定量PCR中-ct值的含義精編版

1、最新資料推薦實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR技術于1996年由美國AppliedBiosystem宓司推出,由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹。實時熒光定量PCR原理所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。Ct值的定義在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念一一Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含義

2、是：修個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數（加圖1所示）。最新資料推薦圖1.Ct值的確定1. 熒光域值(threshold)的設定2. PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold=10SDcycle6-15Ct值與起始模板的關系研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值(如圖2所示)。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起

3、始拷貝數。圖2.熒光定量標準曲線3. 熒光化學熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料現將其原理簡述如下：1) TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核甘酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'最新資料推薦-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。如圖3所zKoPolym

4、erizationforwardc石R11Reporter網吧QLpR°恥一*QUENCH1i*ty-»5*REVEHStPRIMERStrandDisplacementCleavage最新資料推薦PolymerizationCompleted*T5r7y-5圖3.TaqMan熒光探針工作原理2） SYBR熒光染料:在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。1 二.內標在傳統(tǒng)定量中的意義.幾種傳統(tǒng)定量PCR方法簡介

5、1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板o2）競爭法：3） 選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知

6、模板的起始拷貝數oPCR-ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物最新資料推薦顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的0o2.內標在傳統(tǒng)定量中的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異（見圖4）,因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳

7、統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。1f40E*QQ.OOE-Oil4OOE3-0196Replicates圖4.相同模板在同一臺PCR儀上進行96次擴增的擴增曲線圖終點處檢測產物量不恒定；Ct值則極具重現性三.內標對熒光定量PCR的影響1.實時熒光定量PCR無需內標實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，弁記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：最新資料推薦Ct值的重現性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數時，剛剛進入真正的指數擴

8、增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。（見圖4）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。2.內標對實時熒光定量PCR的影響若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變?yōu)殡p重PCR,雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著78。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是

9、這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內標法定量的方法學比較，得出的結論是：內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方。AppliedBiosystem宓司的7700型實時熒光定量PCR儀是全球公認的熒光定量PCR的金標準，可實現多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標準曲線的方法，而不用內標進行定量。綜上所述，利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領

10、域i10，11,12,13。1. 參考文獻HiguchiR,FocklerC,etal.KineticPCRanalysis:real-timemonitoringofDNAamplificationreactions.Biotechnology,1993,11(9):1026-1030.2. DNA/RNAReal-TimeQuantitativePCR-Rev.BAppliedBiosystems定量聚合酶鏈反應的研究進展與臨床應用.中華檢驗醫(yī)學雜志2000,23(2):120-121.3. 最新資料推薦AndersonKM,CheungPH,KellMD.Rapidgenerationo

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