明膠空心膠囊微生物限度檢查方法驗證試驗

1、明膠空心膠囊微生物限度檢查方法驗證試驗樣品名稱 明膠批號生產(chǎn)廠家一 、細菌、霉菌計數(shù)方法驗證1 驗證用菌種枯草芽孢桿菌 CMCC （ B） 63501 （第三代） 金黃色葡萄球菌 CMCC （ B） 26003 （第五代） 大腸埃希菌 CMCC（B） 44102（第五代） 白色念珠菌 CMCC（F） 98001（第三代） 黑曲霉 CMCC （ F） 98003（第四代）2 方法依據(jù) 中國藥典 2010 版3 操作方法3.1 菌液制備3.1.1 別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)3035 C培養(yǎng)1824小時后，分別取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草

2、芽孢桿菌的肉湯培養(yǎng)物 1ml+9ml 0.9% 無菌氯化鈉溶液， 1 0倍稀釋至 10-610-7，細菌數(shù) 為 50100cuf/ml ，做活菌計數(shù)備用。3.1.2 接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，經(jīng)2328C培養(yǎng)2448小時后，取白色念珠菌液體培養(yǎng)物 1ml+9ml 0.9% 無菌氯化鈉溶液， 10倍稀釋至 10-410-7， 菌液約為 50100 cuf/ml ，做活菌計數(shù)備用。3.1.3 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)2328 C培養(yǎng)57天后，取黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加35ml0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，吸出孢子懸液1ml+9ml 0.9%無菌氯化鈉

3、溶液，10倍稀釋至10-4，菌液約為50100 cuf/ml，做活菌計 數(shù)備用。3.2 供試液制備取供試品10g,加45C PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖，放置45C 水浴保溫使其完全溶解，搖勻，作為 1:10供試液，備用。3.3 細菌、霉菌計數(shù)驗證3.3.1 實驗組：（樣品 +菌液）取 1:10 的供試液 1ml 和 50100 個規(guī)定的試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊 脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備 2 個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。332菌液組：（純菌液）測定所加的試驗菌數(shù)。3.3.3供試品對照組：（樣品）取規(guī)定量供試液。按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。3.3.4陰

4、性對照組：（緩沖液）取0.9%無菌氯化鈉溶液，空白對照。4結(jié)果4.1實驗組的菌回收率（%）=（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)"菌數(shù)組平均菌落數(shù)x100%4.2菌落計數(shù)結(jié)果：見表一表一 驗證試驗結(jié)果（常規(guī)法） 單位（cuf/ml）菌株菌濃度（ml）試驗次數(shù)菌液組供試品對照組實驗組回收率（%）大腸埃希菌-61010-61020-61030金黃色葡萄球菌-61010-61020-61030枯草芽孢桿菌-6101010-62010-630白色念珠菌10-51010-52010-530黑曲霉10-51010-52010-530表1結(jié)果可看出：（1）采用常規(guī)法，供試品對大腸埃希菌、金黃

5、色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念球菌5種試驗菌的回收率試驗均高于70%。二、控制菌檢查方法的驗證1驗證用菌種大腸埃希菌 CMCC（ B）44102 （第四代） 乙型付傷寒沙門菌 CMCC （ B） 50094 （第四代）2 方法依據(jù) 中國藥典 2010 年版3 操作方法3.1 菌液制備分別接種大腸埃希菌、乙型付傷寒沙門菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)3035C培養(yǎng)1824小時后，分別取大腸埃希菌、乙型付傷寒沙門菌的肉湯培養(yǎng)物1ml+9ml 0.9% 無菌氯化鈉溶液， 1 0倍稀釋至 10-610-7，細菌數(shù)為 10100cuf/ml ，做活 菌計數(shù)備用。3.2 供試液制備：同細菌、霉菌計數(shù)

6、方法驗證。3.3 驗證方法3.3.1 大腸埃希菌3.3.1.1 試驗組 （樣品 + 菌液）取供試驗 10ml 及 10100cuf/ml 大腸埃希菌接種至 100ml 的增菌培養(yǎng)基中， 依相應(yīng) 大腸埃希菌檢查法進行檢查。3.3.1.2 供試品對照組 （樣品）取 10ml 供試液加至 100ml 的增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)大腸埃希菌檢查法進行檢查。3.3.1.3 陰性對照組 （緩沖液）取 PH7.0 氯化鈉 -蛋白胨緩沖液 10ml 加至 100ml 的增菌培養(yǎng)基中， 依相應(yīng)大腸埃希 菌檢查法進行檢查。3.3.1.4 菌液組 （菌液）取 10100cuf/ml 大腸埃希菌 1ml 接種至 100ml

7、 的增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)大腸埃希 菌檢查法進行檢查。3.3.2 沙門氏菌3.3.2.1 實驗組 （樣品 + 菌液）取供試品10g及10100cuf/ml沙門氏菌接種至200ml的增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)沙 門氏菌檢查法進行檢查。3.3.2.2 供試品對照組 （樣品）取 10g 供試品加至 200ml 的增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)沙門氏菌檢查法進行檢查。3.3.2.3 陰性對照組 （緩沖液）取 PH7.0 氯化鈉 -蛋白胨緩沖液 10ml 加至 200ml 的增菌培養(yǎng)基中， 依相應(yīng)沙門氏菌 檢查法進行檢查。3.3.2.4 菌液組 （菌液）取 10100cuf/ml 沙門氏菌 1ml 接種至 200ml 的增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)沙門氏菌檢 查法進行檢查。4結(jié)果見：表二及表三表二大腸埃希菌驗證試驗結(jié)果試驗次數(shù)項目試驗組供試品對照組陰性對照組1MUG陽性陰性陰性靛基質(zhì)陽性陰性陰性2MUG陽性陰性陰性靛基質(zhì)陽性陰性陰性3MUG陽性陰性陰性靛基質(zhì)陽性陰性陰性表三沙門氏菌驗證試驗結(jié)果試驗次數(shù)項目試驗組供試品對照組陰性對照組1SS有菌生長尢菌生長尢菌生長EMB有菌生長尢菌生長尢菌生長2SS有菌生長尢菌生長尢菌生