自發(fā)性高血壓大鼠心肌細胞凋亡的變化及其意義

1、    自發(fā)性高血壓大鼠心肌細胞凋亡的變化及其意義        【摘要】目的探討心肌細胞凋亡在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心臟重塑中的作用及其意義。方法采用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的帶熒光的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)和透射電子顯微鏡技術(shù),觀察不同年齡SHR心肌細胞凋亡的變化及其規(guī)律。結(jié)果(1)1月齡SHR組無左室肥厚組(NLVH組)和1820月齡SHR組充血性心力衰竭組(CHF組)凋亡的心肌細胞核數(shù)目和凋亡指數(shù)顯著增加（P均0.01)，10月齡SHR組左室肥厚組

2、(LVH組)則顯著減少(P均0.01)。(2)有LVH的SHR中,心肌細胞凋亡與LVH呈顯著負相關(guān)(P0.01)。(3)透射電子顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)NLVH組和CHF組SHR左心室心肌組織中可見具有凋亡形態(tài)學(xué)特征的凋亡心肌細胞(胞質(zhì)濃縮、胞核染色質(zhì)濃聚邊集)，LVH組和CHF組可見心肌細胞肥大、肌漿網(wǎng)擴張和線粒體增生等改變。結(jié)論(1)SHR LVH發(fā)生前和出現(xiàn)CHF后其心肌細胞凋亡顯著增加；SHR伴顯著LVH時其心肌細胞凋亡顯著減少。提示心肌細胞凋亡在SHR心臟重塑中起重要作用，心肌細胞凋亡減少可能與LVH有關(guān)，而心肌細胞凋亡增多可能與CHF有關(guān)。(2)在SHR高血壓LVH心力衰竭演進過程中存在心肌

3、細胞凋亡的動態(tài)變化，可根據(jù)這一過程中心肌細胞凋亡的時間窗選用刺激或抑制心肌細胞凋亡的策略來改善高血壓心臟重塑?！娟P(guān)鍵詞】高血壓心肌細胞 Changes and significance of cardiac myocyte apoptosis in spontaneously hypertensive ratLI Faqi, CHEN Yunzhen. Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016【Abstract】ObjectiveTo s

4、tudy the effects and significance of cardiomyocyte apoptosis participating in the cardiac remodeling of spontaneously hypertensive rats (SHR). MethodsWe investigated the dynamic changes of cardiac myocyte apoptosis in left ventricle of SHR and Wistar-Kyoto rats (WKY) using in situ TdT-mediated dUTP

5、nick end labeling (TUNEL) and transmission electron microscope.Results(1)Apoptotic myocyte nuclei and apoptotic index (calculated by dividing the number of apoptotic myocyte nuclei by the total number of myocyte nuclei and multiplying that value by 100) were higher in 1-month-old SHR group no left v

6、entricular hypertrophy (NLVH) group and 18-20-month-old SHR group congestive heart failure (CHF) group than those in age -matched WKY group respectively (all P values less than 0.01). Apoptotic myocyte nuclei and apoptotic index were lower in 10-month-old SHR left ventricular hypertrophy (LVH) group

7、 than those in age-matched WKY group, NLVH group and CHF group (all P values less than 0.01). (2) Apoptotic index was inversely correlated with left ventricular hypertrophic index in SHR with LVH and CHF (n=6, r=-0.90, P<0.01, y=3.24-0.09x; n=5, r=-0.87, P<0.01, y=4.76-0.02x). (3) Electron mic

8、roscopic features of cardiocyte apoptosis (including intact sarcolemma in the presence of cytoplasm compaction and segregation of nuclear chromatin into small sharply delineated electron dense masses that abut the nuclear envelope) were identified in left ventricular tissue obtained from SHR with NL

9、VH group and CHF group but in none of the tissue specimens obtained from the left ventricles of the others. The ultramicrostructural changes, such as cardiac cellular hypertrophy, sarcoplasmic reticulum expansion, mitochondrion hyperplasia, occurred in left ventricular tissue obtained from SHR with

10、LVH group and CHF group.Conclusion(1) Cardiac myocyte apoptosis increases significantly in the left ventricle of SHR with CHF and without LVH. However, cardiomyocyte apoptosis decreases markedly in the left ventricle of SHR with LVH. These findings suggest that cardiac myocyte apoptosis may play a k

11、ey role in the heart remodeling of SHR, and that cardiomyocyte apoptosis decreasing may be bound up with LVH and cardiac myocyte apoptosis increasing may be related with CHF of SHR. (2) The dynamic changes of cardiac cell apoptosis occur in the hypertensionLVHheart failure volving process. It is pos

12、sible that the heart remodeling is ameliorated by the therapeutic strategies of stimulating or suppressing cardiomycoyte apoptosis according to the time window of cardiac cell apoptosis in the above process. 【Key words】hypertensionmyocardiumcells細胞凋亡,又稱程序性細胞死亡，是一種與細胞壞死截然不同的由基因調(diào)控的主動性非炎癥性細胞死亡形式，在許多疾病的

13、發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前心血管疾病細胞凋亡的研究主要集中在冠心病、心律失常、心肌炎及心肌病方面1，至于細胞凋亡與高血壓病及其靶器官損害的研究尚少報道。本研究采用自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)為實驗?zāi)Ｐ?，觀察不同年齡SHR左室肥厚(LVH)前、LVH時和心力衰竭后心肌細胞凋亡的變化情況，揭示心肌細胞凋亡在SHR LVH和心力衰竭發(fā)病中的作用、規(guī)律及其意義。材料與方法1.實驗動物:SHR購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院心血管病研究所實驗動物中心；正常Wistar大鼠(Wistar-Kyoto rats, WKY)購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。2.實

14、驗動物分組:(1) 1月齡SHR組(6只，雄性、雌性各3只)， 體重47.452.4 g，無LVH組(NLVH組)。(2) 10月齡SHR組(6只，雄性、雌性各3只)，體重206.7340.0 g，有明顯LVH組(LVH組)。(3) 1820月齡SHR組(5只，雄性3只，雌性2只)，體重352.8389.3 g，有顯著LVH伴心動過速，呼吸急促，腹腔積液，胸膜心包積液，心房血栓和右室肥厚等充血性心力衰竭(CHF)表現(xiàn)(CHF組)。按年齡和性別配對分別配以WKY組。3.心肌肥厚指數(shù)計算:取上述各組大鼠，腹腔內(nèi)注射10水合氯醛(0.4 ml/100 g)麻醉，直接開胸切取心臟，去除心房，大血管和心

15、包組織(同時注意觀察胸腔積液，心包積液和心房血栓)，沿室間隔分離左心室(包括室間隔)和右心室，冰冷生理鹽水沖洗干凈，清潔濾紙吸干水份后稱左心室(含室間隔)濕重和右心室濕重,計算左心室濕重/體重(LVW/BW，mg/g)和右心室濕重/體重(RVW/BW，mg/g),即為左心室心肌肥厚指數(shù)和右心室心肌肥厚指數(shù)。4.心肌細胞原位末端標(biāo)記與半定量分析:取左心室游離壁中部心室肌，立即置于4多聚甲醛(pH 7.4)中固定24小時(4 )，常規(guī)石蠟包埋，并作心臟橫斷切片(5 m)。應(yīng)用改良的末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的帶熒光的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end l

16、abeling,TUNEL)2原位標(biāo)記心肌凋亡細胞核中的DNA片斷3-OH末端(In Situ Cell Death Detection Kit,POD 購自德國寶靈曼公司)，以DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片后顯微觀察、攝影。步驟中不加TdT酶者作為陰性對照；正常的心肌組織以DNase(10g/ml)消化誘導(dǎo)DNA鏈斷裂后再按TUNEL法操作者作為陽性對照。光鏡下，正常心肌細胞核呈藍色，而凋亡陽性心肌細胞核呈棕黃色。半定量分析：每只大鼠觀察5張切片，每張切片計數(shù)5個高倍視野(high power field,HPF,400×)中凋亡陽性心肌細胞核數(shù)目及其占總細胞核數(shù)目的比例，求其均值。

17、5.心肌細胞超微結(jié)構(gòu)觀察:取上述各組大鼠左心室游離壁中部心室心肌標(biāo)本(約1 mm3大小),立即置于冰冷的4戊二醛(pH 7.2)固定1小時，常規(guī)制樣用日本產(chǎn)H-600型透射電子顯微鏡觀察(放大倍數(shù)50017 000倍)。每只大鼠觀察5張切片。6.統(tǒng)計學(xué)分析:多組間比較用F檢驗，多組間兩兩比較用Newman-Keuls檢驗，不同變量的相互關(guān)系用直線回歸分析。實驗數(shù)據(jù)用±s表示。結(jié)果1.SHR體重、收縮壓、心率、心肌肥厚指數(shù)和CHF病理改變情況(表1):1月齡SHR組未見左、右心室肥厚征象，10月齡SHR組有明顯的LVH，但不存在右室肥厚的特征，1820月齡SHR組均存在明顯的左、右心室

18、肥厚，且同時伴有腹腔、胸腔和心包積液及心房血栓等CHF的特征。另外，10月齡SHR組的收縮壓(SBP)顯著增高，1820月齡SHR組的SBP和心率(HR)均顯著增高。2.不同年齡SHR和WKY心肌細胞凋亡的變化(表2):1月齡SHR組(NLVH組)心肌細胞凋亡顯著增加，其凋亡陽性心肌細胞核數(shù)目及其占總細胞核數(shù)目的百分率(心肌細胞凋亡指數(shù))均顯著高于正常對照組（1月齡WKY組，P均0.01）。當(dāng)SHR發(fā)生明顯LVH后(10月齡SHR組,LVH組)，心肌細胞凋亡顯著減少,其凋亡陽性的心肌細胞核數(shù)目和心肌細胞凋亡指數(shù)與10月齡WKY組比較,有非常顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P均0.01)。SHR存在明顯的CH

19、F時(1820月齡SHR組,CHF組),心肌細胞凋亡又顯著增加，其凋亡陽性心肌細胞核數(shù)目和心肌細胞凋亡指數(shù)與1820月齡WKY組比較均顯著增加(P均0.01)。對不同年齡SHR組間心肌細胞凋亡進行比較，結(jié)果顯示:1月齡SHR組和1820月齡SHR組凋亡陽性心肌細胞核數(shù)目和心肌細胞凋亡指數(shù)均顯著高于10月齡SHR組(P均0.01)，但1月齡SHR組和1820月齡SHR組間差異無顯著性(P均0.05)。對不同年齡WKY組間心肌細胞凋亡進行比較分析，結(jié)果顯示不同年齡WKY組凋亡陽性心肌細胞核數(shù)目和心肌細胞凋亡指數(shù)差異均無顯著性(1)。1不同月齡組SHR和WKY左心室心肌TUNEL染色,中呈棕黃色染色

20、的心肌細胞核為凋亡陽性的心肌細胞核(×400)注:A:1月齡SHR(NLVH)組,Ac:1月齡WKY組;B:10月齡SHR(LVH)組,Bc:10月齡WHY組;C:1820月齡SHR（CHF）組，Cc：1820月齡WKY組表1實驗動物體重、心室肥厚和CHF病理特征(±s)組別動物數(shù)BW(g)SBP(mm Hg)HR(beats/min)LVW/BW(mg/g)RVW/BW(mg/g)漿膜腔積液心房血栓WKY組1月齡649.60±4.97-1.59±0.080.40±0.030/60/610月齡6315.73±62.49133.20&#

21、177;4.37352.70±24.291.53±0.280.43±0.080/60/61820月齡5395.12±66.21139.22±7.82380.80±34.881.71±0.270.44±0.060/50/5SHR組1月齡(NLVH)649.93±2.00-1.72±0.080.43±0.030/60/610月齡(LVH)6269.21±63.70206.25±18.54?360.88±34.223.13±0.27*0.68±

22、;0.080/60/61820月齡(CHF)5362.28±23.97165.40±13.50+452.40±69.17*4.07±0.21*1.38±0.035/55/5注：與10月齡WKY組比較，?P<0.01;與10月齡SHR組和1820月齡WKY組比較，*P<0.05；與1820月齡WKY組比較，+P<0.01；與1月齡SHR組比較，P<0.01；與1月齡SHR組和10月齡SHR組比較，P<0.01。1 mm Hg=0.133 kPa 表2不同年齡SHR和WKY心肌細胞凋亡的變化(±s)組別動物數(shù)

23、陽性細胞核/HPF陽性細胞核/總細胞核(%)1月齡SHR(NLVH)組6269.70±42.49*38.43±10.73*1月齡WKY組632.83±21.094.12±2.0310月齡SHR(LVH)組616.07±10.83+2.16±1.29+10月齡WKY組641.13±22.855.51±2.251820月齡SHR(CHF)組5282.12±40.1943.93±11.511820月齡WKY組541.40±21.616.05±2.20注：與1月齡WKY組比較，?P&

24、lt;0.01；與1820月齡WKY組比較，P<0.01；與10月齡WKY組比較，+P<0.01；與10月齡SHR組比較，P<0.01 3.SHR心肌細胞凋亡與LVH的關(guān)系:對伴有顯著LVH的SHR的心肌細胞凋亡指數(shù)與左心室心肌肥厚指數(shù)進行直線回歸分析，結(jié)果顯示二者間呈顯著負相關(guān)(n6,r-0.90，P0.01；n5，r-0.87，P0.01)。4.心肌細胞超微結(jié)構(gòu)檢查:1月齡WKY、10月齡WKY和1820月齡WKY組心肌細胞的細胞膜、細胞漿、細胞器和細胞核結(jié)構(gòu)均正常。1月齡SHR(NLVH)組和1820月齡SHR(CHF)組可見心肌細胞胞質(zhì)變深(胞質(zhì)濃縮)和胞核染色質(zhì)濃聚

25、邊集(核固縮)等心肌細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征。在凋亡的心肌細胞,可見線粒體明顯腫脹且空泡化。 10月齡SHR（LVH）組和1820月齡SHR(CHF)組可見心肌細胞肥大、心肌肌漿網(wǎng)擴張和心肌線粒體增生等改變。10月齡SHR(LVH)組均未見心肌細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征和心肌細胞線粒體腫脹和空泡化(25)。討論大鼠長期壓力超負荷和增齡對心肌細胞的作用在許多方面與人類高血壓病相似，對SHR心肌肥厚和心力衰竭發(fā)病機制及其防治的研究必將為探明人類高血壓病心肌肥厚和心力衰竭的發(fā)病機制及其臨床防治措施提供有益的實驗依據(jù)。本研究以不同年齡SHR為研究對象，顯示SHR心肌肥厚和心力衰竭的實驗?zāi)Ｐ褪强尚械?。心臟是高血

26、壓主要的靶器官之一。高血壓長期慢性壓力超負荷必將引起心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變(即心臟重塑)，心臟結(jié)構(gòu)的改變主要為LVH，心臟功能的改變主要為心力衰竭。高血壓心臟重塑的機制至今尚未完全闡明，有學(xué)者認為主要與心肌細胞機械應(yīng)力增加和多種神經(jīng)-體液因素及心血管組織旁分泌自分泌因子的參與有關(guān)4。然而,國外最近研究表明，高血壓主要靶器官(心、腦、腎)中均存在細胞凋亡現(xiàn)象，推測心肌細胞凋亡可能在高血壓心肌肥厚和心力衰竭發(fā)病中起重要作用5，為人們從全新的角度來認識高血壓、心肌肥厚和心力衰竭的發(fā)病機制提供了新的思路。本實驗采用TUNEL POD法2檢測SHR LVH前、LVH時和CHF后左心室心肌組織石蠟切片中的心

27、肌細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，SHR組LVH前心肌細胞凋亡顯著增加， 當(dāng)發(fā)生明顯LVH后心肌細胞凋亡顯著減少，而在存在明顯CHF時心肌細胞凋亡又顯著增加。電鏡下心肌細胞超微結(jié)構(gòu)檢查也證實SHR LVH前和發(fā)生CHF后左心室心肌標(biāo)本中存在心肌細胞胞質(zhì)變深(胞質(zhì)濃縮)和胞核染色質(zhì)濃聚邊集(核固縮)等心肌細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，而SHR LVH時則未見上述心肌細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，但可見心肌細胞肥大、心肌肌漿網(wǎng)擴張和心肌線粒體增生等超微結(jié)構(gòu)改變。我們將伴顯著LVH的SHR的心肌細胞凋亡指數(shù)與左心室心肌肥厚指數(shù)進行直線回歸分析， 結(jié)果顯示二者間呈顯著負相關(guān)， 進一步證實心肌細胞凋亡不足與SHR的LVH有關(guān)。

28、提示心肌細胞凋亡在SHR心臟重塑方面起重要作用，心肌細胞凋亡減少可能與LVH有關(guān)，而心肌細胞凋亡增多可能與CHF有關(guān)；在SHR高血壓LVH心力衰竭演進過程中其心肌細胞增生與凋亡的程度不同，可能存在明顯的心肌細胞增生與凋亡的時間窗。心肌細胞增生為主的時間窗可能為SHR出生后至1個月以內(nèi)和5個月至17個月之間而心肌細胞凋亡為主的時間窗可能為1個月至4個月之間和18個月以后。SHR早期發(fā)生LVH之前出現(xiàn)短暫心肌細胞凋亡增多的機制目前尚不清楚,我們推測可能與心臟對心肌細胞增生過度的代償性反應(yīng)(即代償性心肌細胞凋亡增多)有關(guān)5-9。此時的心肌細胞凋亡增多可能是繼發(fā)性的心肌細胞凋亡增多。當(dāng)代償性心肌細胞凋

29、亡無法對抗SHR的心肌細胞增生時,心臟的適應(yīng)性反應(yīng)就會發(fā)生逆轉(zhuǎn)而進入心肌細胞增生、肥大和原發(fā)性心肌細胞凋亡不足，出現(xiàn)LVH5,6。SHR長期慢性壓力超負荷時心肌細胞凋亡再次被觸發(fā),造成過度代償肥厚的心臟心肌細胞的逐漸丟失，最終導(dǎo)致心力衰竭的機制目前仍未完全闡明。結(jié)合國外新近報道，我們認為心力衰竭發(fā)生可能與過度代償肥大的心肌細胞相對缺血缺氧和多種細胞凋亡相關(guān)基因表達失調(diào)有關(guān)。心臟過度肥厚時,其單位面積的毛細血管數(shù)目顯著減少6,10,使心肌細胞處于相對缺氧狀態(tài)，而缺氧肯定可以直接或通過刺激Fas抗原mRNA和其他多種細胞凋亡相關(guān)基因(如c-myc、c- fos、hsp70、p53和WAF-1等基因

30、)的表達誘導(dǎo)心肌細胞凋亡,造成原發(fā)性心肌細胞凋亡增多7,11，12。心肌細胞超微結(jié)構(gòu)檢查還發(fā)現(xiàn)，在SHR LVH前和發(fā)生CHF后的凋亡心肌細胞中存在線粒體明顯變性、腫脹且空泡化，而SHR LVH時則無這種變化，提示線粒體功能障礙也可能是SHR心肌細胞凋亡的機制之一。心臟無肥厚時也出現(xiàn)線粒體上述改變的原因目前尚不清楚，有待進一步研究。由于高血壓不同時期心肌細胞增生與凋亡的程度和心肌細胞凋亡的性質(zhì)(原發(fā)性或繼發(fā)性)不同，因此，在制定高血壓治療方案時，必須考慮細胞增生與凋亡時間窗的存在及細胞凋亡的性質(zhì)，以便更為恰當(dāng)?shù)夭捎么碳せ蛞种萍毎蛲龅姆椒▉砀鼮橛行У馗纳聘哐獕喊衅鞴贀p害和心血管重塑。21月齡S

31、HR(NLVH)組和1820月齡SHR(CHF)組凋亡心肌細胞電鏡超微像：核染色質(zhì)濃聚邊集(×12 000)31月齡SHR(NLVH)組和1820月齡SHR(CHF)組凋亡心肌細胞電鏡超微像：胞膜完整，胞質(zhì)濃縮，線粒體增生、&127;腫脹且空泡化(×5 000)410月齡SHR(LVH)組和1820月齡SHR(CHF)組肥大心肌細胞電鏡超微像：心肌細胞肥大，肌漿網(wǎng)擴張，線粒體增生(×10 000)5年齡配對的WKY(對照)組正常心肌細胞電鏡超微像(×12 000)作者單位：400016 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科(本文1見插頁第1頁)參考文獻

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