質(zhì)譜定量的原則系列講座

1、質(zhì)譜定量的原則系列講座（轉(zhuǎn)自分析測試百科叮當空間）質(zhì)譜定量的原則01-目錄：1質(zhì)譜定量的簡介a) 總離子流b) 選擇離子監(jiān)測（SIM）c) 選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM/MRM）2開發(fā)一個SRM方法3內(nèi)標4PK/LC/MS/MS 藥物代謝動力學(xué)的LC/MS/MS的反相液相色譜的方法開發(fā)5樣品制備6標準和標準曲線的準備a) 做標準曲線的步驟b) 標準曲線的稀釋方案Scheme的舉例c) 標準曲線的運行d) 進行標準品和樣品的隨機化e) 系統(tǒng)運行的實用性f) “QCs”質(zhì)量控制7相關(guān)的PK資源8定量的技巧Tips質(zhì)譜定量的原則02質(zhì)譜定量的簡介和LC/MS監(jiān)測的模式簡介本教程主要用于：使用質(zhì)譜作小分子藥代

2、動力學(xué)分析，即PK/MS。除此之外，這些同樣的原則也可用于生物基質(zhì)中肽和蛋白的定量。傳統(tǒng)上，在使用現(xiàn)代質(zhì)譜定量之前，定量是用HPLC高效液相色譜和UV紫外檢測器實現(xiàn)的。HPLC 藥代動力學(xué)分析建立在保留時間、峰面積和紫外光譜性質(zhì)的基礎(chǔ)上的。HPLC方法的缺點是靈敏度不夠、缺乏特異性。我們已經(jīng)看到一些實例，一個化合物的確已經(jīng)代謝了，然而保留時間和紫外光譜上，母離子和代謝物無法區(qū)分。這種缺少特異性的分析時不時會誤導(dǎo)研究者。所以在藥代動力學(xué)分析中，基于質(zhì)譜的表征現(xiàn)在是一種新型的重要的工具。質(zhì)譜定量中已經(jīng)被廣泛接受的方式是MS/MS定量。這種定量常通過三級四極桿或離子阱質(zhì)譜實現(xiàn)。要求使用MS/MS的原

3、因是：許多化合物有同樣的質(zhì)量。當使用第一個維度即單級質(zhì)譜MS去定量時，也會缺乏特異性，尤其是對于像血液那樣的復(fù)雜的基質(zhì)。第二個維度的MS（即MS/MS）在大多數(shù)情況下，能夠提供唯一的斷裂。合并特異的母離子質(zhì)量和唯一的碎片離子信息，可以選擇性地監(jiān)測被定量的化合物。下面我們將討論獲得和可視化LC/MS數(shù)據(jù)的方法。獲得和可視化LC/MS的數(shù)據(jù)，或稱為：質(zhì)譜數(shù)據(jù)如何在一個LC/MS實驗中表達？典型的方法，質(zhì)譜被設(shè)置為掃描特定的質(zhì)量范圍。在全掃描分析中，質(zhì)量掃描范圍較寬；在選擇離子監(jiān)測SIM時，質(zhì)量掃描范圍較窄。依賴于掃描的類型，一個獨立的質(zhì)量掃描時間可以從10 ms到5秒。在一次LC/MS分析中可獲得

4、許多個掃描。LC/MS數(shù)據(jù)的表示方法為：把每個質(zhì)量掃描的離子流信息疊加，畫出隨時間變化的總離子流，橫軸是時間，縱軸是強度?？傠x子流圖非常像HPLC的紫外圖，見圖1。下面我們將討論各種掃描的模式，和這些模式同質(zhì)譜定量的關(guān)系。最常見的LC/MS數(shù)據(jù)模式為：（1）   總離子流圖（2）   選擇離子監(jiān)測（SIM）（3）   選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）或多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）：MRM和SRM本質(zhì)上是同樣的實驗?zāi)Ｊ健?全掃描分析圖1 圖1.gif (2.85 KB)2007-7-17 17:00從藥代分析中得到的全質(zhì)量范圍的總離子流圖（TIC）非常像

5、HPLC UV圖，除了：質(zhì)譜能檢測到更多的化合物，尤其是沒有紫外吸收的化合物。總離子流是一個疊加圖，疊加了每個質(zhì)量掃描的離子流。當一個小分子或小肽流出HPLC色譜柱時，相對強度上升，在TIC圖上出現(xiàn)了一個峰，橫軸是時間。每個質(zhì)量的化合物都被記錄在TIC圖上。找出感興趣的化合物可能是困難的，因為許多化合物有相同的質(zhì)量。化合物的天然質(zhì)量不是鑒定的唯一性數(shù)據(jù)。設(shè)置一個確定的質(zhì)量，可以畫出一個提取離子流圖，但這個圖的強度會比下面介紹的SIM實驗中的強度低。（注意：TIC指的是在一段時間內(nèi)采集的質(zhì)量掃描數(shù)據(jù)，不特指掃描范圍或質(zhì)譜實驗的類型。例如，我們可以在SIM或SRM實驗中獲得TIC圖。然而，為簡單起

6、見，我們將把這些圖稱為SIM和SRM圖，而不是SIM TIC圖。）Selected Ion Monitoring選擇離子監(jiān)測 在選擇離子監(jiān)測中，質(zhì)譜被設(shè)置為掃描一個非常小的質(zhì)量范圍，典型的是一個質(zhì)量數(shù)的寬度。選擇的質(zhì)量寬度越窄，SIM的確定度越高。SIM圖就是從非常窄的質(zhì)量范圍中得到的離子流圖。只有被該質(zhì)量范圍選擇的化合物才會被畫在SIM圖中。圖1和圖2是同一個樣品的譜圖，然而它們看起來很不相同。原因是在SIM圖中，畫的是TIC圖中較少的組分。SIM圖是比TIC圖更確定的圖。圖2圖1.gif (2.85 KB)2007-7-17 17:00然而，SIM圖仍顯示了許多峰，不能唯一地確認我們感興趣

7、的化合物。一個復(fù)雜的樣品（比如血清或血漿）中，這樣的圖是一個典型的SIM圖。許多化合物有同樣的質(zhì)量，在ESI中還有多電荷峰也和我們感興趣的化合物有同樣的m/z值。SIM實驗比全掃描實驗更靈敏，因為質(zhì)譜在一個更小的質(zhì)量范圍上駐留（dwell）更長的時間。Selected Reaction Monitoring選擇反應(yīng)監(jiān)測 （SRM）SRM被大多數(shù)科學(xué)家在質(zhì)譜定量中使用，見圖3。SRM中，可以監(jiān)測一個特征的唯一的碎片離子，在很多非常復(fù)雜的基質(zhì)中進行定量。SRM圖非常簡單，通常只包含一個峰。這種特征性使SRM圖成為靈敏度高且特異性強的理想的定量工具。圖3圖3.gif (2.36 KB)2007-7-

8、17 17:00SRM的過程：選擇一個特征的母離子做MS/MS，在其碎片中選擇一個特征的子離子作為監(jiān)測離子?？梢园裇RM理解為碎片離子的SIM。這種特征性的實驗被成為“transition”（躍遷），可以表示為：母離子 子離子，舉例：534 375質(zhì)譜定量的原則03建立一個SRM Transition 534 375一個定量分析方法應(yīng)該是特征性的、高準確度和高靈敏度的。在不犧牲上述特性的前提下，建立方法應(yīng)該盡可能地快速，質(zhì)譜定量可以很好地滿足這些規(guī)則。在建立一個感興趣的化合物的MS/MS碎片transition的時候，一種優(yōu)化transition的方法是用注射泵進樣（syringe pump）

9、該化合物來優(yōu)化。先在全掃描方式中優(yōu)化母離子信號。因為MS/MS的靈敏度將依賴于化合物在全掃描模式中是否響應(yīng)得好，要盡可能地優(yōu)化全掃描的、非CID響應(yīng)的MS信號。然后優(yōu)化碰撞能CE和碰撞氣體，給出豐度最高的碎片離子。不能使用太大的碰撞能CE，因為太大的CE會丟失穩(wěn)定的、有價值的碎片峰。“我應(yīng)如何優(yōu)化碎片峰？”可以用注射泵進樣化合物，進行MS/MS，挑出一個穩(wěn)定的碎片峰，當改變碰撞能和碰撞氣體參數(shù)時監(jiān)測它的離子流。最后當獲得最大的碎片離子峰響應(yīng)時確定碰撞能和碰撞氣體參數(shù)。現(xiàn)代的三重四極桿質(zhì)譜都可以自動優(yōu)化。圖4.gif (3.32 KB)2007-7-17 17:09從優(yōu)化好的MS/MS譜中，選擇

10、一個合適的碎片峰用于定量監(jiān)測。如圖A所示，母離子質(zhì)量為534，似乎從圖B中可以很容易選擇一個碎片峰做Transition。一個基本考慮是盡可能不要選擇離母離子太近的質(zhì)量。非常常見的，是化合物的失水峰或失氨（ammonia）峰，例如：53451717。我們應(yīng)盡可能不要選擇失水峰或失氨（ammonia）峰做SRM，因為這會導(dǎo)致一個不是很特異的transition。這里，Transition 534 375是一個好的選擇。另外要注意的是：要選擇一個穩(wěn)定的峰。當直接進樣化合物時，被選擇做Transition的峰必須每次掃描響應(yīng)都一致。提示：當優(yōu)化MS條件時，最好能模擬實際做樣的條件。例如：實際做樣時色

11、譜流速是400 ul/min，化合物在30%有機相時流出，用注射泵進樣優(yōu)化MS條件時最好模擬這個條件，即設(shè)置HPLC流速為400 ul/min，30%有機相；然后用三通注入化合物。同時，第一次優(yōu)化實驗時，我們可以選擇60/60的梯度，去表征化合物的疏水性，從而得知它在C18反相柱上的色譜行為。如果你對所有的化合物都按這樣的方法實驗，你就可以建立一個洗脫數(shù)據(jù)庫，可以作為將來實驗的參考。注： 60/60梯度的意思是：梯度從近100% 水相開始，在60分鐘內(nèi)到達60%有機相。質(zhì)譜定量的原則04內(nèi)標 在做MS定量時應(yīng)該使用內(nèi)標。選擇一個合適的內(nèi)標，將能減少因為樣品提取、HPLC進樣和離子化的多樣性造成

12、的差異。在復(fù)雜基質(zhì)的分析中，在SRM積分圖上，在標準曲線的低端，常會見到：兩個不同的濃度水平，會給出近乎一致的響應(yīng)。只有當使用一種內(nèi)標時，這兩個點才能被區(qū)分。一些研究者試圖在實驗中不用內(nèi)標去做標準曲線，但成功率不高。我們在標準曲線上每個濃度水平都重復(fù)進樣3次。沒有內(nèi)標的情況下，重現(xiàn)性RSD常常會高于20%；而當使用內(nèi)標時，%RSD能降低到近2%。我要如何選擇一個內(nèi)標?最好的內(nèi)標是待定量的化合物的同位素內(nèi)標。同位素標記的內(nèi)標將和待測物有相似的回收率、ESI離子化響應(yīng)，和相似的色譜保留時間。如果你運行的不是臨床藥代動力學(xué)定量，可能很難判斷上述說法，因為特殊的合成一個同位素標記的內(nèi)標，是非常昂貴和耗

13、時的。通常，如果你和一個醫(yī)學(xué)的化學(xué)家工作，他們會有一個化合物相似物庫，可以被用作內(nèi)標。這些類似物，在化合物合成中被測試，和該化合物性質(zhì)相似可以被用戶定量內(nèi)標，而且更重要的是，這些類似物和該化合物的母離子質(zhì)量有微小的差異。盡量不要使用去甲基化（14）或者是氧化的（16）的類似物作內(nèi)標，因為待測化合物的母離子常會發(fā)生同樣的代謝。常見的做內(nèi)標的類似物是氯代的化合物。氯代的化合物類似物會和待測化合物有相似的色譜保留時間，這是內(nèi)標的一個重要特性。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)內(nèi)標物的一個最重要的特性是它和待測化合物共流出。我該如何使用內(nèi)標？首先，內(nèi)標添加需在樣品測試方法的開始階段，典型的，應(yīng)在血漿crash或固相萃取之前

14、。內(nèi)標應(yīng)用同一濃度水平添加（包括標樣）。內(nèi)標應(yīng)給出可靠的質(zhì)譜響應(yīng)。應(yīng)該注意的是：內(nèi)標的量應(yīng)添加得合適，應(yīng)高于定量限，但不能過高，因為過高的內(nèi)標響應(yīng)會抑制被分析物的離子化?！拔覒?yīng)該添加多少量的內(nèi)標？”這是一個重要的問題。通過做一些試分析：早、中、晚的時間點，也許一個或兩個標準點，你應(yīng)該知道你的樣品中化合物的大概量。這些信息非常有價值，可以幫助建立一個合適的標準曲線，并知道應(yīng)添加多少量的內(nèi)標。舉例來說：如果待定量的樣品濃度范圍是100 fg 25 pg，檢測限是100 fg，你應(yīng)該添加510 pg的內(nèi)標。一個好的經(jīng)驗法則是：內(nèi)標物的量大概是標準工作曲線濃度最高點的1/3。這將給出一個比較不錯的響應(yīng)

15、，并且不會抑制和干擾待測樣品的離子化。見圖1圖1 內(nèi)標的量（內(nèi)標.gif）質(zhì)譜定量的原則05液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用藥代動力學(xué)方法開發(fā)更快就是更好！在每一個藥代動力學(xué)分析中更快就是更好！樣品組/系列包括：重復(fù)的標準品，QC質(zhì)控樣品，和樣品，加起來大概要進行300次分析。如果每個樣品實驗耗時15分鐘，整套分析要75個小時。高要求的實驗（加上質(zhì)譜）總計要超過3天時間。一些該領(lǐng)域的研究者可以只花12分鐘分析一個樣品；而大多數(shù)的PK/MS的實驗室一般很容易做到花34分鐘分析一個樣品。如果對上面同樣的300個樣，4分鐘一個實驗的話，總分析時間可減少到20個小時。所以，每分鐘都是很重要的！在2mm×

16、 3050mm反相短柱上可以獲得快速的梯度和快速的平衡時間。LC/MS的非藥動實驗中，流速一般為200 µl/min.，而在LC/MS的藥動實驗中，流速一般設(shè)為400 1000 µl/min。更快的流速有助于加速洗脫和平衡。下面是典型的LC/MS藥動實驗條件：LC/MS藥動實驗方法：色譜柱：2.1 X 50 mm, 5 µm , 100 Å , C18柱溫： 40流動相：A 為水相（0.1% 甲酸），B為乙睛（0.1%甲酸）流速： 400µl/min梯度： Time(min.)%B0252802.125425Notes：a ) 調(diào)節(jié)初始的B使其

17、適應(yīng)該化合物 b ) 試著減少梯度時間到1分鐘以縮短方法時間 優(yōu)化梯度：當然你要對每個化合物特別的進行方法優(yōu)化。我們推薦創(chuàng)建一個色譜數(shù)據(jù)庫，詳細地記錄實驗室接手的各個化合物的疏水性（可以運行60/60方法完成）。當你需要挑選一個相似疏水性的內(nèi)標時，這樣的色譜數(shù)據(jù)庫將非常有用。在長時間的梯度中，B的起始值一旦明確，那么在縮短時間時，就把B的值降10%。舉例來說，如果B初始值是40%，那么在運行液質(zhì)藥動方法時，起始值%B就是30%。這種方法將確保你的化合物可以留在你的柱子上。優(yōu)化柱子和流動相：在上面舉例的液相條件中，一些化合物有可能響應(yīng)得不好。一些化合物可能要求不同的有機改性試劑或有機相。一般，磷

18、酸鹽不適用于質(zhì)譜。有些人用1020mM低濃度的醋酸銨作A相緩沖鹽。另一些人合并甲醇和乙睛在B相中。如果你的化合物峰形不好，需要改變幾個或者所有的實驗參數(shù)。必須選用合適的柱子去獲得好的回收和好的峰形。幫助提示：1）一個質(zhì)譜實驗室可能要整日忙著做色譜方法開發(fā)，尤其是如果這個實驗室每周要接510個新化合物樣品。在組合化合物和它們的內(nèi)標，進行組合的色譜方法開發(fā)方面我們頗有心得。并不是所有的化合物適用于這種方式，但是這個方法為我們節(jié)省了大量的方法開發(fā)的時間。當我們發(fā)現(xiàn)做6個化合物混合樣的方法開發(fā)時間，和一個化合物的幾乎一樣時，這個在新的組合給藥（cassette dosing）方法開發(fā)中，該方法就變得非

19、常有用。注：cassette dosing 是一種新的給藥方法，稱為盒式給藥法，又稱為組合給藥技術(shù)，由Ber- man等提出，即給動物同時服用幾種藥物，按常規(guī)取樣時間取血，運用 HPLC聯(lián)用技術(shù)進行樣品處理分析。2）加速方法開發(fā)。許多常見化合物如布洛芬已經(jīng)有人建立了方法，檢索一下文獻、互聯(lián)網(wǎng)和USP的出版物，查到這些方法。不要浪費時間從頭開始! 3）組合給藥技術(shù)常常加速化合物篩選過程。許多研究者不愿做組合實驗技術(shù)，是因為害怕藥物-藥物相互作用。一種可取的方式是給藥后合并化合物。合并上述的方法開發(fā)方法，可以為任務(wù)重的實驗室節(jié)省大量的時間。4) HPLC自動進樣器往往是出奇的慢，記得在平衡時間里考

20、慮自動進樣器，因為當自動進樣器工作時，柱子是在初始化（initial）條件下被清洗的，必須在平衡時間里考慮這個時間。你可以從方法里砍掉3060秒的平衡時間。要分秒必爭嘛！從300個樣品分析中，每個砍掉3060秒，就是5個小時啊！質(zhì)譜定量的原則06樣品的制備（適用于液質(zhì)藥動分析的樣品制備）樣品一般在血漿或血清中。離心去除血液里的血細胞獲得血漿。血液凝固后去除固體得到血清樣品。凝固血液清除血液細胞和凝血因子。血清比血漿易于處理，因為凝血因子已經(jīng)被去除。當使用儲存的血漿時，常會發(fā)現(xiàn)蓬蓬的凝塊物，使樣品很難進入吸液管pipette。不管是血清還是血漿，在進入反相柱分析前都要作進一步的處理。下面會討論幾

21、種的方法用以制備可以用作液質(zhì)藥動分析的血漿和血清樣品。血漿破碎（crash）（有時稱蛋白沉降）血漿破碎/蛋白沉降是最常用的方法，因為它一般不要求特殊的儀器。用乙睛或甲醇沉淀去除豐度的白蛋白。一個典型的方法描述如下：前處理血漿蛋白沉淀.jpg (26.75 KB)血漿破碎（crash）/蛋白沉降方法：1）放50?l血漿或血清在0.5毫升管中2）加10?l內(nèi)標3）添加140?l冷(凍)的有機溶劑（乙睛或甲醇）然后渦旋4）冷凍樣品2小時5）稍稍離心樣品，分離出沉淀的蛋白6）取150?l上清液至一干凈管，加150?l液相的A相(水相).在這時，樣品里含的有機相大概為38。如果你的化合物要求更低的有機相

22、，來保留在色譜柱上，應(yīng)增加第6）步添加的水相的量。7）把6）項的樣品，進行HPLC進樣做液質(zhì)聯(lián)用的藥動分析。固相萃?。涸S多人首選固相萃取法SPE。在SPE中，血漿或血清被直接加入一個疏水的固相中，一般是C18小柱。加入后，用有機相淋洗小柱，則感興趣的小分子會被洗脫下來。SPE可以是手動的，也可以是小批量的。手動的SPE制備方法限制了樣品的通量。可以用96孔板做自動化。一些人認為96孔板非常貴，一個96孔板大約為100美元，但是痕量成本時應(yīng)該考慮易用性和最終產(chǎn)品的貢獻。一些人發(fā)現(xiàn)：用于液質(zhì)聯(lián)用藥動分析的最終洗提液（eluant）質(zhì)量更好，反相柱的附著物和質(zhì)譜信號的滾動（roll-off）發(fā)生在較

23、低的速率。液液萃取：必須承認我們在這方面沒有很多經(jīng)驗。這里是我所知道的。液液萃取只工作在那些可以分隔進入有機相的化合物。它可能是一種樣品凈化的有效方法。然后，這種技術(shù)很難自動化。藥代的各種樣品處理藥代的各種樣品處理.jpg (97.48 KB)2007-7-17 23:29這是一個補充的圖，一種列表的方式，介紹各種前處理。 各課題組，都根據(jù)自己的需要選擇方式。 夢想的方法是：簡單的沉淀、離心蛋白法。這時候可能有堵的問題，因為處理非常簡單，也許會堵。所以各個用戶買液質(zhì)的時候會問賣液質(zhì)的銷售一個silly question：你們的儀器是不是可以直接做沉淀蛋白的，而不堵啊？ 問的可愛，答的

24、“精彩”！質(zhì)譜定量的原則07質(zhì)譜藥動定量分析的標準物和創(chuàng)建標準曲線簡介 完整的定量分析依賴于參考標準的質(zhì)量。一種合格的參考標準，應(yīng)能通過（pass）一系列定性參考標準的測試。參考標準的定性測試要設(shè)計為：充分地表征參考標準的質(zhì)量和含量。如果參考標準的含量不對，那么建立在其上的定量分析一定是錯的。然而，當進行“研究性藥動”時，可能沒有足夠的時間去充分地表征化合物，因為很簡單，在一周內(nèi)，實驗室要做三種新化合物。所以，當面臨開發(fā)一種“研究型藥動”方法時，實驗室應(yīng)努力建立一個假定的參考標準，在做整套化合物實驗室保持不變，而且實驗室能夠永久地獲得該假定參考標準，用于日后的參考。這個步驟能確保：每個相對于這

25、個假定的參考標準的藥動實驗?zāi)軌虮粶y量。創(chuàng)建標準曲線的步驟在定量分析中也至關(guān)重要。為了使分析可靠，這個參考標準必須可靠，在創(chuàng)建標準曲線上的每一點時，每一次稱重和取液都必須準確無誤。下面我們介紹，在液質(zhì)藥動定量分析中典型的創(chuàng)建標準曲線的方法。 創(chuàng)建標準曲線 匯集所有可能知道的關(guān)于未知樣品濃度范圍的信息，可以有計劃地繪制標準曲線。以前曾介紹過一個快速的估算方法，早、中、晚的時間點伴隨著低、中、高濃度的標準。鬼峰將允許創(chuàng)建一個更適當?shù)臉藴是€范圍，并會告訴你應(yīng)注入多少量的樣品。這些步驟可以使你免于重復(fù)長時間的開發(fā)。有些時間點可能包含高濃度的目標化合物。這個初步的分析可以告訴你是否稀釋，例如，最早的時間

26、點乘以10倍，讓你建立一個更合適的標準曲線。標準曲線稀釋方法舉例（你用的實際步驟可能與此區(qū)別很大，只把這個例子作為參考）在下表中的稀釋步驟描述了一個3X, (3X50 µl)制備過程，以表達最能模擬未知樣品制備的實際情況。這個表包括了：加入有機溶劑做蛋白沉降。標準樣品的制備和用于分析的注入的體積，應(yīng)該反映未知樣品的分析工作。稱出大約1毫克的參考標準,并重組為一個10 ug/毫升，稱量不到1毫克可能增大稱重誤差的可能性并傳遞誤差。一些疏水化合物可能要求兩步的重組。例如，一種疏水化合物可能不能溶于含水量高的溶液。試著在少量的DMSO中溶解這種化合物，然后在含最低量有機溶劑的溶液（這時化合

27、物是穩(wěn)定和可溶的）中重組。供應(yīng)這些化合物用以評估的藥用化學(xué)家，常常給出你關(guān)于溶解度和穩(wěn)定性的建議。（警告：這種稀釋方法可能會出錯，你必須驗證它。）參考標準濃度=10 µg/毫升（在不含血清的溶液中制備）溶液 A = 1 µg/ml     (100 µl 參考標準 + 900 µl血清) 溶液B = 100 pg/ml (10 µl參考標準 + 990 µl 血清) 溶液 C = 10 pg/ml   (10 µl參考標準 + 9990 µl 血清) 溶液

28、D = 1 pg/ml     (10 µl 溶液 B + 990 µl 血清) 圖.jpg (36.36 KB)2007-7-18 14:13下載標準曲線法 standardcurve.rar (4.23 KB) standardcurve.rar (4.23 KB)下載次數(shù): 492007-7-18 14:11（注意這個稀釋程序可能有錯，你必須驗證它）方法注意：1   在加入有機物沉淀蛋白前，內(nèi)標應(yīng)與樣品充分混合。盡可能地加入低濃度有機相的內(nèi)標，這樣不會引起永久的沉淀。如果可能的話，用在血清中制備的內(nèi)標儲液最好

29、。2   溶液A，B，C和D應(yīng)該在血清中制備，這樣標準曲線的樣品更接近未知的、在基質(zhì)中的實際樣品。3   當創(chuàng)建標準曲線時，應(yīng)避免系列的稀釋。因為如果在第一次稀釋時，如果犯了一個錯誤，那么系列的稀釋將造成錯誤漫步在整個標準曲線上。4   在配置溶液時，不要吸取< L的液體，更小的體積將導(dǎo)致更大的誤差。并且，確保你的移液管是校正過的。m10 5   用于這個步驟的血清總量是12.7 mL。運行標準曲線：由于標準曲線常?？缭饺齻€（濃度）數(shù)量級，通常，標準樣品從低濃度高濃度依次做樣。這個步驟保證不受高濃度標樣的色譜交叉污染。在標準曲線運行完后，要進幾針空白，直到看不到