酸、組氨酸、天冬酰胺及精氨酸。其蛋白結(jié)構(gòu)已被Phyton Molecular Viewer顯示出來(lái)。3.3 褐藻酸裂解酶的性質(zhì)褐藻酸裂解酶具有不同的底物特異性，其底物特異性被酶分子的氨基酸序列以及底物中單糖的排布所決定。

14、褐藻膠有四種不同的類型連接構(gòu)成，分別是M-M、M-G、G-G、G-M，每種連接方式都可具有不同的長(zhǎng)度。褐藻酸裂解酶可以根據(jù)他們的底物特異性分類。PG特異性的裂解酶優(yōu)先降解PG結(jié)構(gòu)，而PM特異性的裂解酶優(yōu)先降解PM結(jié)構(gòu)。一些褐藻酸裂解酶已被證實(shí)具有PMG特異性。迄今為止，大多數(shù)的褐藻酸裂解酶表現(xiàn)出PM特異性。雖然褐藻酸裂解酶可被歸類為PG裂解酶、PM裂解酶、PMG裂解酶，但他們通常對(duì)另一種糖醛酸聚合物表現(xiàn)出較低的活性。一些褐藻酸裂解酶表現(xiàn)出PM、PG雙重活性。從酶切方式上來(lái)看，褐藻酸裂解酶可分為內(nèi)切型酶與外切型酶。多數(shù)褐藻酸裂解酶具有內(nèi)切酶活性。最近，一些外切型褐藻酸裂解酶的例子已被報(bào)道并表征。

15、各類褐藻酸裂解酶的催化中心已被分析，一種可能的催化機(jī)理也已被提出。第一步，羧基上的負(fù)電荷被精氨酸與天冬酰胺所中和。接下來(lái)，C5上的質(zhì)子經(jīng)氨基酸殘基通過(guò)自由基催化機(jī)制分離出來(lái)。結(jié)果是氨基酸增加了二價(jià)羧基鹽陰離子的穩(wěn)定性。最后一步，酪氨酸提供的一個(gè)質(zhì)子在C4與C5之間形成雙鍵，糖苷鍵斷裂，形成具有非還原末端的寡糖鏈中的不飽和單糖。為使人理解并依據(jù)特定的寡糖來(lái)控制褐藻酸裂解酶的催化方式，更詳細(xì)的作用機(jī)制還需被說(shuō)明。圖5 來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的PL-15家族褐藻酸裂解酶H531A突變體的三維結(jié)構(gòu)以及結(jié)合于三糖底物的活性位點(diǎn)。中心處的/-管狀結(jié)構(gòu)以及反向平行的-薄層構(gòu)成了Atu3025的骨架結(jié)構(gòu)。圖6 內(nèi)切

16、型與外切型褐藻酸裂解酶的活性位點(diǎn)。A1-III與ALY-1催化活性位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸（A）。通過(guò)使用RasMol軟件，可看出A1-III的精氨酸239、天冬酰胺191、組氨酸192、酪氨酸246與結(jié)合在三糖底物上的ALY-1的精氨酸72、谷氨酰胺117、組氨酸119及酪氨酸195相互疊加。(B)Atu3025的催化活性位點(diǎn)。顯示了有催化作用的重要氨基酸圍繞著與三糖底物結(jié)合的不飽和非還原末端。通過(guò)CPK染色（碳原子和氧原子分別被染成灰色和紅色），底物分子可顯現(xiàn)出來(lái)。4 褐藻酸裂解酶的應(yīng)用前景4.1 制備功能性褐藻寡糖包含37個(gè)單體直至2025個(gè)單體的褐藻膠降解產(chǎn)物通常被叫做褐藻寡糖。據(jù)報(bào)道，褐藻酸

17、裂解酶降解褐藻膠生成的褐藻寡糖具有多種生物活性。褐藻寡糖已在體內(nèi)表現(xiàn)出益生素的特性。當(dāng)被飼喂不飽和的褐藻寡糖之后，大鼠體內(nèi)的雙歧桿菌與乳桿菌的比例從2.5增加到了5。由鏈霉菌產(chǎn)生的PG特異性褐藻酸裂解酶可促進(jìn)香蕉海棠離體新梢、紅莧菜及其他植物的生長(zhǎng)。褐藻寡糖具有多種生物活性，可用于醫(yī)療與生物技術(shù)。褐藻寡糖可以促進(jìn)人巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子釋放，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移。被注射了褐藻寡糖的小鼠，其粒細(xì)胞集落刺激因子數(shù)目增加，聚合度為39的寡糖可以增加巨噬細(xì)胞TNF-的表達(dá)量，其表達(dá)量為注射褐藻膠的10倍。聚合度為7和8的褐藻寡糖混合物表現(xiàn)出增加免疫細(xì)胞ROS表達(dá)量的效果。對(duì)褐藻寡糖

18、生物活性的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其活性大小與其組成、分子大小以及寡糖鏈的結(jié)構(gòu)有關(guān)。褐藻寡糖的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步闡釋。4.2 褐藻酸裂解酶的醫(yī)學(xué)應(yīng)用細(xì)胞膜胞外多糖是一種對(duì)引起肺部感染的致病菌具有重要?dú)⒕πУ囊蜃印Ｓ摄~綠假單胞菌合成的微生物褐藻膠，甘露糖醛酸殘基上C2或C3被-乙酰化。這種-乙?；沟迷擃惡衷迥z不易被褐藻酸裂解酶降解。因此銅綠假單胞菌可抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬與抗生素的作用。在呼吸道中，褐藻酸裂解酶可增加抗生素的功效，因?yàn)楹衷逅崃呀饷缚上~綠假單胞菌胞外的褐藻膠。最近，褐藻酸裂解酶配合抗生素對(duì)囊胞性纖維癥的潛在作用已被研究。當(dāng)褐藻酸裂解酶與慶大霉素等抗生素合用時(shí)，對(duì)于呼吸道中產(chǎn)黏蛋白的銅綠假單胞菌的殺菌效果有所增強(qiáng)。因此，如果褐藻酸裂解酶的抗原性被降低，它有可能成