表達(dá)H5N1亞型禽流感病毒HA基因的重組鴨瘟病毒的構(gòu)建.docx

1、表達(dá)H5N1亞型禽流感病毒HA基因的重組鴨瘟病毒的構(gòu)建孫強(qiáng)強(qiáng)I劉忠琛七胡潘七左青山2,吳美芹I,馬晶*李明義2，單虎'(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109;2.青島易邦生物工程有限公司，山東青島266032;3.膠州市畜牧善醫(yī)局，山東膠州266360)摘要：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出鴨瘟病毒(DPV)生長非必需區(qū)的TK基因(約2.5kb),將其克隆入pUC19載體獲得載體puDTK.根據(jù)已知載體pcDNA-LacZ的序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增出pcDNA-LacZ上含CMV啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、SV40及LacZ的完備的基因表達(dá)盒插入puDTK的TK上，獲得質(zhì)粒puDTCL。根據(jù)Gen

2、bank已發(fā)表的H5N1亞型禽流感病毒的血凝素(HA)基因序列，設(shè)計(jì)引物從T-HA質(zhì)粒上擴(kuò)增出HA基因，克隆到puDTCL的表達(dá)盒的多克隆位點(diǎn)NheI與ApaI之間，成功構(gòu)建合LacZ及HA基因的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)puDTCL-HA.將這載體質(zhì)粒與DPV34F2疫苗毒共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF),經(jīng)藍(lán)斑克隆篩選和純化,獲得了遺傳姓狀穩(wěn)定的表達(dá)HA基因的重組鴨瘟病毒.關(guān)鍵詞:禽流感病毒;鴨瘟病毒;TK基因；H.A基因；重組鴨瘟病毒中圖分類號(hào)：S852.659.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1005-944X(2009)04-0040-04ConstructionofRecombinantDuckPlagu

3、eVirusEjqnessingHAGeneofH5N1SubtypeAvianbifhienzaVirusSunQiang-qiang'LiuZhong-chenHuXiao2,ZuoQing-shan'WuMei-qin1,MaJing',LiMing-yi2,ShanHu1(1.QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao266109：2.QingdaoYebioBioengineeringCompany,Qingdao266032;3JiaozhouAnimalHusbandryandVeterinaryBureau,Jiaozho

4、u266360)Abstract：UsingextractedtotalDNAfromduckplaguevirus(DPV)astemplate,the2.5kbTKgenenonessentialforviralreplicationwereamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)andclonedintopUC19vecteratonetimetoobtainpuDTK.AccordingthepcDNA-LacZsequence,onepairsoftheprimersusedtoamplifyCMV,itsintegralitygenecase,

5、SV40andLacZwhichlieintheplasmidpcDNA-LacZwereinsertedintoTKsitewhichliesinpuDTK.,resultinginthetransfervectorpUTCL.OnepairofprimerswassynthesizedaccordingHAsequenceofH5N1subtypeavianinfluenzaviruspublishedongenebank,whichwasusedtoamplifyHAgenefromT-HA,thenwasinsertedintotheresultingtransfervectorpUT

6、CLinthemulticlonalsitestoobtainthepUTCL-HAvectorcompletely.Afterconstructionoftransfervector,itwastransfectedonCEFcellswithDPV.Followingdonningandpurificationofblueplaque,thepureHA-fbwlpoxvirusrecombinantwasobtained.KeyWords:Avianinfluenzavirus;Duckplaguevirus;HAgene;TKgene;rDPV禽流感(Al)是由A型流感病毒引起的一種禽

7、類的急性、烈性接觸性、呼傳染病。通常情況下，禽流感病毒并不感染人類，但自1997年禽A型流感病毒H5N1感染人類之后，相繼有H9N2.H7N7亞型感染人類和H5N1再次感染人類的報(bào)道，引起世人廣泛關(guān)注®叱對(duì)高致病性禽流感(HPAD的控制主要采用隔離封鎖疫點(diǎn)、撲殺銷毀感染動(dòng)物以及疫苗免疫相結(jié)合的方式，但是在疫情波及范圍很大，撲殺感染動(dòng)物很難實(shí)施時(shí)，用疫苗免疫控制疫情是不可替代的措資助項(xiàng)目：863項(xiàng)目.(家禽重妄病*病基因工程疫苗研究和創(chuàng)新，2006AA10A205)通訊作者：李明義施。近年來，高致病性禽流感對(duì)于鴨、鵝等水禽的感染病例逐漸增多，致病性也逐漸加強(qiáng)，而且水禽也是禽流感病毒重要

8、的攜帶和儲(chǔ)藏宿主，在高致病性禽流感病毒的變異和傳播過程中扮演重要的角色。因此，水禽免疫是高致病性禽流感防制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。對(duì)HPAI的控制主要采用隔離封鎖疫點(diǎn)、撲殺銷毀感染動(dòng)物和受威脅動(dòng)物以及其它生物安全措施，但是在疫情波及范圍很大，撲殺感染動(dòng)物很難實(shí)施時(shí)，用疫苗免疫控制疫情則是不可替代的措施。鴨、鵝等水禽是禽流感病毒重要的攜帶和儲(chǔ)藏宿主，在高致病力禽流感病毒的變異和傳播過程中扮演極為重要的角色，因此，水禽免疫是高致病性禽流感防制的關(guān)健環(huán)節(jié)。但目前已投入使用的各種流感疫苗對(duì)于水禽抗原性差、免疫效果不確實(shí)等缺點(diǎn)。因此，急需構(gòu)建一種適用于水禽的以鴨瘟病毒為載體新型重組病毒疫苗。血凝素HA是禽流感病毒(

9、A1V)具有免疫保護(hù)性的主要蛋白,HA是用來做重組禽流感病毒疫苗的首選抗原。鴨瘟(DP)又稱鴨病毒性腸炎(DVE),是常見于鴨、鵝、天鵝等雁行目禽類的一種急性、高度接觸性傳染病，是目前對(duì)世界范圍水禽養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴(yán)重的疫病之一。預(yù)防鴨瘟的傳統(tǒng)疫苗有滅活苗和弱毒苗，其中DPV34F2株是DPV經(jīng)典的弱毒株，是國內(nèi)沿用多年的優(yōu)度弱密疫苗株，在鴨瘟病的防治中發(fā)揮了重要作用阪)。但DPV34F2株也有不足之處，即它為TK+表型，有神經(jīng)毒力，可引起潛伏感染。TK基因是DPV的主要毒力基因，同時(shí)也是病毒復(fù)制的非必需基因，鴨瘟病毒強(qiáng)弱毒株TK基因及側(cè)翼UL24基因高度保守，為構(gòu)建鴨瘟病毒TK基因缺失的轉(zhuǎn)移載體

10、奠定了基礎(chǔ)，TK表型的DPV變異株在神經(jīng)細(xì)胞中的復(fù)制能力則大為減弱，故TK基因?yàn)闃?gòu)建DPV基因缺失疫苗的首選靶基因。因此，以DPV34F2株作親本病毒fKTK基因缺失區(qū)插入禽流感病毒的IIA基因構(gòu)建重組活載體疫苗株，這在理論和實(shí)踐上均是可行的。本文構(gòu)建了含LacZ報(bào)告基因與HA的IL24-TK基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體，與DPV同源重組，獲得了表達(dá)HA蚩白的重組DPV,為進(jìn)一步研究表達(dá)HA蛋白的rDPV的免疫學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1.1主要試劑質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒，rTaq酸，T4DNA連接酶，pUC19載體，限制性內(nèi)切酶EcoRLHindlll,BgllbNheLApa

11、l等均購自寶生物工程有限公司；牛小腸堿性磷酸酶購自Promega公司；DMEM干粉購自GIBCO公司，犢牛血清購自杭州四青生物工程公司產(chǎn)品，批號(hào):200010303o其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.1.2質(zhì)粒、菌種與毒株DPV34F2疫苗株購自黑龍江省生物制品一廠；大腸桿菌轉(zhuǎn)化胸株DH5a,及含有HA基因的T-HA質(zhì)粒均由本室保存：質(zhì)粒pcDNA-LacZ由本室實(shí)驗(yàn)人員構(gòu)建:SPF雞胚購自北京梅里亞維通公司。1.2方法1.2.1病毒DNA的提取及同源臂的PCR擴(kuò)增感染DPV34E2株的CEF細(xì)胞總DNA提取，參考魏榮方法進(jìn)行。將上述提取的感染DPV34F2株的CEF細(xì)胞的總DNA為PCR擴(kuò)增的模板

12、，根據(jù)Genbank己發(fā)表的DPV基因序列，合成兩對(duì)引物，在UL24-TK基因中間位置引入酶切位點(diǎn)BglII,為后序?qū)嶒?yàn)做準(zhǔn)備。UL24-TK1-Hindlll-U:5z-ATAAAGCTTAATGCACTAGTGTTTAG-3，UL24-TKl-BglII-L:5,-TATAGATCTGGTGGTGTTCTTTCTG-3,TK2-BglII-U：5'-AATAGATCTTACGCTCATAAHG-3TK2-EcoRI-L：5z-TATGAATTCTACCTGGGACAGAA-3*用上述UL24-TK1-對(duì)引物擴(kuò)增出左同源臂LL24-TK1,擴(kuò)增長度為1500bpoPCR反應(yīng)的條件為：

13、94C預(yù)變性5min,94C變性30s,57C退火30s,72C延伸1.5min,30個(gè)循環(huán)，最后72C延伸lOmin。用上述TK2的對(duì)引物擴(kuò)增出右同源臂TK2,擴(kuò)增長度為lOOObpoPCR反應(yīng)的條件為：94C預(yù)變性5min,94*C變性30s,53C退火30s,72*C延伸lmin,30個(gè)循環(huán)，最后72C延伸10min<»1.2.2含UL24-TK同源臂基因puDTK質(zhì)粒的構(gòu)建將回收的PCR產(chǎn)物直接用相應(yīng)引物兩端設(shè)計(jì)好的限制性內(nèi)切酶處理，與用HindHI和EcoRI處理PUC19載體進(jìn)行三片段連接，所獲得的至組我體質(zhì)粒命名為puDTK,酶切鑒定正確后送上海基因公司測(cè)序。1.

14、2.3含CMV啟動(dòng)子、LacZ報(bào)告基因的基因表達(dá)盒質(zhì)粒puDTCL的構(gòu)建根據(jù)pcDNA-LacZ的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物含有BgHI的酶切位點(diǎn)，從質(zhì)粒pcDNA-LacZ上PCR擴(kuò)增出含CMV啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、SV40及LacZ的完整的基因表達(dá)盒基因片段，將回收的PCR產(chǎn)物用Bglll處理后克隆到經(jīng)Bglll的酶消化的質(zhì)粒pGTK的TK上，獲得載體質(zhì)粒puDTCLo1.2.4含LacZ報(bào)告基因與I1A基因目的片段的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒puDTCL-llA的構(gòu)建根據(jù)Genbank己發(fā)表的HA基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物：HA5-Nhe-u:5/-TTAGCTAGCATGAAGAAAAT-3'HA5-Apal

15、-L:5'-ATTGGGCCCTTAAATGCAAA-3，以T-HA質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增HA基因，克隆到質(zhì)粒pGTK-EGFP的多克隆位點(diǎn)Nhel和Apal之間，獲得質(zhì)粒puDTCL-HA.1.2.5轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建過程（圖1）。1.2.6重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與DPV34F2疫苗毒共轉(zhuǎn)染取生長良好的原代CEF單層細(xì)胞經(jīng)胰防消化后，調(diào)整細(xì)胞密度以達(dá)到毫升30-50萬個(gè)細(xì)胞，然后分裝細(xì)胞到六孔板，待細(xì)胞生K至70%-80%即可進(jìn)行感染和轉(zhuǎn)染。感染病毒量為200PFU,同時(shí)加入2.5ug轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及9ulMirus轉(zhuǎn)染試劑，按試劑盒說明書進(jìn)行操作,30min后加入10%胎牛血清的DMEM,5%CO2

16、,37,C培養(yǎng)4-5d出現(xiàn)病變（蝕斑），利用濃度為0.3mg/mlX-gal的DMEM瓊脂鋪膠顯M：DL-2000Marker;A：UL24-TK2基因PCR產(chǎn)物；B：TK2因PCR產(chǎn)物圖2同源曾基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果增產(chǎn)物HA;B：DPV34F2林未擴(kuò)增出HA的目的條帶圖5重組DPV的PCR鑒定色后,在顯微鏡下挑取藍(lán)斑，至0.2ml無血清DMEM的離心管中，用以篩選。1.2.7重組病毒的篩選與鑒定將挑取的藍(lán)斑反復(fù)凍融3次，利用超聲波將病毒釋放。用無血清DMEM稀釋重組病毒成10-M010-3稀釋度,取015ml/孔接種原代或傳代CEF單層細(xì)胞，置5%02,37*0培養(yǎng)2h,用含1%低融點(diǎn)瓊脂

17、耕的DMEM于5%CQ的37C培養(yǎng)直至細(xì)胞出現(xiàn)蝕斑，再用0.3mg/mlX-gal的DMEM瓊脂顯色,370培養(yǎng)24h,挑取較高稀釋度藍(lán)斑或周圍無白斑的藍(lán)斑放入0.2ml無血清的DMEM離心管中，凍融三次后再重復(fù)以上步驟，直至每一個(gè)病毒蝕斑均為藍(lán)色，提取重組基因組DNA,做PCR鑒定。1.2.8重組病毒HA基因表達(dá)產(chǎn)物Western-blot鑒定bpMABisoooflBHHHH75005000250nmM：DL-15000Marker;A：表達(dá)會(huì)基因PCR產(chǎn)物；B：HA基因PCR產(chǎn)物圖3表達(dá)盒基因、HA基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果M為Marker;A：HA|l達(dá)產(chǎn)物圖6重組病毒W(wǎng)estern-bl

18、ot鑒定培果在重組鴨瘟病毒和親本鴨瘟病毒感染的CEF細(xì)胞出現(xiàn)100%CPE時(shí)收獲，用PBS（pH7.4）洗三遍，加入適量預(yù)熱的2XSDS電泳緩沖液裂解細(xì)胞，收集到一微量離心管中，置于沸水中煮沸Imin使蛋白樣品充分變性，陽性對(duì)照（禽流感病毒）樣品的制備過程同上。按分子克隆所述進(jìn)行灌膠叫待聚合后進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)束后將凝膠置于轉(zhuǎn)印裝置，用于Western-blot鑒定，通過檢測(cè)HA糖蛋白來確定外源基因是否具有活性。2結(jié)果2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果2.1.1PCR擴(kuò)增同源臂UL24-TK1基因和TK2基因,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可分別約為1500bp和lOOObp的特異性條帶，與預(yù)期的條帶位置相符（圖

19、2）。bpMlM2ABC頗MHPWVMMl:DL-15000Marker;M2：DL-2000Marker;A：史姐質(zhì)粒Knpl單*切整定；B：史處質(zhì)liHindlll單#切饕定；C：費(fèi)姐術(shù)拉PCR擴(kuò)增的HA基因圖4puDTCL-HA的PCR及酶切鑒定結(jié)果2.1.2PCR擴(kuò)增含CMV啟動(dòng)了、多克隆位點(diǎn)、SV40及LacZ的完整的基因表達(dá)盒和HA基因，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，可見分別約為5200bp和1700bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖3）。2.2重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定以重組質(zhì)粒PuDTCL-HA為模板，可擴(kuò)增出大小約為1700bp的HA基因目的條帝；將重組陽性質(zhì)粒puDT-

20、CL-HA分別用Knpl和Hindlll酶切鑒定，Knpl切出的三條帶約為419bp、682bp和10956bp;HindiII切出的兩條帶約為4015bp和8042bp,電泳結(jié)果與分析一致（見圖4）。另外，對(duì)轉(zhuǎn)移載體中部分目的基因序列測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移載體中HA基因及LacZ基因沒有發(fā)生堿基突變。2.3表達(dá)禽流感病毒HA基因的重組DPV的鑒定2.3.1藍(lán)白斑篩選與純化，將挑取的藍(lán)斑反復(fù)純化，直至每一個(gè)病毒蝕斑均為藍(lán)色。2.3.2重組DPV的PCR鑒定,將收集的經(jīng)純化培養(yǎng)的CEF細(xì)胞，提取基因組DNA,用HA引物經(jīng)PCR擴(kuò)增出預(yù)期大小1700bp的HA基因目的條帶，而只感染疫苗毒的細(xì)胞基因組D

21、NA未擴(kuò)增出HA基因目的條帶，表明HA基因成功插入DPV,并獲得了表達(dá)（圖5）o2.3.3重組DPV的Western-blot鑒定結(jié)果（圖6）3討論當(dāng)前，禽流感（AIV）是危害養(yǎng)禽業(yè)和人類的更要疾病，主要原因有兩個(gè):AIV的毒力在逐漸增強(qiáng)，新的致病型和毒力型在不斷出現(xiàn);至今沒有一種疫苗能真正有效地保護(hù)禽類免于AIM感染。在完善動(dòng)物安全體系的理念下,AIV疫苗研究正朝著限制弱毒苗使用，優(yōu)先發(fā)展滅活苗、亞單位苗-采用基因工程技術(shù)開發(fā)無感染性的新型疫苗方向發(fā)展。目前應(yīng)用的HPAI疫苗主要是油乳劑全病毒滅活疫苗，它具有保護(hù)率高，免疫期長和研制周期短等優(yōu)點(diǎn)。但滅活疫苗也存在一些難以克服的缺陷，例如滅活苗

22、不能同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫：免疫后雖能保護(hù)其免于發(fā)病和死亡，然而病毒分離結(jié)果陽性，說明用滅活苗免疫只能保護(hù)禽類在同亞型HPAIV攻擊時(shí)免于發(fā)病和死亡，而不能保護(hù)其免于感染。而且其免疫效果是由注射劑扉和疫苗中的抗原含暈共同決定的，在進(jìn)行免疫接種時(shí)往往需要比活疫苗高出許多倍的劑最，此外還必須添加佐劑，這就大大增加了滅活疫苗的成本。亞單位疫苗制作成本較高，免疫期短,不可能成為預(yù)防禽流感的理想疫苗。對(duì)于核酸疫苗的研究也才剛剛起步，尚有許多問題有待解決?；钏掦w基因重組疫苗是近年來十分關(guān)注的諸多新型疫苗中的一類，它是以利用基因工程方法改造的病毒或細(xì)菌作載體，按人們的要求表達(dá)特定免疫活性因了。隨

23、著對(duì)A1V疫苗的深入研究，用于構(gòu)建重組疫苗的病毒載體主:要有雞痘病毒(FPV)、念腺病毒以及皰疹病毒。在這些重組疫苗中，重組FPV已廣泛應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中，但使用這類疫苗的缺點(diǎn)是無法對(duì)已接種過痘苗的雞使用，同時(shí)無法克服母源抗體的干擾，最主要的是這些已投入使用的各種流感疫苗對(duì)于鴨、鵝等水禽抗原性差、免疫效果不確實(shí)等缺點(diǎn)，不適用于水禽。因此，急需構(gòu)建一種適用于水禽的病毒為載體新型重組病毒疫苗。以皰疹病毒(如MDV、FPV、DPV等)作為活病毒載體構(gòu)建表達(dá)A1V-HANA的載體疫苗是近凡年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。鴨瘟病毒(DPV)是典型的皰疹病毒，它的DNA具典型的皰疹病毒DNA的特征，大小約為150kb

24、,兩端為末端重復(fù)序列。中間有內(nèi)部重復(fù)序列。整個(gè)基因組分為U1和Us(shortuniqueregion)區(qū)，兩端為TR區(qū),U1和Us連接處有1R區(qū)。DPV作為大DNA病毒，其基因組有多個(gè)非必需區(qū)基因，具有多個(gè)插入位點(diǎn)，容許插入多個(gè)外源基因而不影響自身的復(fù)制和生物學(xué)特性，因而可作為-個(gè)重要的病毒載體而得到廣泛應(yīng)用網(wǎng)。TK基因是DPV研究最多的基因，缺失TK基因的DPV能在分化細(xì)胞中復(fù)制，但在神經(jīng)細(xì)胞的復(fù)制能力極弱，毒力不會(huì)返強(qiáng)，因而更加安全。并且DPV在禽類體內(nèi)存活時(shí)間較長，以該病毒作載體構(gòu)建表達(dá)禽流感HA載體疫苗可在水禽體內(nèi)連續(xù)產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，且具有低毒，水禽易適應(yīng)，可同時(shí)表達(dá)AIV的HA抗

25、原蛋白，使水禽具備抵御禽流感的體液免疫和細(xì)胞免疫特性，因而可以保護(hù)免疫水禽抵抗強(qiáng)毒的攻擊。I我國反芻動(dòng)物副產(chǎn)品首次出口歐盟j9+；經(jīng)張家港檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫合格，一批重15.35噸、貨值17.4萬；t美元的烤牛鞭日前在德國順利通關(guān)。這是我國除皮毛外的反芻動(dòng)物副產(chǎn)tt品首次出口歐盟。長期以來，歐盟以中國部分地區(qū)存在口蹄疫疫情潛在威脅，以及瘋；牛病等數(shù)據(jù)不詳、風(fēng)險(xiǎn)不確定為由，拒絕進(jìn)口中國的相關(guān)動(dòng)物產(chǎn)品。為確；保此次出曰歐盟的貨物出口順利，張家港檢驗(yàn)檢疫局要求出口企業(yè)嚴(yán)格it按照歐盟相關(guān)規(guī)定采購原料，確保用于生產(chǎn)的原料安全優(yōu)質(zhì)，并且可追tt溯，杜絕一切可能產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)的物質(zhì)進(jìn)入加工環(huán)節(jié)，并實(shí)施了生產(chǎn)加工

26、全；過程監(jiān)控。來源：新華報(bào)業(yè)網(wǎng)；本研究以鴨瘟經(jīng)典弱毒疫苗株DPV34F2株為親本病毒，用PCR擴(kuò)增同源重組臂，繼而插入含CMV啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、SV40及LacZ的完整的基因表達(dá)盒和HA基因，構(gòu)建了轉(zhuǎn)移載體puDTCL-HA,與DPV共轉(zhuǎn)染篩選表達(dá)HA的重組病毒，依靠DPV感染的形式呈遞AIV的HA抗原，在有效抵抗DPV強(qiáng)毒攻擊的同時(shí)，激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抵抗A1V強(qiáng)毒攻擊的反應(yīng)。本試驗(yàn)構(gòu)建的rDPV含有LacZ報(bào)告基因，報(bào)告基因LacZ在重組病毒表達(dá)外源基因的同時(shí)也得以表達(dá)，在含X-gal的培養(yǎng)基中呈現(xiàn)藍(lán)色。重組病毒攜帶報(bào)告基因LacZ,可以形成藍(lán)色蝕斑，而非重組的原禽痘病毒只能形成無色蝕斑。本研究得到了表達(dá)IIA基因的重組DPV34F2疫苗株，為進(jìn)一步研究表達(dá)HA基因的重組鴨瘟病毒的免疫學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。若有突破，可開發(fā)更為有效的專門適用于水禽的新型AIV疫苗，不僅可以解決當(dāng)前AIV的水禽疫苗防制問題,而且可為未來AIV毒力進(jìn)一步演變提供