土壤生態(tài)學實驗指導

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上土壤生態(tài)學曹志平 胡菊編2007年10月24日資源環(huán)境學院生態(tài)系實驗-1實驗-4實驗-6實驗四、氯仿薰蒸浸提法測定土壤微生物生物量碳實驗目前國際上通常采用的有直接計數(shù)法和間接計數(shù)法兩種。直接計數(shù)法（direct counting method），顧名思義，就是對土壤中的原生動物不進行培養(yǎng)，而是取一定量的新鮮土壤，加一定量的水或土壤浸出液，搖勻后即進行鏡檢，得到土壤原生動物豐度（單位重量土壤中的原生動物個數(shù)）。間接記數(shù)法主要是培養(yǎng)記數(shù)法。鑒于土壤這一特定環(huán)境，土壤原生動物種類都能形成胞囊，以渡過土壤干旱環(huán)境。風干后土壤原生動物形成的胞囊，用培養(yǎng)的方法誘導脫開胞囊，以推知

2、其種類和數(shù)量分布。在培養(yǎng)過程中一切器皿、培養(yǎng)基均經高壓滅菌，接種時也應避免塵埃落入，以確保培養(yǎng)不受污染。本實驗主要采用Singh（1995）和Stout（1962）的“3級10倍”環(huán)式稀釋法。儀器、設備和材料烘箱、培養(yǎng)箱、滅菌鍋、培養(yǎng)箱、鑷子、玻璃環(huán)、三角瓶、燒杯等。方法與步驟 1土樣采集土壤原生動物很難直接從土壤、水體中采集，要通過室內培養(yǎng)。土壤原生動物在土壤環(huán)境干旱時，都能形成胞囊，以等待土壤水分來臨后再脫胞囊而活動。所以土壤原生動物的采集，實際上是采集土壤樣品，帶回實驗室進行培養(yǎng)而取得標本。 由于原生動物在土壤中的分布是不均勻的，因此在一個采樣區(qū)內，需采集10個采樣點。用圓形采樣器取土樣

3、，把土樣放入鋁盒帶回室內。在培養(yǎng)之前，需測定土樣含水量。2 稀釋土樣2克風干土樣（如有條件，也可以直接用濕土）加18毫升無菌水，充分振蕩，可用超聲波儀粉碎土壤，使之與水充分混合，這時的稀釋度為10；然后用定量吸管吸取2毫升102的土壤懸浮液，加入18毫升無菌水，充分搖勻，此時稀釋度為103。依此法逐級稀釋，即可得到103、104、105、106的稀釋液。根據(jù)原生動物的豐富度選擇土壤的稀釋度，但每一定量土樣均要選擇連續(xù)的3個稀釋度，即“3級10倍”之意（圖1）。3培養(yǎng)基制備0.5克氯化鈉加1.2克瓊脂加98毫升蒸餾水（如用量較多，可按此比例增加），攪拌后在高壓滅菌鍋中加熱滅菌，然后趁熱到入培養(yǎng)皿

4、，在凝固之前插入5個內徑為1.8厘米、高為0.6厘米的玻璃環(huán)。每個土樣需6個培養(yǎng)皿30個玻璃環(huán)。4接種、培養(yǎng)和鏡檢取其中的連續(xù)3級懸浮液，搖勻后每級稀釋液各取1ml接種于各自的玻璃杯內，即1、2號培養(yǎng)皿的10個玻璃杯內各滴入1ml第一級稀釋液，同樣3、4號和5、6號培養(yǎng)皿的10個玻璃杯內分別滴入第二級和第三級稀釋液（第一、二、三級稀釋液的稀釋度是多少，則取決于研究的土壤中原生動物數(shù)目的多寡，如采用104-106稀釋度系列，則第一級稀釋液為104，第二級為105，第三級為106），置于光照培養(yǎng)箱25以下培養(yǎng)(圖1)。分別在第4、7、11天時在低倍鏡下觀察每個環(huán)中有無原生動物，按肉足蟲、鞭毛蟲、纖

5、毛蟲分別記錄。低倍鏡下可分清此三大類，但無法鑒定種類?？稍趯嶒灲Y束時，再吸出在高倍鏡或油鏡下鑒定種類。圖1 土壤原生動物定量培養(yǎng)法的稀釋和接種示意圖5 結果統(tǒng)計根據(jù)未出現(xiàn)環(huán)數(shù)，查Stout“3級10倍稀釋法”（表1）原生動物密度換算表得知每克土壤中的原生動物數(shù)量，即密度。例如，已知鞭毛蟲在30個環(huán)中有5環(huán)中未出現(xiàn)，則查表得=69.5，若稀釋度為104-106，則鞭毛蟲的密度為個/克土壤。肉足蟲和纖毛蟲的密度也同此法求得，三大類密度之和即為總的原生動物密度。這是根據(jù)微生物數(shù)量統(tǒng)計法的原理從沒有原生動物和土壤稀釋度求出最或然數(shù)（MPN），以此推斷每克風干土壤中原生動物數(shù)量。將表上查得的數(shù)量乘以土壤

6、濕度，即為每克濕土中原生動物數(shù)量。表1 “3級10倍”環(huán)式稀釋法原生動物密度換算表（Stout，1962）無原生動物的環(huán)數(shù)土壤中原生動物的個數(shù)/g10-103102-104103-1051230.32303230302160.91609160903120.4120412040491.6916916091600569.5695695069500652.0520520052000738.7387387038700829.2292292029200922.72272270227001018.01801800180001114.5145145014500121107117117011700139.42

7、949429420147.52757527520155.90595905900164.56454564560173.51353513510182.73272732730192.16212162160201.73171731730211.40141401400221.14111141140230.92992920240.74774740250.58658580260.44444440270.31331310280.20220200290.091990300.00000實驗分離線蟲方法多種多樣，主要根據(jù)分離線蟲的種類和數(shù)量、寄主植物種類、標本的固有屬性、采集時間和所分離線蟲的用途而定。本文介紹傳統(tǒng)

8、的貝曼漏斗法和經改良后的淘洗過篩離心法。（一） 貝曼漏斗法貝曼漏斗法是Baermann于1917年提出來。其本原理是：線蟲是喜水動物，遇水便會從土壤或植物組織內游出，同時由于地心引力及線蟲自身的重量，便會下沉至漏斗的管內集中。這種方法僅限分離活動性的蠕蟲型線蟲，對死蟲、不活動的線蟲和蟲態(tài)（如胞囊線蟲和根結線蟲的雌蟲）則是無效的。儀器、設備和材料貝曼漏斗：試驗裝置如圖2。常用的是直徑為8-10厘米的玻璃漏斗，漏斗管連在一段乳膠管，以止水夾（彈簧夾）控制膠管的開閉，漏斗放在或鐵架臺上或自制的木制漏斗架的圓環(huán)內。圖2 貝曼漏斗法（Baermann funnel）分離線蟲示意圖(劉維志，1995)方法

9、與步驟取土樣或含線蟲的植物材料（如根系）切成大約0.5厘米-1厘米長的小段，用四層紗布或二層高級衛(wèi)生紙（棉質）包住土樣或根樣，輕輕放入盛水的漏斗內，令水漫過、浸透，如水量不足，輕輕加水，防止沖出泥漿，經48小時，用空燒杯接在漏斗的膠管內，輕輕松開止水夾，從漏斗流出水，內含大量線蟲。關閉膠管，向漏斗輕輕補充清水，可以再次收集線蟲。（二）淘洗過篩離心法淘洗過篩離心法是在幾種最基本的分離方法上，為適應大量快速分離線蟲的要求而改進的一種方法。其基本原理是根據(jù)蟲體大小及線蟲的密度比水輕或與水的密度接近，線蟲在淘洗過程中，可浮在水面或懸浮在水中。在過篩時，依蟲體大小可以在不同篩目上收集線蟲。過篩時，往往在

10、密篩（如325目）上留有很多泥漿。為了進一步把線蟲從泥漿中分離出來，可利用比重差異，應用不同濃度的蔗糖溶液或其他制劑（密度比水大），結合離心的方法，使收集到的線蟲更加純凈。儀器、設備和材料1.儀器、設備40、60、325目篩子各一，低速離心機，100ml或大于100ml離心管，天平，250ml燒杯，臉盆，洗瓶，噴頭，試管，洗干凈的青霉素瓶。2.材料TAF固定液(三乙醇胺福爾馬林固定液)：吸取2ml 40%甲醛，7ml 三乙醇胺溶于91ml蒸餾水。蔗糖溶液：454克蔗糖溶于1000ml水中(密度1.18g/cm3,濃度為38.5%)。方法與步驟1 線蟲標本的采集。挖取植株根系，去掉5cm表土，在

11、根圍5-20cm深度取帶根土樣500cm3左右，放在大塑料袋中，在小塑料袋中放入標簽，注明采集寄主、地點、采集人，將小塑料袋放入大塑料袋中，封口后帶回實驗室。2 分離過程。淘洗程序：從40目、60目和325目篩子上過篩，40目篩內收集根系（有根結線蟲），編號后存入塑料袋內，60目篩內收集胞囊，亦存入塑料袋內，把325目篩子里的泥漿（內含線蟲）洗入燒杯（150ml左右）。離心程序：(1) 將燒杯里的泥漿倒入離心管（250ml），稱重平衡(2) 將離心管放入離心機中，1000轉/分，離心4-5分鐘。(3) 傾去上清液，加入蔗糖液（38.5%），稱重離心，15秒鐘，1000轉/分離心(4) 用燒杯收

12、集上清液，加水稀釋，防止蔗糖液滲透壓過高蟲體破裂。(5) 燒杯中的上清液在325目篩子過篩（篩子傾斜），將325目篩上的線沖洗到燒杯里，再轉入試管里將試管垂直放置，過夜（24-48小時，夏天時間短，春、秋季時間長）饑餓，把上清液用長吸管吸掉，試管底部為線蟲。3 殺死.。向試管加入熱水到60，將線蟲殺死，15分鐘。4 固定。(1) 將下部蟲液用吸管吸入青霉素瓶，加入固定液。(2) 固定一周后，再換洗固定液，永久保存。固定兩周后才能進行鑒定。實驗儀器、設備和材料1 儀器、設備干漏斗架、40瓦燈泡若干、塑料瓶、載玻片、蓋玻片、解剖鏡、挑針、吸管、顯微鏡。2 試劑霍氏封固劑（Hoyers medium

13、）：配方為阿拉伯樹膠15克，水合氯醛100克，純甘油10克，蒸餾水25毫升。該封固劑的配制按下列程序進行：先將阿拉伯樹膠（粉狀或結晶）完全溶解于蒸餾水，然后再加入水合氯醛和甘油，再經過濾去雜。為便于阿拉伯樹膠的完全溶解，可稍加大蒸餾水用量，減低了粘度也便于過濾。待濾過后將清夜置如水浴鍋上加熱以蒸發(fā)多加的水分。75%酒精：量取790ml95%乙醇用蒸餾水稀釋1000ml。方法與步驟 1土壤螨的搜集稱量250300克土樣置干漏斗帶鐵絲網的盤中，在放置盛有75%酒精的塑料瓶，注意瓶口于漏斗出口對齊，并注意補充塑料瓶中的酒精溶液防止干涸。這樣使用40瓦燈泡連續(xù)光照48小時，蓋上塑料瓶既可。2清洗保存。

14、對體表有粘附物的標本要進行清洗，用細毛筆在50%酒精中洗涮體表，剔除粘附物，但不要損壞體表結構。以上方法不能去污時，可以將標本放入封固液中，撥動標本，讓封固液粘去污物。牢固的粘附物可用超聲波震蕩儀清洗，根據(jù)蟲體大小確定清洗時間，防止蟲體被震碎。為準確觀察蟲體結構，應留下一些標本不清洗。3透明去污后的標本，必須進行透明，最常用的有效方法是用乳酸浸泡。為了縮短透明時間，可放在溫箱或燈光下加熱，透明時間根據(jù)標本大小、溫度及乳酸濃度而定。個體越大，溫度越低，乳酸濃度越低，透明時間越長。只要標本已透明，就應該將標本取出來放在7075%的酒精中保存。有些甲螨標本，體色極深，可用過氧化氫去色，但不必過份漂白

15、。4臨時玻片與永久玻片的制作臨時玻片：用蓋玻片封蓋凹玻片的半個凹孔加入乳酸，放入標本整形，調整位置，固定，馬上可以鏡檢，完成后放入酒精中保存（圖3）。永久玻片：將處理好的標本放在載玻片上，沾一小點霍氏封固液于近旁，將標本整肢，象中氣門螨類，應盡量使四足伸展，甲螨標本比較圓厚，應固定位置，讓封固液稍干后，覆上加有封固液的蓋玻片。為了更完整、準確得鏡檢，還常需解剖標本，解剖需根據(jù)標本身體結構，以甲螨為例（圖3），可先從后半體背腹溝將后背板剖開，再卸下四足、前背板、口器和基節(jié)板、腹板，依次制片。永久玻片干涸后，沿蓋玻片四周涂上一圈指甲油，以免受潮滑片。圖3 螨類標本制片法A.B.臨時封片法；C:解剖

16、標本永久制片法實驗四、氯仿薰蒸浸提法測定土壤微生物生物量碳一、采樣與樣品預處理土壤樣品的采集方法和要求與測定其它土壤性質時沒有本質區(qū)別。采集到的新鮮土壤樣品立即去除植物殘體、根系和可見的土壤動物(如蚯蚓)等,然后迅速過篩(23 mm)，或放在低溫下(24)保存。如果土壤太濕無法過篩，進行晾干時，必須經常翻動土壤，避免局部風干導致微生物死亡。過篩的土壤樣品調節(jié)到田間持水量的50%左右，在室溫下于密閉裝置中預培養(yǎng)1周，密閉容器中要放入兩個50mL的燒杯，分別加入水和稀NaOH，以保持其濕度和吸收釋放的CO2。預培養(yǎng)后的土壤最好立即分析，若需要放置一段時間，在低溫下(24)最好不要超過10d。二、方

17、法氯仿薰蒸浸提法（FE）1、方法原理土壤經氯仿薰蒸處理，微生物被殺死，細胞破裂后，細胞內容物釋放到土壤中，導致土壤中的可提取的碳大幅度增加。通過測定浸提液中全碳的含量可以計算土壤微生物量碳。浸提液中碳可用重鉻酸鉀容量法測定，也可用微量碳分析儀測定。此處介紹比較簡單的重鉻酸鉀容量方法。2、儀器及設備 培養(yǎng)箱；真空干燥器；真空泵；往復式振蕩機(速率200rev/min)；冰柜；磷酸浴。3、試劑1. 無乙醇氯仿：量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液j(H2SO4)=5%，充分搖勻，棄除下層硫酸溶液，如此進行3次。再加入50 mL去離子水，同上搖勻，棄去上部的水分，

18、如此進行5次。將下層的氯仿轉移到蒸餾瓶中，在62的水浴中蒸餾，餾出液存放在棕色瓶中，并加入約20g無水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存?zhèn)溆谩?. 硫酸鉀溶液c(K2SO4)= 0.5 mol·L-1: 稱取硫酸鉀（K2SO4,化學純）87.10g，加熱溶于去離子水中，稀釋至1L。(可加熱溶解)3. 重鉻酸鉀c(1/6K2Cr2O7)=0. 4000 mol·L-1: 稱取經130 oC烘干23h的重鉻酸鉀（K2Cr2O7，分析純）19.622g，溶于1000mL的去離子水中。其他濃度：9.811 g ,4.9055 g, 4.鄰啡羅啉指示劑：稱取鄰啡羅啉指示劑C12H8N2

19、·H2O，分析純1.49g，溶于含有0.70g FeSO4·7H2O的100mL去離子水中，密閉保存于棕色瓶中。5.硫酸亞鐵溶液c(FeSO4)=0.0333 mol·L-1：稱取硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O，化學純)9.26g，溶解于600800mL去離子水中，加濃硫酸（化學純）20mL，攪拌均勻，定容至1000mL，于棕色瓶中保存。此溶液不穩(wěn)定，需每天標定其濃度。硫酸亞鐵溶液濃度的標定 吸取重鉻酸鉀標準溶液(試劑8)5.00mL，放入100mL三角瓶中，加水約20mL,加濃硫酸5mL和鄰啡羅啉指示劑2滴，用FeSO4溶液滴定，根據(jù)FeSO4溶液的消

20、耗量即可計算FeSO4溶液的準確濃度。4、操作步驟4. 1薰蒸 稱取相當于20.0g烘干土重的濕潤土壤3份，分別放在約100 mL的燒杯中，一起放入同一干燥器中，干燥器底部放置小燒杯盛裝少量的水以保持濕度，同時放入一個裝有50mL NaOH溶液和一個裝有約50mL的無乙醇氯仿的小燒杯(根據(jù)干燥器的大小可以增加氯仿的用量，同時加入少量的直徑約為0.5mm的碎瓷片)，用少量凡士林密封干燥器，用真空泵抽氣至氯仿沸騰并保持至少2 min。關閉干燥器的閥門，在25oC的黑暗條件下放置24h。打開閥門，如果沒有空氣流動的聲音，表示干燥器漏氣，應重新稱樣進行薰蒸處理。當干燥器不漏氣時，取出裝有水、堿液和氯仿的燒杯，氯仿倒回瓶中可重復使用。擦盡干燥器底部，用真空泵反復抽氣，每一次都要打開干燥器，以加快除去氯仿的速度，直到土壤聞不到氯仿氣味為止。5. 2浸提 薰蒸結束后，將土壤全部轉移到250 mL的三角瓶中，加入40 mL 0.5mol/LK2SO4溶液，在振蕩機上振蕩浸提30min（25，185rev/min）（轉速根據(jù)儀器進行調整，必須使得土壤完全振蕩開）,過濾。薰蒸開始的同時，稱取等量土壤3份，同上用K2SO4溶液(試劑2)浸提，同時做不加土壤為空白對照。浸提液在室溫下可以放置1周，4下放置1個月或在-15oC下保存。6. 3測定 準確吸