實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理和實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理和實(shí)驗(yàn) 所屬分類:基因檢測(cè).更多見(jiàn) 無(wú)論是對(duì)遺傳?。ㄈ绲刂泻Ｘ氀脱巡。?、傳染病（如肝炎和艾滋 ?。┗蚰[瘤進(jìn)行基因診斷，還是研究藥物對(duì)基因表達(dá)水平的影響， 或者監(jiān)控藥物和療法的治療效果，定量PCR技術(shù)都可以發(fā)揮很大作用。定量PCR技術(shù)的最新進(jìn)展是實(shí)時(shí)熒光定量。該技術(shù)借 助于熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè) PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方 面還可以做到 PCR每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增 曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)， 做到了真正意義上的 DNA定量。這是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。根據(jù)最終得到的數(shù)據(jù)不同，定量 PCR可以分為相對(duì)定量和 絕對(duì)定

2、量 兩種。典型的相對(duì)定量如比較經(jīng)過(guò)不同方式處理的兩個(gè) 樣本中基因表達(dá)水平的高低變化，得到的結(jié)果是百分比；絕對(duì)定量則需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量PCR又可以分為TaqMan探針和SYBR Green I熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術(shù)在原理上 更為嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)更為精確；熒光染料技術(shù)則成本更為低廉， 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)便。在選擇實(shí)驗(yàn)方案時(shí)要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?duì)數(shù)據(jù)精度的要求來(lái)決定。定量實(shí)驗(yàn)與定性實(shí)驗(yàn)最大的不同，是要考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)要求并對(duì) 數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的校正，以消除偶然誤差。因此重復(fù)實(shí)驗(yàn)和設(shè)立內(nèi) 對(duì)照非常重要。由于各種各樣的客觀原因， 這一點(diǎn)在實(shí)踐中往往

3、 被輕視或忽視，需要著重強(qiáng)調(diào)。當(dāng)然，與定性實(shí)驗(yàn)一樣，定量 PCR也要設(shè)立陰性和陽(yáng)性對(duì)照，以監(jiān)控試劑和實(shí)驗(yàn)操作方面可能 出現(xiàn)的問(wèn)題。1為什么終點(diǎn)定量不準(zhǔn)確？我們都知道理論上 PCR是一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程，但是實(shí)際 的PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因?yàn)殡S著PCR循環(huán)的增多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效 率越來(lái)越低，產(chǎn)物增長(zhǎng)的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進(jìn)入了平臺(tái)期。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互 作用，不同的PCR反應(yīng)體系進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)機(jī)和平臺(tái)期的高低 都有很大變化，難以精確控制。所以

4、，即使是重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各種條 件基本一致，最后得到的 DNA拷貝數(shù)也是完全不一樣的，波動(dòng) 很大（圖1 ）。圖1同一個(gè)樣本重復(fù)96次PCR的擴(kuò)增曲線傳統(tǒng)的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的 光密度掃描等，測(cè)定的都是 PCR的終產(chǎn)物，而不是起始 DNA拷 貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系， 所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始 DNA拷貝數(shù)。對(duì)于絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，比如甲肝的診斷、藥物療效的監(jiān)測(cè)等， 需要測(cè)定的都是PCR放大之前標(biāo)本中的DNA原始拷貝數(shù)，經(jīng)過(guò) PCR擴(kuò)增以后的DNA拷貝數(shù)已經(jīng)不能反映真實(shí)情況。在這種情 況下，就不能采用終點(diǎn)定量，而要根據(jù)CT值確定DNA起

5、始拷貝 的數(shù)量。2為什么CT值與起始模板拷貝數(shù)成線性關(guān)系？CT值的定義是PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入 指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。 從圖1的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中可 以直觀地看到，盡管平臺(tái)期 DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大，CT值卻是相 對(duì)固定的。如果用不同濃度的 DNA作PCR,可以看出DNA濃度 越高，CT值越小。DNA濃度每增加1倍，CT值減小1個(gè)循環(huán)。 CT值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。這一結(jié)論可以從數(shù)學(xué)上嚴(yán)格證明。為使表達(dá)式簡(jiǎn)便，以下推導(dǎo)忽略PCR效率等細(xì)節(jié)。如果考慮這些因素，可以在方程上增 加修正項(xiàng)。這些修正項(xiàng)的增加并不改變方程的線性性質(zhì)。一般，我們有 Rn=RB+X0(1+EX

6、)nRS,也就是說(shuō)第n次PCR 循環(huán)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度(R n)等于背景信號(hào)強(qiáng)度(RB)加上每個(gè)分 子的熒光強(qiáng)度(即單位熒光強(qiáng)度，RS)與分子數(shù)目的乘積。當(dāng)循環(huán) 次數(shù)n = CT 時(shí)，則有 RT=RB+X0(1+EX)CTRS。兩邊取對(duì)數(shù)， 得 log(RT -RB) = logXO + CTIog(1+ Ex) + logRs。整理此式，CTIog(1+ Ex) = - logX0 + log(RT -RB)-logRs._ bg 用占 i b- log %1 = 一噸+巧)陶(“E工)所以對(duì)于每一個(gè)特定的 PCR反應(yīng)來(lái)說(shuō)，EX、RT、RB和RS 都是常數(shù)，所以CT值與log X0成反比，也就

7、是說(shuō)，CT值與起 始模板拷貝數(shù)(X0)的對(duì)數(shù)成反比，起始 DNA濃度每增加1倍， CT值減小1個(gè)循環(huán)。根據(jù)CT值的定量是精確和嚴(yán)格的，而傳統(tǒng)的終點(diǎn)定量則比較粗放。如果讀者有興趣的話，也可以假設(shè) PCR的效率(即Ex)為 100%，從上式推算出定量 PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的最佳斜率和 CT值的 最佳范圍。3怎樣確定CT值？實(shí)驗(yàn)操作中，CT值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測(cè)到的統(tǒng)計(jì) 學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時(shí)所對(duì)應(yīng)的 PCR循環(huán)次數(shù)（圖2）?！盎€上 方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn) 偏差的10倍。閾值所在的橫線與 PCR擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)所指的 PCR循環(huán)次數(shù)就是CT值?；€范圍的定義是從第 3

8、個(gè)循環(huán)起到 CT值前3個(gè)循環(huán)止，其終點(diǎn)要根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)的具體數(shù)據(jù)調(diào)整， 一般取第3到第15個(gè)循環(huán)之間。早于3個(gè)循環(huán)時(shí)，熒光信號(hào)很 弱，扣除背景后的校正信號(hào)往往波動(dòng)比較大，不是真正的基線高度；而在CT值前3個(gè)循環(huán)之內(nèi)，大多數(shù)情況下熒光信號(hào)已經(jīng)開 始增強(qiáng)，超過(guò)了基線高度，都不宜當(dāng)作基線來(lái)處理。圖2CT值和閾值顯然，CT值取決于閾值，閾值取決于基線，基線取決于實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，CT值是一個(gè)完全客觀的參數(shù)。CT值越小，模板DNA 的起始拷貝數(shù)越多；CT值越大，模板DNA的起始拷貝數(shù)越少。 正常的CT值范圍在18-30之間，過(guò)大和過(guò)小都將影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 的精度。4熒光信號(hào)和定量數(shù)據(jù)的歸一化雖然大多數(shù)定量 PCR儀

9、都會(huì)自動(dòng)扣除本底，但是仍然需要 注意熒光信號(hào)強(qiáng)度和定量數(shù)據(jù)的歸一化校正，以便不同樣本之間的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以嚴(yán)格地相互比較。由于加樣操作的誤差、離心管透光性能的差異、 熒光激發(fā)效 率的差異等偶然誤差不可避免， 因此儀器收集到的原始信號(hào)必須 進(jìn)行歸一化校正，以消除這些因素對(duì)定量結(jié)果的影響。 這種校正 可以通過(guò)在反應(yīng)體系中添加額外的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)，一般采用紅色ROX熒光，稱為陽(yáng)性參比信號(hào)。ROX在反應(yīng)緩沖液中的濃度 是固定的，因此其信號(hào)的強(qiáng)度與反應(yīng)體系的總體積和總的熒光激 發(fā)效率正相關(guān)。目標(biāo)基因和對(duì)照基因的信號(hào)除以陽(yáng)性參比信號(hào)以 后，即Rn = R / RROX，就可以在同樣的起點(diǎn)上進(jìn)行比較和各種 計(jì)算

10、。ROX校正可以提高定量數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性， 減少孔間差異（圖3）圖3 ROX熒光校正（左）和不校正（右）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響歸一后的熒光信號(hào)再扣除本底，就得到 DRn: DRn = Rn,樣 本-Rn,空白。DRn是最后構(gòu)建PCR實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線的縱坐標(biāo)。無(wú)論絕對(duì)定量還是相對(duì)定量，在得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，還要考慮數(shù)據(jù)之間的可比性問(wèn)題。 在實(shí)驗(yàn)操作中，取樣都是以體積或重量 為單位的，但是同樣體積或重量的樣本所來(lái)源的細(xì)胞數(shù)目并不一 樣，所以拷貝/卩L或拷貝/ng的定量數(shù)據(jù)相互之間實(shí)際上并不可 比。只有將這些數(shù)據(jù)歸一到以拷貝 /細(xì)胞或拷貝/基因組為單位 后，才可進(jìn)行嚴(yán)格意義上的比較。這種校正可以通過(guò)適當(dāng)?shù)膮⒈葋?lái)

11、完成。參比一般 選用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。由于它們?cè)诩?xì)胞中的 表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)是恒定的，受環(huán)境因素影響較小， 其定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組的數(shù)量。校正方法 為：DNA樣本/ DNAIPC，或者 DCT = CT,樣本-CT, IPC。因 為CT值與起始DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)是反比關(guān)系， 可以證明，這兩 種計(jì)算方法在數(shù)學(xué)上是等價(jià)的。為了減少誤差，目標(biāo)基因和參比基因最好在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定，所以這種對(duì)照稱為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照(In ternalPositive Control，IPC)。要進(jìn)行IPC歸一化校正，定量 PCR儀必 須具備多色檢測(cè)能力，最

12、好是 4色。否則，目標(biāo)基因和參比基因 只能分兩管作定量，就不成其為“內(nèi)”標(biāo)了。5污染的預(yù)防和熱啟動(dòng)為保證定量的準(zhǔn)確性，要預(yù)防非特異性PCR擴(kuò)增和污染。常用的措施有使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase)和熱啟動(dòng)。UNG 酶的作用原理是降解含有 dU的雙鏈或單鏈DNA。它在50 ° C激 活，95° C滅活。由于商用PCR試劑盒均以dUTP取代dTTP， 所以PCR產(chǎn)物都是含有dU的DNA鏈。在定量PCR開始前增加50 ° C的保溫步驟，UNG酶即可將已有的PCR產(chǎn)物降解破壞， 防止可能造成的污染。普通的Taq酶即使在室溫下也有一定的活性，如果不采取

13、措 施，在加入PCR試劑的過(guò)程中、正式 PCR開始前就會(huì)完成少量 PCR擴(kuò)增，增加了背景，影響定量精度。而金牌Taq酶經(jīng)過(guò)特殊 修飾，常溫下其活性部位被圭封閉， 沒(méi)有活性；只有經(jīng)過(guò)95 ° C 10min的熱啟動(dòng)以后，圭寸閉被解除，才能開始DNA鏈延伸，這樣就最大限度地減少了雜訊的生成。6標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)實(shí)驗(yàn)和陰性、陽(yáng)性對(duì)照定量實(shí)驗(yàn)，誤差是不可避免的。設(shè)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行 統(tǒng)計(jì)處理，可以將誤差降低到最小。 所以定量實(shí)驗(yàn)的每個(gè)樣本至 少要重復(fù)3次以上，嚴(yán)格的定量更應(yīng)當(dāng)重復(fù) 68次，以滿足小 樣本統(tǒng)計(jì)的要求。如果作絕對(duì)定量，則標(biāo)準(zhǔn)曲線需要在5個(gè)點(diǎn)以上。標(biāo)準(zhǔn)曲線 使用的標(biāo)準(zhǔn)品是濃度已知的

14、DNA樣本，可以自己制備，也可以購(gòu)買商品化的試 劑盒。其PCR反應(yīng)條件應(yīng)當(dāng)與未知樣本的一致，以便在同一反 應(yīng)板上同時(shí)定量。陰性對(duì)照中不加模板DNA,而以水或緩沖液代替，用于檢 驗(yàn)是否存在PCR污染。陽(yáng)性對(duì)照則用于檢驗(yàn)PCR試劑和實(shí)驗(yàn)操 作上可能出現(xiàn)的問(wèn)題。如果實(shí)驗(yàn)中設(shè)立了 IPC,則IPC既可以用 來(lái)校正數(shù)據(jù)，也可以起到陽(yáng)性對(duì)照的作用。7 TaqMan探針技術(shù)原理TaqMan探針?lè)ㄊ歉叨忍禺惖亩?PCR技術(shù)，其核心是利用 Taq酶的35 '外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合， 所以熒光信號(hào)的 強(qiáng)弱就代表了模 板的數(shù)量。在TaqMan探針?lè)ǖ亩縋CR反

15、應(yīng)體系中，包括一對(duì) PCR 引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合， 其結(jié)合位點(diǎn)在兩 條引物之間。探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R)，女口 FAM、VIC等，3 '端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q)，女口 TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被 淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在 鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其35 '外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸 收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)(圖 4)。所以，每經(jīng)過(guò)一個(gè) PCR循環(huán)，熒 光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增

16、長(zhǎng)的過(guò)程。 信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。上游引物53s下游引物5'3!圖4 TaqMan探針的熒光信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制TaqMan探針根據(jù)其3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)的不同分為兩種：普通的 TaqMan探針和TaqMan MGB探針。MGB探針的 淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán) (No n-Fluoresce nt Que ncher)，本 身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度。同時(shí)探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團(tuán)(圖5)，可以將探針 的Tm值提高10 ° C左右。因此為了獲得同樣的 Tm值，MGB 探針可以比普通TaqMan探

17、針設(shè)計(jì)得更短，既降低了合成成本， 也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高。因?yàn)樵谀０宓腄NA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長(zhǎng)的更容易設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)證明，TaqMan MGB探針對(duì)于富含 A/T的模板可以區(qū)分得更為理想報(bào)告基Minor Groove Binder滅基圖 5 TaqMan MGB 探針8 SYBR Green I熒光染料技術(shù)原理 SYBR Green I是一種只 與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料（圖 6）。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)， 發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因 此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過(guò)程是

18、：1、開始反應(yīng)， 當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。2、DNA變性 時(shí)，SYBR Green染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。3、在聚合延伸 過(guò)程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green 染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量 PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。圖6 SYBR Green I熒光染料與 DNA雙鏈的結(jié)合SYBR Green I熒光染料能與所有的 DNA雙鏈相結(jié)合，對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性，所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒 光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對(duì) PCR引物設(shè)計(jì)的特異性和PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。 在此前提下，本法是一種成本低 廉的選

19、擇。9定量PCR儀簡(jiǎn)介目前在國(guó)內(nèi)使用得比較多的熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀有美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems , ABI)的 7000、5700、7900、7700型和羅氏公司的LightCycler等。下面以ABI最新推出的7000型為例作簡(jiǎn)單介紹。7000型熒光定量PCR儀設(shè)計(jì)滿足臨床檢驗(yàn)、醫(yī)學(xué)研究和基 礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的要求，面向低通量至中等通量的用戶。隨機(jī)配置的定量PCR引物和探針設(shè)計(jì)軟件 Primer Express非常有用，因?yàn)榈侥壳?為止還沒(méi)有其他軟件有能力設(shè)計(jì)定量PCR所需的TaqMan探針'7000型有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)(Real-Time)和終點(diǎn)讀板(Plate Re

20、ad)兩種運(yùn)行模式。實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)模式用于定量，測(cè)定DNA或RNA拷貝數(shù)。7000型可以動(dòng)態(tài)顯示PCR擴(kuò)增曲線的生成，定量的線性范圍大 于7個(gè)數(shù)量級(jí)，區(qū)分5000和10000個(gè)拷貝的DNA模板可信度 達(dá)99.7%。終點(diǎn)讀板模式用于基因型鑒定、點(diǎn)突變檢測(cè)和單核苷 酸多態(tài)性(SNP)分析等。當(dāng)然，7000型也可以作為普通 PCR 儀使用。ABI已經(jīng)發(fā)布12萬(wàn)個(gè)商品化的定量 PCR試劑盒，覆蓋 人類全部4萬(wàn)個(gè)基因，平均每個(gè)基因 3個(gè)檢測(cè)試劑盒，為運(yùn)用 7000、7700、7900型開展課題研究創(chuàng)造了絕佳的條件。7000型最大特色是具備多色檢測(cè)能力，熒光檢測(cè)的波長(zhǎng)范圍為530590 nm，能夠有效地分辨 F

21、AMTM / SYBR? Green I、VICTM / JOETM、TAMRATM和ROXTM等熒光染料。多色熒光檢測(cè)技術(shù)為多重定量、SNP分析、基因型分型和帶陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照的 陰/陽(yáng)性分析提供了基礎(chǔ)。多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)多 個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本。7000型支持兩種定量化學(xué)：TaqMan熒光探針和SYBRGreen I熒光染料。其熔解曲線(Dissociation Curve)功能用于判斷PCR擴(kuò)增反應(yīng)是否特異，有無(wú)雜帶生成。進(jìn)一步閱讀材料基本方法1 Lie，丫. S. and C. J., Petropoulos. "Adva nces in qu

22、a ntitative PCR tech no logy: 5'nuclease assays." Curr Opin Biotechnol 9: 43-48. 1998.2 Orlan do, C., P., Pinzani, and M., Pazzagli. "Developme nts in qua ntitative PCR." Clin Chem Lab Med 36: 255-269. 1998.絕對(duì)定量 Becker K., D. Pan and C.B. Whitley. 1999. Real-time qua ntitative pol

23、ymerase cha in reacti on to assess gene tran sfer Hum. Gene Ther . 10: 2559-2566, 1999.4 de Kok, J.B., Hen driks, J.C., va n Soli nge, W.W., Willems, H. L., Men si nk, E.J., and Swin kels, D.W. Use of real-time qua ntitative PCR to compare DNA isolation methods. Clin.Chem. 44(10):2201 -2204, 1998. 5 Wang X., X. Li, R.W. Currie, R.N. Willette, FC. Barone and G.Z. Feuerste in. Applicatio n of real-time pol