重癥監(jiān)護(hù)病房老年患者耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的基因分析

1、重癥監(jiān)護(hù)病房老年患者耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的基因分析         10-09-09 15:37:00     編輯：studa20                      作者：周俊英 付有榮 郭清蓮【摘要】  目的 為了解重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)老年患者感染耐甲

2、氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的分子流行病學(xué)特點、菌株的變異情況及耐藥性。方法 采用KB法藥敏實驗、SCCmec多重PCR技術(shù)和ERICPCR技術(shù)對13株呼吸道感染老年患者M(jìn)RSA進(jìn)行分析，并運用NTSYSPC2.0對ERICPCR擴增產(chǎn)物結(jié)果進(jìn)行聚類分析。結(jié)果 13株MRSA中，12株鑒定為SCCmecA型，1株鑒定為SCCmec型。13株MRSA的DNA同源性在44%到88%之間，同源性在69%以上可分為3類。結(jié)論 ICU老年患者感染的MRSA主要流行型為SCCmec IA型，但是并不存在聚集性人群感染發(fā)生。 【關(guān)鍵詞】  耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；ERICPCR；多重PCR；

3、基因分型1961年英國報道了世界上第1株MRSA,其后大量不同克隆的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株出現(xiàn)并在全球播散1。MRSA 大多表現(xiàn)為多重耐藥,不僅對內(nèi)酰胺類抗菌藥耐藥,還常對喹諾酮類、氨基苷類和大環(huán)內(nèi)酯類等抗菌藥物耐藥。萬古霉素被認(rèn)為是治療MRSA感染的最后一道防線，但近幾年又發(fā)現(xiàn)了對萬古霉素耐藥的MRSA2。這給臨床治療MRSA感染帶來了很大困難。因此,對MRSA耐藥性及流行病學(xué)研究對于正確治療其引起的感染、防止其播散、及時控制其引起的暴發(fā)流行有重要意義。為此,我們對重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)老年住院患者分離的13株MRSA的分子流行病學(xué)特征及耐藥性進(jìn)行了研究，為臨床防治MRSA

4、提供參考依據(jù)。1  材料與方法1.1  菌株來源 13株金黃色葡萄球菌均為2007年3月本院ICU呼吸感染的60歲以上老年患者。1.2  藥敏試驗 16種藥敏紙片購于北京天壇生物制品生物藥檢定所，采用KB法，結(jié)果判讀采用NCCLS2004年標(biāo)準(zhǔn)。1.3  MRSA檢測 用苯唑西林(每片30 g)、頭孢西丁(每片30 g)對13株金黃色葡萄球菌做藥敏試驗，當(dāng)頭孢西丁抑菌圈直徑19 mm時判斷為苯唑西林耐藥，確定為MRSA；當(dāng)抑菌圈直徑20 mm判斷為苯唑西林敏感，確定為MSSA。并用標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213作質(zhì)

5、控菌株，質(zhì)控范圍為2329 mm。1.4  引物序列 均由北京奧科生物有限公司合成，根據(jù)其合成參數(shù)均稀釋為100 mmol/L濃度，其序列及產(chǎn)物大小見表1。表1  引物序列及產(chǎn)物大?。裕?.5  DNA模板制備 按實驗室常規(guī)的酚/氯仿法提取。1.6  PCR擴增條件與反應(yīng)參數(shù) 總反應(yīng)體系為20 l，其中含DNA模板2 l、MgCl2 25 mmol/L為1.2 l引物ERIC1或ERIC2各為2 l、dNTP(10 mmol/L)1 l、10×PCR緩沖液2 l， DNA聚合酶(5 U/l)0.25 l(DNA聚

6、合酶購自上海生工公司，dNTP購自Promega公司)，無菌水9.3 l，以TE液代模板DNA作空白對照。溫度設(shè)置：94預(yù)變性5 min；94變性1 min、52退火1 min、72延4 min共30個循環(huán)，最后72延伸8 min結(jié)束反應(yīng)。1.7  SCCmec多重PCR 總反應(yīng)體系為20 l，其中含DNA模板為2 l、MgCl225 mmol/L為1.2 l，dNTP (10 mmol/L)1 l、10×PCR緩沖液2 l、DNA聚合酶(5 U/l)為0.5 l(DNA聚合酶購自上海生工公司，dNTP購自Promega公司)，14種引物各為0.5 l、無菌水6.

7、3 l，以TE液代模板DNA作空白對照。溫度設(shè)置：94預(yù)變性4 min；94變性30 s、53退火30 s、72延1 min共30個循環(huán)，最后72延伸8 min結(jié)束反應(yīng)。1.8  擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析 取5 l PCR產(chǎn)物，混合1 l加樣緩沖液，點樣在1.5%瓊脂糖凝膠，電泳液為TBE緩沖液(0.1 mol/L TrisHCl、0.1 mol/L硼酸，0.002 mol/L EDTA， pH8.0)，電壓為8 V/cm，溴芬蘭至膠前端約1.52 cm處停止電泳。電泳完畢，將瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移入含溴化乙錠（EB）的染液中，染色15 min后用凈水沖洗15 min，然后凝膠成像儀紫外燈下觀察并拍照記錄結(jié)果。2  結(jié)  果2.1  紙片擴散法藥敏試驗結(jié)果 13株MRSA對加替沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星、克林霉素、苯唑西林和青霉素耐藥率分別為83.3%、82.8%、80.6%、83.3%、88.2%、77.8%、88.3%、84.5%和100%。較敏感的四環(huán)素為90.4%，未發(fā)現(xiàn)耐替考拉寧和萬古霉素的菌株。2.2  多重PCR擴增結(jié)果PCR擴增結(jié)果  見