第五章體內(nèi)藥物分析

1、第五章第五章 體內(nèi)藥物分析體內(nèi)藥物分析 體內(nèi)藥物分析是一門研究生物機(jī)體中藥體內(nèi)藥物分析是一門研究生物機(jī)體中藥物及其代謝物和內(nèi)源性物質(zhì)的質(zhì)與量變化規(guī)律物及其代謝物和內(nèi)源性物質(zhì)的質(zhì)與量變化規(guī)律的分析方法學(xué)的分析方法學(xué) 體內(nèi)藥物分析又被稱為體內(nèi)藥物分析又被稱為 生物醫(yī)藥分析生物醫(yī)藥分析 Biomedical AnalysisBiomedical Analysis 生物藥物分析生物藥物分析 Biopharmaceutical AnalysisBiopharmaceutical Analysis藥物分析的重要藥物分析的重要分支學(xué)科分支學(xué)科研究生物機(jī)體中外源性藥物及其代謝物和內(nèi)源性研究生物機(jī)體中外源性藥物

2、及其代謝物和內(nèi)源性活性物質(zhì)的質(zhì)與量的變化規(guī)律活性物質(zhì)的質(zhì)與量的變化規(guī)律藥物的體內(nèi)研究和治療藥物監(jiān)測(cè)藥物的體內(nèi)研究和治療藥物監(jiān)測(cè)綜合性較強(qiáng)的應(yīng)用學(xué)科綜合性較強(qiáng)的應(yīng)用學(xué)科:分析方法學(xué)分析方法學(xué)為將來(lái)的相關(guān)課程（臨床藥學(xué)、臨床藥理學(xué)、生為將來(lái)的相關(guān)課程（臨床藥學(xué)、臨床藥理學(xué)、生物藥劑學(xué)）學(xué)習(xí)和實(shí)驗(yàn)研究奠定重要的基礎(chǔ)物藥劑學(xué)）學(xué)習(xí)和實(shí)驗(yàn)研究奠定重要的基礎(chǔ)藥物進(jìn)入體內(nèi)后藥物進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝和排泄等動(dòng)力學(xué)過(guò)程經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝和排泄等動(dòng)力學(xué)過(guò)程化學(xué)結(jié)構(gòu)和存在狀態(tài)都可能發(fā)生變化化學(xué)結(jié)構(gòu)和存在狀態(tài)都可能發(fā)生變化在不同個(gè)體中存在差異（個(gè)體差異）在不同個(gè)體中存在差異（個(gè)體差異）進(jìn)而直接影響到藥物在

3、不同個(gè)體中的治療效應(yīng)進(jìn)而直接影響到藥物在不同個(gè)體中的治療效應(yīng)和毒副作用和毒副作用需對(duì)生物體內(nèi)藥物及其代謝物進(jìn)行研究分析需對(duì)生物體內(nèi)藥物及其代謝物進(jìn)行研究分析藥物在人（或動(dòng)物）體內(nèi)的存在形式藥物在人（或動(dòng)物）體內(nèi)的存在形式 游離型游離型: :原形藥物或代謝物原形藥物或代謝物 藥物或其代謝物與葡萄糖醛酸等結(jié)合藥物或其代謝物與葡萄糖醛酸等結(jié)合: :綴合物綴合物 藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合: :結(jié)合物結(jié)合物體內(nèi)藥物分析的任務(wù)體內(nèi)藥物分析的任務(wù) 檢測(cè)人（或動(dòng)物）的體液或組織（生物樣本）檢測(cè)人（或動(dòng)物）的體液或組織（生物樣本）中的藥物或特定代謝物的濃度中的藥物或特定代謝物的濃度 生物樣本的特點(diǎn)生物樣

4、本的特點(diǎn) 1.1.藥物濃度：藥物濃度：低，要求方法靈敏度高低，要求方法靈敏度高 2.2.干擾物質(zhì)：干擾物質(zhì)：多，要求方法專屬性好多，要求方法專屬性好 3.3.樣品量少、不能重復(fù)取樣樣品量少、不能重復(fù)取樣. .生物樣品多數(shù)在特生物樣品多數(shù)在特定條件下采集，無(wú)法再次取樣，且濃度低、變化幅定條件下采集，無(wú)法再次取樣，且濃度低、變化幅度大度大. . 在樣品測(cè)定之前，在樣品測(cè)定之前，進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉悠分苽?，進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉悠分苽?，進(jìn)行分離、純化、濃集、必要時(shí)還需對(duì)待測(cè)組分進(jìn)進(jìn)行分離、純化、濃集、必要時(shí)還需對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行化學(xué)衍生化，然后進(jìn)行測(cè)定行化學(xué)衍生化，然后進(jìn)行測(cè)定 評(píng)價(jià)藥物的安全性（臨床前研究）：動(dòng)物評(píng)價(jià)藥

5、物的安全性（臨床前研究）：動(dòng)物 評(píng)價(jià)藥物的有效性（臨床研究）：人體（健康評(píng)價(jià)藥物的有效性（臨床研究）：人體（健康志愿者或患者）志愿者或患者） 用藥的安全、有效與合理：人體（患者用藥的安全、有效與合理：人體（患者TDM :TDM :治療藥物血濃度監(jiān)測(cè)治療藥物血濃度監(jiān)測(cè) ） 分析方法有分析方法有: : 色譜法色譜法:HPLC,HPCE,GC:HPLC,HPCE,GC 光譜法光譜法: :比色法、紫外比色法、紫外- -可見分光光度法、熒可見分光光度法、熒光分光光度法、原子吸收分光光度法光分光光度法、原子吸收分光光度法 免疫分析法免疫分析法: :放射免疫法放射免疫法RIARIA、酶免疫法、酶免疫法EIA

6、EIA、化學(xué)發(fā)光酶免疫、熒光免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫、熒光免疫分析 聯(lián)用技術(shù)聯(lián)用技術(shù):GC-MS:GC-MS、LC-MSLC-MS、LC-NMRLC-NMR 發(fā)展概況發(fā)展概況 2020世紀(jì)世紀(jì)6060年代年代: :臨床藥理學(xué)與生物藥劑學(xué)建立臨床藥理學(xué)與生物藥劑學(xué)建立 7070年代初年代初: :體內(nèi)藥物分析在國(guó)外開始建立體內(nèi)藥物分析在國(guó)外開始建立 7070年代末年代末: :血藥濃度監(jiān)測(cè)廣泛用于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)廣泛用于臨床 8080年代年代: :體內(nèi)藥物分析學(xué)科雛形基本形成體內(nèi)藥物分析學(xué)科雛形基本形成 國(guó)內(nèi)發(fā)展概況：在國(guó)內(nèi)發(fā)展概況：在7070年代末受到關(guān)注年代末受到關(guān)注19791979年有相關(guān)論文發(fā)

7、表年有相關(guān)論文發(fā)表 19811981年在年在“中國(guó)藥學(xué)會(huì)藥物分析第一次學(xué)術(shù)會(huì)中國(guó)藥學(xué)會(huì)藥物分析第一次學(xué)術(shù)會(huì)議議”大會(huì)上作學(xué)術(shù)報(bào)告，引起了廣泛的關(guān)注和興趣大會(huì)上作學(xué)術(shù)報(bào)告，引起了廣泛的關(guān)注和興趣8080年代中期，許多高等醫(yī)藥院校為本科生、碩士研年代中期，許多高等醫(yī)藥院校為本科生、碩士研究生開設(shè)了體內(nèi)藥物分析必修和選修課程究生開設(shè)了體內(nèi)藥物分析必修和選修課程. . 學(xué)科主要研究問(wèn)題學(xué)科主要研究問(wèn)題 游離型血藥濃度測(cè)定方法研究游離型血藥濃度測(cè)定方法研究 血中游離型藥物濃度血中游離型藥物濃度(F)(F)與總濃度與總濃度(T)(T)的比率的比率(F/T)(F/T)及唾液與血液游離濃度的比率及唾液與血液游

8、離濃度的比率(S/P)(S/P)以及它們以及它們之間的相關(guān)性的研究之間的相關(guān)性的研究 代謝物的監(jiān)測(cè)與研究代謝物的監(jiān)測(cè)與研究 對(duì)映體的監(jiān)測(cè)與研究對(duì)映體的監(jiān)測(cè)與研究 體內(nèi)微量元素的測(cè)定與研究體內(nèi)微量元素的測(cè)定與研究 方便、快捷的樣品制備方法與樣品直接進(jìn)樣分方便、快捷的樣品制備方法與樣品直接進(jìn)樣分析的研究析的研究 分析新方法、新技術(shù)的聯(lián)用研究分析新方法、新技術(shù)的聯(lián)用研究 體內(nèi)藥物分析方法的質(zhì)量控制研究體內(nèi)藥物分析方法的質(zhì)量控制研究第一節(jié)第一節(jié) 常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏一一. 樣品種類，采集與制備樣品種類，采集與制備v 1.1.血樣：血藥濃度一般指血漿（血清中）藥血樣：血藥濃度

9、一般指血漿（血清中）藥物濃度，它可正確反映藥物在作用點(diǎn)的濃度。物濃度，它可正確反映藥物在作用點(diǎn)的濃度。v 藥物在血中分布均勻后取樣：藥物在血中分布均勻后取樣：a.a.動(dòng)物：動(dòng)脈動(dòng)物：動(dòng)脈或心臟，或心臟，b.b.人靜脈或毛細(xì)管采血人靜脈或毛細(xì)管采血. . 血液：血液：a.a.加抗加抗凝劑混合（凝劑混合（EDTA,EDTA,肝素肝素etc),etc),離心離心(3000r/min (3000r/min ，5min)5min)取上清液為取上清液為血漿血漿。b.b.室溫放室溫放0.51h0.51h，3000 3000 r/minr/min離心離心510 min ,510 min ,取上清液為取上清液為

10、血清血清。C.C.全血全血. . 要點(diǎn)：取樣后及時(shí)分離出血漿（清），要點(diǎn)：取樣后及時(shí)分離出血漿（清），隨后進(jìn)行分析，若不能馬上測(cè)定，應(yīng)密塞后隨后進(jìn)行分析，若不能馬上測(cè)定，應(yīng)密塞后置冰箱保存（時(shí)間短：置冰箱保存（時(shí)間短：44，長(zhǎng)：，長(zhǎng)：-20-20) ) 應(yīng)用應(yīng)用: :藥物動(dòng)力學(xué)藥物動(dòng)力學(xué); ;生物利用度生物利用度; ;臨床治臨床治療藥物監(jiān)測(cè)療藥物監(jiān)測(cè)(TDM)(TDM)v 2 2尿液尿液 優(yōu)點(diǎn)：易收集、量大，主要用于藥物劑量回優(yōu)點(diǎn)：易收集、量大，主要用于藥物劑量回收，尿清除率，生物利用度研究，以及藥物代謝收，尿清除率，生物利用度研究，以及藥物代謝研究，一般采集研究，一般采集24h24h尿液，最

11、好立即測(cè)定，否則尿液，最好立即測(cè)定，否則要加防腐劑（要加防腐劑（PhCHPhCH3 3,CHCl,CHCl3 3etcetc）置冰箱保存。）置冰箱保存。 缺點(diǎn)：尿液中藥濃度與血藥濃度相關(guān)性差，缺點(diǎn)：尿液中藥濃度與血藥濃度相關(guān)性差，腎功能不全者不適于取樣腎功能不全者不適于取樣v 33唾液：唾液： 優(yōu)點(diǎn)：樣品易得，采集無(wú)痛，無(wú)危險(xiǎn)。優(yōu)點(diǎn)：樣品易得，采集無(wú)痛，無(wú)危險(xiǎn)。 缺點(diǎn)：一般唾液中藥濃與血藥濃度不吻合，缺點(diǎn)：一般唾液中藥濃與血藥濃度不吻合，易變易變v 4.4.組織：用于藥物體內(nèi)動(dòng)力學(xué)研究組織：用于藥物體內(nèi)動(dòng)力學(xué)研究v 步驟：取樣，勻漿，去蛋白步驟：取樣，勻漿，去蛋白v 5.5.頭發(fā)：主要用于體內(nèi)

12、微量元素的測(cè)定。頭發(fā)：主要用于體內(nèi)微量元素的測(cè)定。v 枕部取樣，洗凈，消化或者高溫灰化后測(cè)定枕部取樣，洗凈，消化或者高溫灰化后測(cè)定v 二二 體內(nèi)樣品的貯藏與處理體內(nèi)樣品的貯藏與處理v 1.1.冷藏或冷凍冷藏或冷凍v 2.2.去活性：快速冷凍；微波照射；加入酶活性去活性：快速冷凍；微波照射；加入酶活性阻斷劑或者抗氧劑；高溫煮沸。阻斷劑或者抗氧劑；高溫煮沸。第二節(jié)第二節(jié).體內(nèi)樣品分析的前處理體內(nèi)樣品分析的前處理v依據(jù)依據(jù): 1 1）樣品種類（血，尿）樣品種類（血，尿） 2 2）被測(cè)藥物結(jié)構(gòu)及性質(zhì)）被測(cè)藥物結(jié)構(gòu)及性質(zhì) 3 3）測(cè)定方法：專屬性，）測(cè)定方法：專屬性，LODLOD 應(yīng)用：應(yīng)用： 1.1.

13、藥物含量高，處理簡(jiǎn)單。藥物含量高，處理簡(jiǎn)單。 2.2.樣品干擾小樣品干擾小,(,(如尿）如尿）, ,前處理簡(jiǎn)單前處理簡(jiǎn)單 3.3.測(cè)定方法專屬性好測(cè)定方法專屬性好(HPLC),(HPLC),前處理簡(jiǎn)單。前處理簡(jiǎn)單。 v 一一. . 目的目的v 1.1.使待測(cè)藥物游離使待測(cè)藥物游離v 2.2.滿足測(cè)定方法的要求滿足測(cè)定方法的要求: :重點(diǎn)考慮分析方法的重點(diǎn)考慮分析方法的靈敏度和專屬性靈敏度和專屬性. .v 3. 3.改善分析環(huán)境改善分析環(huán)境: :如如HPLC.HPLC.二二. .樣品前處理方法樣品前處理方法1.1.去除蛋白質(zhì)去除蛋白質(zhì)v 目的：目的：使結(jié)合型藥物釋放出來(lái)使結(jié)合型藥物釋放出來(lái) 減少

14、乳化減少乳化 保護(hù)色譜柱保護(hù)色譜柱 方法：方法： 1 1）加入與水相混溶的有機(jī)溶劑加入與水相混溶的有機(jī)溶劑（EtOH,MeEtOH,Me2 2CO, CO, CHCH3 3CN, etcCN, etc）, ,混勻后離心，取上清液分析（破壞混勻后離心，取上清液分析（破壞氫鍵使蛋白質(zhì)凝聚氫鍵使蛋白質(zhì)凝聚）. . 2 2）加中性鹽加中性鹽NaNa2 2SOSO4 4,(NH,(NH4 4) )2 2SOSO4 4 ：與水結(jié)合，：與水結(jié)合，使蛋白質(zhì)脫水而沉淀，離心后取上清液。使蛋白質(zhì)脫水而沉淀，離心后取上清液。 3 3）加強(qiáng)酸（）加強(qiáng)酸（CClCCl3 3COOH,HClOCOOH,HClO4 4）,

15、 ,適于適于pHpHPI,PI,蛋蛋白質(zhì)白質(zhì)為陽(yáng)離子為陽(yáng)離子,與強(qiáng)酸形成不溶性鹽而沉淀。與強(qiáng)酸形成不溶性鹽而沉淀。 4 4）加鋅或銅鹽的沉淀劑如）加鋅或銅鹽的沉淀劑如CuSOCuSO4 4-Na-Na2 2WOWO4 4, ZnSO, ZnSO4 4 NaOHNaOH, ,適于適于pHpHPI,PI,蛋白質(zhì)為陰離子，與金屬陽(yáng)離蛋白質(zhì)為陰離子，與金屬陽(yáng)離子形成不溶鹽而沉淀子形成不溶鹽而沉淀 5 5）酶解法：用枯草菌溶素使肽鏈降解，）酶解法：用枯草菌溶素使肽鏈降解，5060 5060 具最大活力，條件溫和，作用強(qiáng)，適于酸不穩(wěn)定具最大活力，條件溫和，作用強(qiáng)，適于酸不穩(wěn)定及結(jié)合牢固的藥物及結(jié)合牢固的藥

16、物. . 6) 6)熱凝固法熱凝固法 樣品前處理樣品前處理 2. 2.分離，純化，濃集分離，純化，濃集 目的：消除干擾，使待測(cè)物以適合的形式和目的：消除干擾，使待測(cè)物以適合的形式和量用于分析。量用于分析。 (1)(1)液液- -液提?。ㄒ禾崛。↙LELLE） 藥物親脂性強(qiáng)藥物親脂性強(qiáng) 內(nèi)源性雜質(zhì)親水性強(qiáng)內(nèi)源性雜質(zhì)親水性強(qiáng) 采用有機(jī)溶劑提取后可大大純化樣品采用有機(jī)溶劑提取后可大大純化樣品 1 1）有機(jī)溶劑）有機(jī)溶劑( (極性見表極性見表5-1)5-1)：要求對(duì)待側(cè)組分：要求對(duì)待側(cè)組分S S大，大，bpbp低，水溶性小，無(wú)毒，穩(wěn)定，不易乳化。低，水溶性小，無(wú)毒，穩(wěn)定，不易乳化。常用常用EtEt2

17、2O,CHClO,CHCl3 3 2 2）二相體積比：采用少量多次提取法。）二相體積比：采用少量多次提取法。 3 3）水相）水相pHpH值：主要考慮藥物的酸堿性值：主要考慮藥物的酸堿性 如：選擇水相如：選擇水相pHpH為堿性為堿性藥物是生物堿藥物是生物堿內(nèi)源性雜質(zhì)為酸性內(nèi)源性雜質(zhì)為酸性游離堿游離堿 脂液脂液成鹽成鹽 水溶性增加水溶性增加（2) 2) 固相萃?。ü滔噍腿。⊿olid-phase Extraction,SPESolid-phase Extraction,SPE） 小型柱色譜，填料粒度小，分離效能高，小型柱色譜，填料粒度小，分離效能高，無(wú)乳化現(xiàn)象，處理樣品速度快，常用提?。簾o(wú)乳化現(xiàn)象

18、，處理樣品速度快，常用提?。?a.a.親水性用硅藻土；親水性用硅藻土；b.b.疏水性用疏水性用C C1818. .由由VarianVarian公司生產(chǎn)的半自動(dòng)樣品制備系統(tǒng)（公司生產(chǎn)的半自動(dòng)樣品制備系統(tǒng)（Advanced Advanced automated sample processor, AASP)automated sample processor, AASP)使使SPESPE更更簡(jiǎn)便，快速，樣品經(jīng)簡(jiǎn)便，快速，樣品經(jīng)1010個(gè)固定微型柱離線萃取，個(gè)固定微型柱離線萃取，微柱轉(zhuǎn)移到自動(dòng)進(jìn)樣器做預(yù)柱，由流動(dòng)相將分微柱轉(zhuǎn)移到自動(dòng)進(jìn)樣器做預(yù)柱，由流動(dòng)相將分析物洗脫至分析柱。析物洗脫至分析柱。 缺點(diǎn)

19、：成本高缺點(diǎn)：成本高v (3)(3)超濾超濾: :一種膜分離技術(shù)一種膜分離技術(shù), ,按照分子量大按照分子量大小小, ,分離水溶性生物大分子分離水溶性生物大分子. .3.3.綴合物水解綴合物水解 含極性基團(tuán)（含極性基團(tuán)（OH,NHOH,NH2 2,COOH,COOH）的藥物，常與）的藥物，常與內(nèi)源性物質(zhì)（如葡萄糖醛酸）形成綴合物，當(dāng)內(nèi)源性物質(zhì)（如葡萄糖醛酸）形成綴合物，當(dāng)測(cè)定尿液中藥物濃度時(shí)，需將綴合物中藥物釋測(cè)定尿液中藥物濃度時(shí)，需將綴合物中藥物釋出，常用酸解或酶解的方法。出，常用酸解或酶解的方法。4.4.化學(xué)衍生化學(xué)衍生目的：目的：1 1）提高檢測(cè)靈敏度，如）提高檢測(cè)靈敏度，如HPLCHPL

20、C紫外檢測(cè)紫外檢測(cè)2 2）增加藥物穩(wěn)定性。）增加藥物穩(wěn)定性。3 3）提高藥物分析能力，如：）提高藥物分析能力，如： a.GCa.GC中的中的-COOH-COOH衍生成衍生成-COOCH-COOCH3 3增大揮發(fā)增大揮發(fā) 性，減少極性。性，減少極性。 b.b.手性分離中：生成非光學(xué)異構(gòu)體（普通手性分離中：生成非光學(xué)異構(gòu)體（普通柱色譜分析）柱色譜分析）1 1）GC: RCOOHGC: RCOOH Ar Ar-OH-OHCHCH2 2N N2 2 CHCH3 3OHOHRCOOCHRCOOCH3 3RCOOSiMeRCOOSiMe3 3ArOCOCHArOCOCH3 3Ar-O-CHAr-O-CH3

21、 3 Ar-OSiMe3Ar-OSiMe3 2 2）手性分離：）手性分離： + +（R R）-E-E R-SA R-SA S-SA S-SA手性藥物手性藥物 （R R）E-E-（R R）SASA（R R）E-E-（S S）SASA光活性試劑光活性試劑非對(duì)映異構(gòu)體非對(duì)映異構(gòu)體 3 3）HPLC:HPLC:如慶大霉素如慶大霉素C C組分檢查組分檢查 a.a.柱前柱前衍生衍生 b.b.柱后柱后衍生衍生，需一個(gè)額外的泵，需一個(gè)額外的泵 第三節(jié)第三節(jié) 定量分析方法驗(yàn)證定量分析方法驗(yàn)證v 一一 分析方法的建立分析方法的建立v 1.1.分析方法分析方法: :色譜分析法色譜分析法; ;免疫分析法免疫分析法;

22、;生物學(xué)生物學(xué)方法方法. .v 2. 2.步驟步驟:(1):(1)色譜條件選擇色譜條件選擇,(2),(2)色譜條件優(yōu)化色譜條件優(yōu)化: :空白溶劑試驗(yàn)空白溶劑試驗(yàn)考查溶劑影響考查溶劑影響; ;空白生物基質(zhì)試驗(yàn)空白生物基質(zhì)試驗(yàn)考查生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的影響考查生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的影響( (方法特異性方法特異性); ); 質(zhì)控生物樣品試驗(yàn)質(zhì)控生物樣品試驗(yàn)（空白生物基質(zhì)中加入待測(cè)藥物）空白生物基質(zhì)中加入待測(cè)藥物）考查考查方法效能指標(biāo)方法效能指標(biāo);(3);(3)實(shí)際樣品實(shí)際樣品(Incurre(Incurre samples)samples)測(cè)試測(cè)試代謝產(chǎn)物的干擾代謝產(chǎn)物的干擾( (方法特異性方法特異

23、性) )v 二二 分析方法驗(yàn)證分析方法驗(yàn)證(validation)(validation) 用于實(shí)際生物樣品分析之前驗(yàn)證分析方法的用于實(shí)際生物樣品分析之前驗(yàn)證分析方法的可行性與可靠性可行性與可靠性（一）方法特異性（一）方法特異性specificityspecificity( (專屬性或選擇性專屬性或選擇性selectivityselectivity) )系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時(shí)，方法準(zhǔn)確測(cè)定待系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時(shí)，方法準(zhǔn)確測(cè)定待測(cè)物質(zhì)的能力測(cè)物質(zhì)的能力專屬性：表示所檢測(cè)的信號(hào)專屬性：表示所檢測(cè)的信號(hào)( (響應(yīng)響應(yīng)) )系屬于待測(cè)系屬于待測(cè)藥物所特有的能力。藥物所特有的能力。選擇性：系指將待

24、測(cè)物質(zhì)與其代謝物及同服的選擇性：系指將待測(cè)物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分其它藥物加以區(qū)分( (分離分離) )的能力。的能力。特異性：函蓋二者，以驗(yàn)證所測(cè)定的物質(zhì)與待特異性：函蓋二者，以驗(yàn)證所測(cè)定的物質(zhì)與待測(cè)藥物的同一性。測(cè)藥物的同一性。 1. 1. 內(nèi)源性物質(zhì)的干擾內(nèi)源性物質(zhì)的干擾 考查考查待測(cè)藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)待測(cè)藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào) 比較對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品），空白生物基質(zhì)，比較對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品），空白生物基質(zhì)，模擬生物樣品（空白生物基中加對(duì)照品）信號(hào)。模擬生物樣品（空白生物基中加對(duì)照品）信號(hào)。如如HPLCHPLC色譜峰的色譜峰的t tR R、n n和和T T是否一致

25、，是否一致， 及與內(nèi)源性物質(zhì)色譜峰的及與內(nèi)源性物質(zhì)色譜峰的R R 確證：內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)分析方法有無(wú)干擾確證：內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)分析方法有無(wú)干擾2. 2. 代謝產(chǎn)物的干擾代謝產(chǎn)物的干擾 比較模擬生物樣品和用藥后的實(shí)際生物樣品的比較模擬生物樣品和用藥后的實(shí)際生物樣品的檢測(cè)信號(hào)與代謝產(chǎn)物的檢測(cè)信號(hào)與代謝產(chǎn)物的R R值值。確證：其它代謝產(chǎn)物對(duì)分析方法有無(wú)干擾確證：其它代謝產(chǎn)物對(duì)分析方法有無(wú)干擾 結(jié)構(gòu)已知的特定活性代謝物的測(cè)定結(jié)構(gòu)已知的特定活性代謝物的測(cè)定必要時(shí)通過(guò)必要時(shí)通過(guò)HPLC-DADHPLC-DAD或或LC-MSLC-MS確證色譜峰的單純確證色譜峰的單純性和同一性性和同一性 對(duì)于結(jié)構(gòu)未知的代謝產(chǎn)物的測(cè)定

26、，可采用對(duì)于結(jié)構(gòu)未知的代謝產(chǎn)物的測(cè)定，可采用LC-LC-LC-NMRLC-NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)的初步推測(cè)后，考察其干擾情況。進(jìn)行結(jié)構(gòu)的初步推測(cè)后，考察其干擾情況。3. 3. 伍用藥物的干擾伍用藥物的干擾 進(jìn)行進(jìn)行TDMTDM時(shí)，還要考慮患者可能同時(shí)服用藥物時(shí)，還要考慮患者可能同時(shí)服用藥物( (通常為數(shù)有限通常為數(shù)有限) )的干擾。的干擾。 比較待測(cè)藥物及可能同時(shí)服用藥物的模擬生比較待測(cè)藥物及可能同時(shí)服用藥物的模擬生物樣品的檢測(cè)信號(hào)物樣品的檢測(cè)信號(hào)確證：同時(shí)服用藥物對(duì)分析方法的干擾情況確證：同時(shí)服用藥物對(duì)分析方法的干擾情況4. 4. 與參比方法的相關(guān)性與參比方法的相關(guān)性 參比方法一般選用特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確

27、度高、線性參比方法一般選用特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、線性關(guān)系良好的色譜法關(guān)系良好的色譜法 如在如在TDMTDM中使用中使用UV(UV(或或RIA)RIA)時(shí)時(shí), , 可以用可以用HPLC(HPLC(或或GC)GC)為參比；以參比方法測(cè)定結(jié)果為橫坐標(biāo)為參比；以參比方法測(cè)定結(jié)果為橫坐標(biāo)(X); (X); 擬擬定方法測(cè)定結(jié)果為縱坐標(biāo)定方法測(cè)定結(jié)果為縱坐標(biāo)(Y)(Y)用最小二乘法計(jì)算回歸方程用最小二乘法計(jì)算回歸方程 Y Ya abXbX ( (坐標(biāo)標(biāo)坐標(biāo)標(biāo)度相等度相等) )和相關(guān)系數(shù)和相關(guān)系數(shù)( (r r) )表示兩種方法測(cè)得結(jié)果表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性。的一致性。 Y Ya abXbX 截距截距(a)

28、(a)：表示擬定方法受到恒定干擾的程度：表示擬定方法受到恒定干擾的程度：內(nèi)源性物質(zhì)內(nèi)源性物質(zhì)(UV)(UV) 斜率斜率(b)(b)：表示擬定方法受到比例干擾的程度：表示擬定方法受到比例干擾的程度：標(biāo)記抗原不純標(biāo)記抗原不純(RIA)(RIA) 與參比方法的相關(guān)性比較與參比方法的相關(guān)性比較: :除顯示分析方法的特除顯示分析方法的特異性外異性外, ,斜率斜率b b表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性 若截距若截距a0, a0, 則擬定方法的準(zhǔn)確度則擬定方法的準(zhǔn)確度( (回收率回收率) )為為100b(%)100b(%)（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)

29、曲線(standard curve)(standard curve)，oror叫校正曲線叫校正曲線(calibration curve)(calibration curve)，or working curveor working curve生物樣品中所測(cè)定藥物濃度與響應(yīng)的相關(guān)性生物樣品中所測(cè)定藥物濃度與響應(yīng)的相關(guān)性 通常用回歸分析方法所得的回歸方程來(lái)評(píng)價(jià)通常用回歸分析方法所得的回歸方程來(lái)評(píng)價(jià)除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標(biāo)準(zhǔn)曲線通常除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標(biāo)準(zhǔn)曲線通常為線性模式為線性模式回歸分析法為最小二乘法（回歸分析法為最小二乘法（least squaresleast squares）或加

30、權(quán)最小二乘法（或加權(quán)最小二乘法（weighted least squaresweighted least squares11使用與待測(cè)樣品相同的生物介質(zhì)。使用與待測(cè)樣品相同的生物介質(zhì)。22標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)數(shù)66，線性線性范圍包含全部待測(cè)濃度。范圍包含全部待測(cè)濃度。v 3. 3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的高低濃度范圍叫定量（線性）范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線的高低濃度范圍叫定量（線性）范圍（quantification rangequantification range），應(yīng)能覆蓋全部生物樣品），應(yīng)能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度中的藥物濃度v 4.4.以待測(cè)藥物的檢測(cè)響應(yīng)以待測(cè)藥物的檢測(cè)響應(yīng)( (如色譜峰面積或峰高如色譜

31、峰面積或峰高) ) 或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)響應(yīng)的比值或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)響應(yīng)的比值( (內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法)()(因變量因變量,y),y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品中藥物濃度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品中藥物濃度( (自變量自變量, ,x x) )，進(jìn)行線性回歸，進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程求得回歸方程(y(ya abxbx) )及其相關(guān)系數(shù)及其相關(guān)系數(shù)( ( ) )，最高，最高濃度應(yīng)高于達(dá)峰濃度濃度應(yīng)高于達(dá)峰濃度( (C Cmaxmax) )；最低濃度應(yīng)低于；最低濃度應(yīng)低于C Cmaxmax的的10%10%5%5%，并應(yīng)為方法的，并應(yīng)為方法的LOQLOQ，回歸方程的截距應(yīng)接近，回歸方程的截距應(yīng)接近于零，相關(guān)系數(shù)要求于零，相關(guān)系數(shù)要求 0.

32、99(0.99(色譜法色譜法) )或或0.98(0.98(生生物學(xué)方法物學(xué)方法) )5.5.標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備 空白生物基質(zhì)空白生物基質(zhì)( (如血漿如血漿)加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液適量，渦旋混勻，防止在標(biāo)準(zhǔn)溶液加入及渦旋混合適量，渦旋混勻，防止在標(biāo)準(zhǔn)溶液加入及渦旋混合時(shí)造成損失時(shí)造成損失 先加入標(biāo)準(zhǔn)溶液先加入標(biāo)準(zhǔn)溶液 再加入空白生物基質(zhì)再加入空白生物基質(zhì) 渦旋混勻渦旋混勻 v （三）定量下限（三）定量下限（LLOQLLOQ）v 標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，表示方法的靈敏度標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，表示方法的靈敏度（sensitivitysensitivity

33、），即測(cè)定樣品中符合準(zhǔn)確度和精），即測(cè)定樣品中符合準(zhǔn)確度和精密度要求的最低藥物濃度。密度要求的最低藥物濃度。v 應(yīng)能滿足測(cè)定應(yīng)能滿足測(cè)定3 35 5個(gè)消除半衰期后生物樣品中個(gè)消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度的藥物濃度v 準(zhǔn)確度在準(zhǔn)確度在80%80%120%(120%(或或RERE在在20%20%的范圍內(nèi)的范圍內(nèi)) )vRSDRSD應(yīng)應(yīng)20%20% （四）精密度（四）精密度precisionprecision與準(zhǔn)確度與準(zhǔn)確度accuracyaccuracy 高中低高中低三個(gè)濃度的三個(gè)濃度的QCQC樣品，樣品，LOQLOQ附近，標(biāo)準(zhǔn)曲線附近，標(biāo)準(zhǔn)曲線上限及中間各一個(gè)濃度各上限及中間各一個(gè)濃度各5

34、5個(gè)樣。個(gè)樣。 日內(nèi)，日間精密度的日內(nèi)，日間精密度的RSDRSD15%15%，LOQLOQ附近附近20%20%，加，加樣回收率樣回收率85115%,LOQ85115%,LOQ附近附近80120%80120%。準(zhǔn)確度以準(zhǔn)確度以測(cè)定值測(cè)定值M M (measured)(measured)的平均值與理論濃度的平均值與理論濃度( (加入值加入值) )A A(added)(added)的比值表示的比值表示相對(duì)回收率相對(duì)回收率相對(duì)誤差相對(duì)誤差 限度要求限度要求: :相對(duì)回收率應(yīng)在相對(duì)回收率應(yīng)在85%85%115% (LOQ115% (LOQ附近附近80%80%120%),RE120%),RE在在15% (

35、LOQ15% (LOQ附近為附近為20%)20%)）（%100AMRR）（）（%100%100RRAAMRE方法精密度一般用標(biāo)準(zhǔn)偏差方法精密度一般用標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation(standard deviation，SDSD) )或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation(relative standard deviation，RSDRSD) )表示表示 SDSD= =RSDRSD= = = = 包括批內(nèi)包括批內(nèi)(within-run(within-run或或intra-assay)intra-assay)RSDRSD( (日內(nèi)日內(nèi))

36、 ) 和批間和批間(between-run(between-run或或inter-assay)inter-assay)RSDRSD( (日間日間) )112nXXniii）（%100XSD）（%100112XnXXniii方差分析法方差分析法 批間批間RSDRSD = =批內(nèi)批內(nèi)RSD RSD = = =(%)1001)(%)100112 XIXXnXISSIiiA）（%100(%)100 XINSSSSXINSSAtote）（）（%100)(11212 XINXXnXXIiIiinjijv SS SSe e：批內(nèi)方差；：批內(nèi)方差；SSSSA A：批間方差；：批間方差；SSSStottot：總

37、方：總方差；差；X Xijij：第：第i i批第批第j j次測(cè)定；次測(cè)定；X Xi i.:.:第第i i批批n n次測(cè)定平均次測(cè)定平均值值; X:N; X:N次測(cè)定總平均值次測(cè)定總平均值;I:;I:測(cè)定批數(shù)測(cè)定批數(shù);n:;n:每批測(cè)定每批測(cè)定次數(shù)次數(shù);N:;N:總測(cè)定次數(shù)總測(cè)定次數(shù)( (五）五）樣品穩(wěn)定性樣品穩(wěn)定性 室溫及冷凍下，測(cè)室溫及冷凍下，測(cè)A A（吸收度或峰面積）以考（吸收度或峰面積）以考察不同條件下，樣品的可保存時(shí)間及穩(wěn)定性察不同條件下，樣品的可保存時(shí)間及穩(wěn)定性 QCQC樣品穿插于實(shí)際樣品測(cè)定全過(guò)程樣品穿插于實(shí)際樣品測(cè)定全過(guò)程模擬模擬( (或?qū)嶋H或?qū)嶋H) )生物樣品及其預(yù)處理后的待測(cè)溶生物樣品及其預(yù)處理后的待測(cè)溶液進(jìn)行考察液進(jìn)行考察 要求：準(zhǔn)確度要求：準(zhǔn)確度85%85%115%(115%(RERE在在15%15%范圍內(nèi)范圍內(nèi)) )，RSDRSD15% 15% （六）（六）提取提取回收率（回收率（extraction recoveryextraction recovery） 考察樣品處理過(guò)程的回收率考察樣品處理過(guò)程的回收率 重現(xiàn)性好重現(xiàn)性好 v提取回收率一般應(yīng)提取回收率一般應(yīng)50%50%v高、中濃度的高、中濃度的RSDRSD應(yīng)應(yīng)15%15%v低濃度的低