鳥嘌呤論文MGMT與腫瘤的預見性化療

1、鳥嘌呤論文|MGMT與腫瘤的預見性化療    </b>                           來源:免費論文網                2006-11-16 10:44:00 網友評論  條       字體

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3、60;                                                                    

4、60;         1 F2 q; Y! U7 4 r8 </h1>                      作者;章?lián)P培，鮑國強，任會明，季守平6 X) n4 W  X' T) Q O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine DNA-transferase，MGMT)，是細胞修復DNA損傷的一種酶，這種酶又被稱為O6-烷基鳥嘌

5、呤DNA烷基轉移酶(AGAT)。顧名思義，此酶可以修復由各種烷化劑(alkylating agents)造成的細胞DNA烷基化損傷，特別是DNA分子中鳥嘌呤第6位氧原子上的甲基乃至烷基化損傷。根據(jù)MGMT基因及其表達水平的不同，將細胞特別是腫瘤細胞分成Mer和Mer兩種類型：Mer對烷化劑耐藥，Mer對烷化劑敏感，即細胞中的MGMT水平決定了細胞對烷化劑的耐藥程度；接著家集中精力如何克服Mer細胞耐藥性的，發(fā)現(xiàn)O6-BG可以有效克服Mer細胞對烷化劑耐藥性。這些研究為開展甲基轉移酶MGMT與腫瘤預見性、個體化奠定了基礎。$   h# s% m& N5 B. i9 J

6、9 v    " d( N) h. J9 z    1  MGMT與腫瘤預見性、個體化治療0 X% q6 a3 '( B    . R2 F, X3 |) V) ( F% T    化療是治療腫瘤的有效手段之一?；熜Ч闹饕獑栴}是克服腫瘤對藥物的耐藥性。因此在化療之前，預先判斷患者對藥物是否耐藥是實施腫瘤預見性、個體化化療的前提。烷化劑類化療藥物占國產的化療藥物的1/4，這類藥物的作用機制明確，廣泛用于治療腦、頭頸、肝、食管、肺、泌尿、生殖、血液等惡性腫瘤。烷化劑藥物主要攻擊

7、細胞的DNA，造成DNA烷基化損傷，進而形成DNA交聯(lián)，導致細胞死亡。在12種DNA烷化損傷中，以O6-甲基鳥嘌呤DNA的損傷威脅最大，是引起細胞致死的重要原因。報道細胞內的O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶可使DNA烷基化特別是甲基化的損傷得到修復，是細胞對烷化劑藥物產生耐藥性的根本原因13。如果能夠建立檢測腫瘤細胞中MGMT的，就可以依據(jù)MGMT酶活性或酶蛋白水平的高低，合理使用烷化劑類藥物：即對MGMT蛋白水平低的腫瘤直接使用烷化劑化療，而對MGMT蛋白水平高的耐藥的腫瘤，設法降低其MGMT蛋白水平，破壞其耐藥的分子基礎，然后使用烷化劑治療。人腫瘤細胞中MGMT是如何分布的、腫瘤患者MGM

8、T的分布有什么、能否通過動物實驗驗證MGMT蛋白水平高低與對藥物耐藥或敏感的相關性、能否研制出MGMT診斷試劑盒、能否研制出更有效的烷化劑類治療藥物嘧啶亞硝脲(ACNU，尼莫斯汀)、能否研制出克服腫瘤細胞對烷化劑特別是對亞硝脲耐藥的藥物，如這些問題得到解決，就可以形成以腫瘤病人MGMT為依據(jù)、以調節(jié)MGMT為手段，對MGMT蛋白水平不同的病人，實施不同的使用烷化劑治療的方案，實現(xiàn)預見性、個體化化療。0 & m* '0 6 R7 ) B7 W  R0 h    8 ?- a) J  V5 c4 # u% y7 b# Z&

9、amp; A0 ?    自1987年始，歷經14年，我們先后進行了20株中國人腫瘤細胞系MGMT酶活性與對烷化劑亞硝脲耐藥性的分析、裸鼠治療實驗、MGMT基因結構與轉錄、MGMT基因轉導對耐藥性的影響、初步的臨床治療實驗等，率先提出了分析甲基轉移酶蛋白水平，進行腫瘤預見性、個體化化療的方案，并研制出國家一類新藥甲基轉移酶檢測試劑盒，研制出相應的治療藥物嘧啶亞硝脲(尼莫斯汀)和克服耐藥性的藥物鏈脲菌素(鏈佐星)，實現(xiàn)了與此方案相關的藥物全部配套并國產化，為推行以分析腫瘤病人MGMT為依據(jù)，以調節(jié)MGMT為手段，對MGMT蛋白水平不同的病人，實施不同的使用烷化劑治療的方案，奠

10、定了基礎。% s4 U" C: X; H; Q& V# J    $ p3 s& s6 d* f    我們收集和培養(yǎng)了20株中國人腫瘤細胞，包括肝癌4株、肺癌4株、鼻咽癌2株、腦瘤2株、胃癌2株、惡性黑色素瘤、直腸癌、舌癌、乳腺癌、食管癌和宮頸癌各1株，以國際公認的HeLa S3(Mer+型)和HeLa MR(Mer-型)細胞為對照，測定了它們的MGMT酶活性，及烷化劑ACNU和BCNU處理后的細胞存活率。實驗證明20株中國人腫瘤細胞對烷化劑亞硝脲的敏感性呈3種類型：第一類敏感型，如SHG-44腦惡性膠質瘤細胞；第二類抗性型，

11、如BGC-823胃癌、BEL-7402肝癌和SMMC-7721肝癌細胞；第三類中間型。在20株中國人腫瘤細胞中，MGMT活性低的2株，占10%。這一結果與美國Scudiero報道的MGMT活性低的細胞為20%(19/93)4，日本Ikenaga報道的為15%(6/40)5基本相當。進一步的MGMT酶活性分析揭示，在實驗的20株細胞中，對亞硝脲敏感型的SHG-44和HeLa MR細胞的MGMT酶活性最低；對亞硝脲呈抗性的BGC-823、BEL-7402、SMMC-7721和HeLa S3細胞的酶活性都很高。如果用細胞存活率為10%時所對應的藥物濃度(D10值)作為衡量細胞對藥物敏感性的指標，則細

12、胞D10值與MGMT酶活性之間有很好的線性關系，MGMT酶活性高的細胞對亞硝脲有抗性，MGMT酶活低的細胞對亞硝脲藥物敏感(見圖1)。說明MGMT酶活性高低是決定腫瘤細胞對烷化劑耐藥性的分子基礎。# a. V$ D; d8 i: u9 : h/ e( C    8 u3 l7 t! # d/ B1 ',     為了進一步觀察腫瘤細胞MGMT酶活性與使用烷化劑藥物治療效果的關系，Watatani把MGMT酶活高和酶活低的兩種不同腫瘤細胞植入裸鼠體內，然后使用單功能烷化劑MNNG治療，結果MGMT低的腫瘤明顯治愈，而MGMT高的腫瘤表現(xiàn)出耐藥性6。

13、我們將1×107MGMT低的HeLa MR細胞以及中國人SHG-44腦膠質瘤細胞，相同數(shù)量的MGMT高的HeLa S3和SMMC-7721中國人肝癌細胞接種到裸鼠體內，待成瘤后按每克鼠體重腹腔注射25g烷化劑ACNU的劑量進行治療，每周1次，連續(xù)4周；或將ACNU的劑量提高到50g/次，治療2次。HeLa MR和SHG-44腫瘤移植物消失，繼續(xù)觀察1個月未見復發(fā)，治療效果十分理想。而烷化劑ACNU對MGMT高的HeLa S3和SMMC-7721腫瘤移植物則無治療效果，腫瘤移植物越長越大(見圖2)。光學顯微鏡和顯微鏡觀察證明，從裸鼠體內剝離出的治愈的MGMT低的腫瘤殘存物中，僅能見到明

14、顯壞死的細胞和少量纖維細胞或脂肪細胞。實驗充分說明烷化劑ACNU對MGMT低的腫瘤細胞有很強的殺傷; I6 p- d  A* X , T* Q0 _# # s& S* H& F9 6 I( q4 X" E7 y4 G! _; 圖1  中國人腫瘤細胞MGMT活性與對ACNU敏感性關系9 c" H+ P0 g" + l( N9 x1.HeLa MR/HeLa S3(ACNU 0，對照);2.HeLa MR/HeLa S3(ACNU 25g/g×4);9.HeLa MR/HeLa MR(ACNU 50g/

15、g×2);& U/ Y8 I/ O# V) " n - E% z5 u8 s8 C: f2 f& D' ) t' 5 y, X( Z* d. 圖2  ACNU對人腫瘤移植物的治療效果; B8 N5 W: ; o4 d4 q4 H+ Y; o. (   P5 S, 0 Q    作用，進一步證明腫瘤細胞對烷化劑的耐藥性與MGMT酶活性相關。提示如果能檢測并確定腫瘤細胞中MGMT酶活的高低，就有可能預見烷化劑藥物的治療效果。6 n* ! D% q! O( g. P7 ?/ _7 s

16、60;   0 |$ G* z% q, d, N0 B8 w    另一類常用烷化劑順鉑的治療效果也與腫瘤細胞內的MGMT酶活性相關。文獻報道順鉑可降低MGMT酶活與酶蛋白水平，克服腫瘤細胞對烷化劑氮烯咪胺(DTIC)、替莫唑胺(TMZ)的耐藥性7。MGMT酶可修復順鉑造成的腫瘤細胞染色體SCE，對抗順鉑藥物作用；MGMT酶活高的腫瘤細胞對順鉑耐藥，MGMT酶活低的細胞對順鉑敏感8。更有實驗證明使用順鉑和環(huán)磷酰胺對卵巢癌的治療效果與腫瘤細胞中的MGMT酶活性相關9。環(huán)磷酰胺、順鉑和亞硝脲的實驗結果充分說明細胞的MGMT酶活性，決定了烷化劑藥物對腫瘤的治療效果。8

17、q4 C' U- |2 '1 |8 ' G    5 s. v# F1 T( t! R( O: m% D    不同的腫瘤細胞MGMT酶活性不同，有的高，有的低。腫瘤病人的腫瘤組織中MGMT酶活性是否也存在個體差異呢？我們分析了74例不同類型的腫瘤組織中MGMT酶活性，包括乳腺癌9例，胃癌、小細胞肺癌、腎癌、食管癌和結腸癌各5例，非小細胞肺癌24例，腦瘤14例及惡性黑色素瘤2例。發(fā)現(xiàn)在這些腫瘤組織中MGMT酶活性由高到低的順序為乳腺癌>胃癌>小細胞肺癌>非小細胞肺癌>腎癌>腦瘤>食管癌>結

18、腸癌>惡性黑色素瘤，這種組織分布規(guī)律性與臨床使用烷化劑治療腫瘤的經驗基本吻合，即烷化劑藥物多用于治療酶活性低的腫瘤。同時我們還觀察到即使在同種腫瘤組織中MGMT酶活性也有個體差異。在74例標本中有6例MGMT酶活性極低，包括食管癌3例，肺腺癌、腦膠質母細胞瘤和結腸癌各1例，約占8.1%。這一結果與日本Isowa觀察到21例肝癌中，MGMT低的占9.5%10；意大利Frosina觀察到27例腦瘤中MGMT活性低的占7.4%的結果相當吻合11。不同個體MGMT活性不同，必然對烷化劑的治療效果不同。如果對這些MGMT低的患者使用烷化劑藥物治療，就有可能獲得滿意的療效。而對那些MGMT高的腫瘤患

19、者，如能設法降低其MGMT水平，就有可能克服其對烷化劑的耐藥性，獲得較好的治療效果。對MGMT酶活不同的腫瘤患者，實施不同的化療方案，即個體化治療方案，不僅可以減輕病人的痛苦，而且可以提高化療的水平。- ?$ j6 Q$ B* Y) J( C/ V6 w4 G, s    8 Z" 9 8 s) A( F7 V! p    據(jù)此，我們進一步構建了含人MGMT cDNA和選擇標記neo基因的真核表達載體pSV2MGMT-neo，并利用電穿孔基因轉移技術將其導入MGMT基因表達水平低的HeLa MR腫瘤細胞中，希望觀察導入MGMT cDNA是否可以

20、改變Mer-型腫瘤細胞對烷化劑的耐藥性，經篩選獲得了MGMT cDNA轉染細胞，實驗證明5個轉染細胞克隆中有4個MGMT酶活性和MGMT mRNA表達水平均比轉染前顯著提高，隨之帶來的結果是轉染細胞產生對雙功能烷化劑ACNU和單功能烷化劑MNNG的耐藥性。實驗結果充分證明人MGMT基因表達與腫瘤細胞對烷化劑的耐藥性有直接的關系，MGMT mRNA和MGMT蛋白表達水平的提高是腫瘤細胞對烷化劑藥物產生耐藥性的直接原因。4 y, b" m6 P      6 X+ Z) N' . r1 z0 f; R    2 

21、; 聯(lián)合用藥克服腫瘤細胞對烷化劑的耐藥性4 O2 |$ F, W9 w    4 a7 I7 q$ D( d+ K    以上實驗充分證明MGMT mRNA、MGMT酶蛋白和酶活性的高低決定了腫瘤細胞對烷化劑的耐藥性。MGMT高耐藥，MGMT低敏感。這就提示如果能降低或消耗腫瘤細胞的MGMT酶活性和蛋白水平，就有可能克服腫瘤細胞對烷化劑的耐藥性。我們選用3株Mer+型腫瘤細胞為實驗材料(包括HeLa S3，SMMC-7721和Cc801)，這3株細胞的MGMT活性均較高，因此對ACNU和BCNU烷化劑類藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。我們觀察了使用

22、鏈脲菌素(Streptozotocin，STZ)對Mer+型細胞耐藥性的改變，3株Mer+型腫瘤細胞于37用鏈脲菌素處理1h后，細胞的MGMT活性明顯降低。當STZ的濃度為1.5mmol/L時，可使HeLa S3的MGMT活性從1.10pmol/mg降到0.59pmol/mg；當STZ的濃度為1.0mmol/L時，可使SMMC-7721的MGMT活性由0.77降到0.39；當STZ濃度為0.5mmol/L時，可使Cc801的MGMT活性從0.39降到0.14。這3株細胞MGMT酶活性下降后，細胞對ACNU的耐藥性也隨之降低，D10值的改變：HeLa S3從114g/ml降到68g/ml，SMMC-7721從77g/ml降到47g/ml，Cc801從39g/ml降到23g/ml；如果STZ的濃度提高到3.0mmo