生物蛋白純化

1、生物蛋白純化生物蛋白純化1引言親和層析的原理是：生物分子間存在很多特異性的相互作用，它們之間都能夠?qū)Ｒ欢赡娴慕Y(jié)合，這種結(jié)合力就稱為親和力。親和層析就是通過(guò)將具有親和力的兩個(gè)分子中一個(gè)個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體，配體和基質(zhì)是共價(jià)結(jié)合的，構(gòu)成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑。親和層析時(shí)首先選擇與待分離的生物大分子有親和力的物質(zhì)作為配體，并將配體共價(jià)結(jié)合在適當(dāng)?shù)牟蝗苄曰|(zhì)上。將制備的親和層析劑裝柱平衡，當(dāng)樣品溶液通過(guò)親和層析柱的時(shí)侯。待分離的生物分子就與配體發(fā)生特異性結(jié)合，從而留在固定相上；而其它雜質(zhì)不能與配體結(jié)合

2、，仍在流動(dòng)相中，并隨洗脫液流出，這樣層析柱中就只有待分離的生物分子。通過(guò)適當(dāng)?shù)南疵撘簩⑵鋸呐潴w上洗脫下來(lái)，就得到了純化的待分離物質(zhì)。親和層析的優(yōu)點(diǎn)是它分離蛋白經(jīng)常只需要經(jīng)過(guò)一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜生物蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái)，而且純度很高。此外蛋白在純化過(guò)程中得到濃縮，結(jié)合到親和配基后，性質(zhì)更加穩(wěn)定，其結(jié)果提高了活性回收率。它可以減少純化步驟，縮短純化時(shí)間，對(duì)不穩(wěn)定的蛋白純化十分有利。3 / 142材料2.1材料和試劑2.1.1菌株與質(zhì)粒大腸桿菌BL21(DE3),Genscript保藏；表達(dá)載體pColdTF,Genscript保藏；pColdTF-Cementprotein,

3、Genscript構(gòu)建。2.1.2主要試劑NiTDA親和層析凝膠：Genscript生產(chǎn)；LB液體培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白陳(Tryptone)10g/L,酵母提取物(Yeastextract)5g/L,氯化鈉(NaCl)5g/L,用NaOH調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的pH為7.4；氨卡青霉素溶液：50Pg/mL；IPTG：0.5mmol/L：Tris-HCl：50mM,PH8.0；蛋白Marker:TIANGEN公司，MP102；LysisBuffer:50mMTris-HC1200mM：NaCl；PH8.0：WashBufferl:50mMTris-HC1200mM：NaCl；20mM咪嘎；PH8.0；

4、WashBuffer2:50mMTris-HC1200mM：NaCl；50mM咪啜；PH8.0；ElutionBuffer:50mMTris-HC1200mM：NaCl：250mM咪嗖；PH8.0：洗滌緩沖液：150mMpBS,0.5mLTween-20(0.13%),PH7.4；封閉液:脫脂奶粉(5%),PBS；蛋白電泳試劑：丙烯酰胺、甲義雙丙烯酰胺、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為上海生工公司產(chǎn)品;丙烯酰胺儲(chǔ)備液：30%(w/v)丙烯酰胺，0.8%(w/v)甲叉雙丙烯酰胺；丙烯酰胺29.2g,中又雙丙烯酰胺0.8g,加蒸僚水至100mL,用濾紙過(guò)濾后于棕色瓶中4c存放；分離膠緩沖液（1.5M/L,pH8

5、.8）：18.15gTris（分析純），用1M/LHC1調(diào)節(jié)pH至8.8,加水至100mL,4存放；濃縮膠緩沖液（0.5M/L,pH6.8）：6gTris,用1M/LHC1調(diào)節(jié)pH至6.8,加水至100mL,4存放；Tris-甘氨酸電泳緩沖液:6gTris,28.8g甘氨酸,2gSDS,加水至2L；SDS溶液（10%）：lOgSDS,加水定容至100mL,完全溶解后室溫存放：過(guò)硫酸鍍?nèi)芤篞0%）：0.1g過(guò)硫酸鐵（分析純），加1mL蒸你水溶解；5X樣品緩沖液：0.6mLTris-HCl緩沖液（Imol/L,pH6.8）、51nL50%（v/v）甘油、2mLi0%SDS、0.5mLB一藻基乙醇、

6、ImLl%（w/v）'i臭酚藍(lán)、0.9mL蒸水。4存放；12與分離膠的配制：蒸儲(chǔ)水3.5mL,30%丙烯酰胺儲(chǔ)備液（A液）4mL,分離膠緩沖液（B液）2.5mL,10%生物蛋白純化過(guò)硫酸鍍50同，TEMED5同；5%濃縮膠的配制:蒸憎水2.3mL,30%丙烯酰胺儲(chǔ)備液（A液）0.67mL,濃縮膠緩沖液（C液）1.0mL,10%過(guò)硫酸筱30色,TEMED5M；考馬斯克藍(lán)染色液：考馬斯克藍(lán)R-2501g,甲醇450mL,冰醋酸100mL,蒸儲(chǔ)水450mL：脫色液：甲醇200mL,冰醋酸200mL,蒸儲(chǔ)水1600mL。封閉液：5%脫脂牛奶或者20%BSA2. 1.3主要儀器PK-8D型電熱恒

7、溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）TH2-25大容量恒溫震蕩器（上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司）JY98-3D超聲細(xì)胞破碎儀（宇波新芝生物科技有限公司）GL21K高速離心機(jī)（湖南湘儀儀器有限公司）HL-2恒流泵（上海滬西分析儀器廠）IHZD-3紫外檢測(cè)儀（上海滬西分析儀器廠）TH-300梯度混合器（上海滬西分析儀器廠）5414D型臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó)Eppendrof公司產(chǎn)品）垂直板狀電泳系統(tǒng)（Bio-Rad公司產(chǎn)品）移液槍（DAIGGER）水浴鍋DK-8D（上海一恒儀器）3 / 14生物蛋白純化3方法與步驟3. 1Cementprotein重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化不1）取重組質(zhì)粒；pColdTF-Ceme

8、ntprotein仲1于100R1感受態(tài)細(xì)胞BL21中，冰浴30min；2）42水浴熱激90s；3）立即放置冰上冰浴3min：4）加入600M37預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，搖床震蕩培養(yǎng)30min：5）12000rpm離心2min,棄400M培養(yǎng)基，剩約200間，混勻菌體,涂布平板（A）37c過(guò)夜培養(yǎng)；3.2Cementprotein優(yōu)化與表達(dá)鑒定41）取5支4mlLB試管培養(yǎng)基分別標(biāo)記對(duì)照、1、2、3。2）其中對(duì)照中加入50ul葡萄糖，對(duì)照、1、2、3,分別加入4ulA,從平板中挑取5個(gè)白色菌落。分別加入5支試管。3）對(duì)照、1、2、37c搖床培養(yǎng)，待0D=0.6時(shí)，加4ulIPTG,37,誘導(dǎo)培養(yǎng)

9、4h；4） 4號(hào)試管37c搖床培養(yǎng)，待0D=0.6時(shí),加2uHPTG,15,過(guò)夜誘導(dǎo)12h；5）取4只EP管分別標(biāo)記對(duì)照、1、2、3。6）從試管中取200ul菌體，依次加入EP管中。7） llOOOrpm,4min,4c離心4min,去上清。8）沉淀用15NlTris重懸；再加入15同2XLoadingBuffer,沸水煮15nlin,離心，SDS-PAGED51電泳檢測(cè)。3.3Cementprotein可溶性分析1）取4支1.5mlEP管標(biāo)記1-沉淀、1-上清、3-沉淀、3-上清、取表達(dá)鑒定的1號(hào)管和3號(hào)管菌液分別加入1-沉淀、3-沉淀，5000rpm,3min,離心去上清，沉淀用200ul

10、Tris重懸。2）超聲破碎冰水浴引（間歇時(shí)間：3s;工作時(shí)間：3s；全程時(shí)間：10min；）o3） 5000rpm,3min,離心，上清液分別倒入上清、3-上清中，1-沉淀、3-沉淀中沉淀用200ulTris重懸，4支EP管各加入200ul2XLoadingBuffer混勻沸水浴15分鐘。4） 4支EP管各取8ul進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。3.4Cementprotein擴(kuò)大培養(yǎng)1）接種，1%的接種量，接種到41nL液體LB培養(yǎng)基中，30,200rpm，搖床培養(yǎng)過(guò)夜，即種子液；2）轉(zhuǎn)接，4mL的種子液轉(zhuǎn)接到1LLB搖瓶，并向其中加入800M的A*,37,180rpm搖床震蕩培養(yǎng)4h：3）誘導(dǎo)，

11、1L培養(yǎng)基加入400同的IPTG,于15搖床內(nèi)，180rpm,過(guò)夜誘導(dǎo)12h；4）收菌，7000rpm,7min,4離心收集菌體，收集的菌體放于-20備用。3. 5蛋白R(shí)AC-22的純化3.5. 1.超聲破碎：1）1L培養(yǎng)液菌體用30血±丫515811££01'重懸，將菌液置于冰水中，超聲破碎（間歇時(shí)間：3s;工作時(shí)間:3s；全程時(shí)間：15min；）；3.5.2. 菌體分離：卬1）破碎液11000RPM離心15分鐘。取上清。C.Ni柱純化蛋白1）裝柱：將層析柱洗凈，用去離子水潤(rùn)洗柱子及管道，用適量的Ni-IDA介質(zhì)（5ml）裝入層析柱中；2）平衡：靜置完成

12、后，用LysisBuffer平衡介質(zhì)至紫外檢測(cè)儀示數(shù)穩(wěn)定；3）上樣：上清液以Iml/min的速度上樣；4）洗雜：上樣完成后，先用LysisBuffer洗滌；而后用WashBufferl洗滌雜蛋白至紫外檢測(cè)儀數(shù)值趨于穩(wěn)定。并收集樣品。標(biāo)記“20”。再用WashBuffer2洗滌至紫外檢測(cè)儀數(shù)值趨于穩(wěn)定。并收集樣品，標(biāo)記“50”。5）洗脫：用£山近。疝成£6洗脫目標(biāo)蛋白，當(dāng)紫外檢測(cè)儀的示數(shù)開(kāi)始變化后，取20ul加入350ul的G250中觀察顏色變化。當(dāng)有G250由棕色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)，開(kāi)始收集流出液于無(wú)菌的塑料瓶中,洗脫直至樣品不再使G250變藍(lán)并紫外檢測(cè)儀示數(shù)不再下降。3. 5.3

13、透析卬:1）取2000ml透析液，將洗脫所得的溶液裝入透析袋中，4,過(guò)夜透析12h,4. 5.4.蛋白復(fù)性：將蛋白稀釋至100ul/ml的速度加入20倍體積的0.1M磷酸鹽緩沖液.菌液于7000RPM,離心20分鐘.取上清。5. 5.5.蛋白濃度和純度的檢測(cè)1）蛋白濃度測(cè)定,取3mlG250,加入比色皿中。A調(diào)100%,T調(diào)零。取透析所得的蛋白溶液，50ul加入3MLG250中混勻，待分光光度計(jì)數(shù)值不再變化，記錄數(shù)值。6. 電泳檢測(cè)蛋白純度，將蛋白電泳圖片經(jīng)專業(yè)軟件測(cè)定蛋白純度。取樣，取10N1電泳。3.6.蛋白印記檢測(cè)（Westernblot）1013. 6.1電泳1）取樣,取1011,SD

14、S-PAGE電泳。4. 6.2轉(zhuǎn)膜1）準(zhǔn)備4-6張濾紙和1張PVDF膜或C膜。戴一次性PE手套，避免手上的蛋白污染膜。轉(zhuǎn)膜前，NC膜要置于去離子水中浸泡Imin；PVDF膜應(yīng)在中隧溶液中浸泡20min。2）在轉(zhuǎn)移液里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒或滴管、濾紙和浸過(guò)的膜。3）取出SDS-PAGE膠將濃縮膠輕輕刮去。將膠在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5分鐘左右，以平衡離子強(qiáng)度。4）打開(kāi)平放底部黑色電極（陰極），放一張海綿墊片，搟氣泡。于海綿墊片上放置2-3張用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過(guò)的濾紙，逐張疊放，對(duì)齊，搟氣泡。取出浸在轉(zhuǎn)膜液中的凝膠平放于濾紙上，排除所有氣泡。將PVDF膜或NC膜置于聚丙烯酰胺凝膠上，排除

15、所有氣泡。在膜上蓋上2-3張轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過(guò)的濾紙，排除所有氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，放上另一張或兒張海綿墊片，蓋上陽(yáng)極板（白色），夾緊。保證對(duì)凝膠有一定的壓力。5）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中。轉(zhuǎn)膜在冰上進(jìn)行，用磁力攪拌器攪拌。用恒壓60V或恒流200mA轉(zhuǎn)移2h-2h30min。3. 6.3轉(zhuǎn)膜免疫反應(yīng)1）取膜，將膜正面超上在PBST溶液中搖動(dòng)五分鐘，移至含有封閉液的平皿中，室溫脫色搖床上4度靜置過(guò)夜。2）取出膜在PBST溶液中洗5分鐘，放入含有一抗的PBST緩沖液中，室溫下孵育L5h后，用PBST在室溫下脫色搖床上洗四次，每次5min：3）膜放入含有二抗的PBST溶液中，室溫下孵育L5h后，用P

16、BST在室溫下脫色搖床上洗四次，每次5min：再用PBS洗二次，每次5min,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。4. 6.4化學(xué)發(fā)光，顯影，定影1）將A和B兩種試劑（Genscript公司HRP標(biāo)記的底物）在離心管中上等體積混合，避光保存；用紙巾吸去印跡膜邊緣或者邊角部分多余的液體，正面朝上置與平整的保鮮膜上，加上以上的A、B混合液2ml,使膜正面與液體充分接觸，避光靜置3分鐘；3min后，用紙巾吸去印跡膜邊緣或者邊角部分多余的液體，置與另一平整的保鮮膜上，包好，放入X-光片夾中。2）在暗室中，將IX顯影液和定影液各500nli分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X光片;用切紙刀剪裁適當(dāng)大??；把X光片放在膜上，關(guān)上

17、X-光片夾，曝光3分鐘，打開(kāi)X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。立刻將X-光片浸入定影液中，定影l(fā)Omin,用自來(lái)水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。12 / 144.結(jié)果與分析4. 1.Cementprotein的表達(dá)鑒定11挑取菌落至4mL培養(yǎng)基培養(yǎng)，標(biāo)記對(duì)照、1、2、3,搖床培養(yǎng)當(dāng)ODw產(chǎn)0.6時(shí)加入4U1IPTG,而后對(duì)照、1、2、37c誘導(dǎo)4小時(shí)，3號(hào)試管15c過(guò)夜誘導(dǎo)12h,離心收集菌體，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。Cementprotein表達(dá)鑒定檢測(cè)圖1.1如圖所示，根據(jù)專業(yè)用 無(wú)目的蛋白的表達(dá)，1 誘導(dǎo)58kd處也有明顯望對(duì)照1

18、23 MlOOkd 75kd5Okd32kd25kd15kd3kdo對(duì)照組沒(méi)有58kd處 條帶。3號(hào)為15、過(guò)夜圖1.lCementprotein64P-BAl蛋白表達(dá)鑒定Lanel：對(duì)照l(shuí)ane2：1.號(hào)Lane3：2號(hào)lane4：3號(hào)Lane5：M4. 2.Cementprotein的可溶性分析取上述1號(hào)管3號(hào)管菌液400ul分別加入2支EP管中，離心去上清，沉淀用200ulTris重懸。冰水浴超聲破碎。離心，上清液取樣電泳，沉淀用200ulTris重懸，電泳。Cementprotein可溶性分析檢測(cè)圖3.2如圖所示,1-上清1-沉淀3-上清3-沉淀MlOOkd 75kd5Okd32kd2

19、5kd15kd因?yàn)榈鞍自谏锨逯谢钚暂^高，這意味著雷片不施圻怒索高.易行和坤休結(jié)合.苑伊昕俎雷白在枇櫛高.而15、過(guò)夜誘導(dǎo)蛋白圖1.2Cementprotein64P-BAl蛋白可溶性分析導(dǎo)。這就是所謂的優(yōu)先Lanel：對(duì)照l(shuí)ane2：1號(hào)Lane3：2號(hào)lane4：3號(hào)Lane5：M4. 3.Cementprotein的分離純化本實(shí)驗(yàn)采用NiTDA親和層析一步純化蛋白金團(tuán)ehtprotein,最終得到的融合蛋白純度能達(dá)到90%以上，Cementprotein的分離純化檢測(cè)圖lOOkd 75kd50kd32kd25kd15kd圖1.3Cementprotein64P-BAl蛋白純化檢測(cè)圖Lane

20、l：全菌lane2：上清Lane3：流出lane4：20Lane5：50Lane5：250如圖所示Lanel為全菌破碎后蛋白條帶58KD處有明顯表達(dá)條帶；Lane2為上清中蛋白條帶58KD處有明顯表達(dá)條帶；lane3為上清過(guò)柱后流出條帶；融合蛋白表達(dá)條帶降低很多，說(shuō)明融合蛋白大量掛柱；Lane4為20mm咪唾洗滌后流出有雜質(zhì)和部分融合蛋白洗出；Lane5為50mm咪唾洗滌后流出有雜質(zhì)和部分融合蛋白洗出；Lane6為250mm咪啜洗脫后流出融合蛋白被大量洗脫，且濃度和純度很高。5. 4.Cementprotein的WesternbIot檢測(cè)Cementprotein的WesternbIot檢測(cè)圖

21、圖L4Cementprotein的Westernblot檢測(cè)圖如圖WesternbIot檢測(cè)58批婚拈a鈉i包南帶融流蹶物化得到蛋白為實(shí)驗(yàn)預(yù)期純化的融合蛋白。5結(jié)論5.1. 本實(shí)驗(yàn)利用Ni離子與咪陛基特異的親和性,使螯和有Xi離子的親和層析柱可以用來(lái)純化含有組氨酸的融合蛋白，在Cementprotein經(jīng)過(guò)重組后，融合蛋白帶上了HIS標(biāo)簽,在純化時(shí)可以特異性結(jié)合在層析柱上，用含高味陛的ElutionBuffer溶液使蛋白Cementprotein與雜蛋白分開(kāi)由電泳的檢測(cè)結(jié)果可知，用這種簡(jiǎn)單、快捷的一步純化的方法,能夠得到達(dá)到電泳純的蛋白，而HIS標(biāo)簽并不影響蛋白Cementprotein的活性

22、；5.2. 重組后的蛋白Cementprotein雖然很穩(wěn)定，但在純化的過(guò)程當(dāng)中還要使蛋白溶液始終保持在低溫冰浴的環(huán)境中。接觸到蛋白的容器一定要滅菌干凈，避免雜菌的污染；6. 3.在用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)先做一個(gè)濃度梯度，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)終濃度在ImM,溫度為37,時(shí)間為4h,融合蛋白產(chǎn)生量最多，但易形成包涵體。終濃度為0.5mM,溫度為15C,時(shí)間為12h,上清中融合蛋白增多。參考文獻(xiàn)14趙永芳編著。生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用（第二版）。武漢大學(xué)出版社.E2SvenLofdal,BengtGuss,MathiasUhlen,LennartPhi1ipson,andMartinLindberg.geneforStreptococcalProteinG.Proc,Natl,Acad,Sci,USA,Vol.80,pp697-701,Februaryl9833范代娣，沈立新，米玨編著。重組蛋白分離與分析o化學(xué)工業(yè)出版社，4（德）R.M.Kamp,（德）B,Wittmann-Liebold,（希臘）T.Choli-Papadopoulou。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析:制備，鑒定與微量測(cè)序,北京科學(xué)出版社5phyllis»nanodb,蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)6葉