ABO血型正、反定型

1、 ABO血型正、反定型操作規(guī)程目的 保證ABO血型鑒定準(zhǔn)確，確保臨床輸血安全。適用范圍 XXX醫(yī)院輸血科職責(zé) 具有專(zhuān)業(yè)技術(shù)的工作人員主要負(fù)責(zé)本院輸血（或備血）標(biāo)本的ABO血型鑒定（但只對(duì)該單份標(biāo)本負(fù)責(zé)）。相關(guān)文件 試劑采購(gòu)、保存和使用管理程序 設(shè)備采購(gòu)、使用管理程序 消毒與清潔管理程序 標(biāo)本采集、運(yùn)輸、保存和報(bào)廢管理程序緊急用血管理程序相關(guān)記錄 儀器設(shè)備的采購(gòu)、使用和維護(hù)記錄 儀器的溫度記錄 恒溫水溫箱的換水和消毒記錄 消毒液的配置記錄 清潔消毒記錄 試劑采購(gòu)、使用記錄 標(biāo)本交接和報(bào)廢記錄 緊急用血記錄實(shí)驗(yàn)原理 ABO血型是根據(jù)紅細(xì)胞表面存在的凝集原決定的。存在A凝集原的稱(chēng)為A型，存在B凝集原

2、的稱(chēng)為B型。而血清中還存在凝集素。當(dāng)A凝集原與抗A凝集素相遇或B凝集原與抗B凝集素相遇時(shí)，會(huì)發(fā)生紅細(xì)胞凝集反應(yīng)。一般A型血清中含有抗B凝集素，B型血清中含有抗A凝集素，因此可以用標(biāo)準(zhǔn)血清中的凝集素與被測(cè)者的紅細(xì)胞反應(yīng)（稱(chēng)為正定型），用標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞與被測(cè)者血清中的凝集素反應(yīng)（稱(chēng)為反定型），以確定其ABO血型。 儀器器械 玻璃試管、玻片、記號(hào)筆、一次性塑料滴管、顯微鏡、普通離心機(jī)、試管架、恒溫水溫箱、試劑保存冰箱、標(biāo)本保存冰箱。試劑 抗A標(biāo)準(zhǔn)血清、抗B標(biāo)準(zhǔn)血清、A型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞、B型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞、O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞、生理鹽水。以上試劑均為有合格證件的正品。標(biāo)本收集與處理1受檢者血清：采集受檢者靜脈血23ml

3、，經(jīng)1000r/min離心1分鐘或室溫靜置1小時(shí)后取上清。225%的受檢者紅細(xì)胞：采集受檢者靜脈血或末梢血，用生理鹽水制成25紅細(xì)胞鹽水懸液備用，制備方法見(jiàn)本節(jié)質(zhì)量控制和注意事項(xiàng)。 3標(biāo)本出現(xiàn)中度以上溶血者，為不合格標(biāo)本，不能用于檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)方法與步驟 1.ABO血型的正定型（試管法）： 、取2支試管，分別標(biāo)上抗A和抗B； 、制備待測(cè)標(biāo)本25%的紅細(xì)胞懸液（取1支試管，加入2ml生理鹽水，再加入1滴待測(cè)標(biāo)本紅細(xì)胞，混勻備用）； 、在抗A管中加入2滴抗A標(biāo)準(zhǔn)血清，在抗B管中加入2滴抗B標(biāo)準(zhǔn)血清；、在抗A和抗B管中分別加入1滴已制備好的待測(cè)標(biāo)本25%紅細(xì)胞懸液；、混勻后，立即對(duì)稱(chēng)放入離心機(jī)中進(jìn)行10

4、00r/min離心1分鐘，或室溫靜置1小時(shí)，再輕輕搖動(dòng)試管，使沉于管底的紅細(xì)胞浮起，先肉眼觀察有無(wú)凝集現(xiàn)象，如內(nèi)眼不見(jiàn)凝集，應(yīng)將反應(yīng)物倒于玻片上，再以低倍鏡檢查。根據(jù)有無(wú)凝集現(xiàn)象判定結(jié)果如下。注意凝集強(qiáng)度，此有助于A、B亞型、類(lèi)B或cisAB的發(fā)現(xiàn)。ABO血型抗A標(biāo)準(zhǔn)血清抗B標(biāo)準(zhǔn)血清A型B型O型AB型凝集強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn) 4十 紅細(xì)胞凝集成一大塊，血清清晰透明。 3十 紅細(xì)胞凝集成數(shù)小塊，血清尚清晰。 2十 紅細(xì)胞凝塊分散成許多小塊，見(jiàn)到游離紅細(xì)胞。 1十 肉眼可見(jiàn)大顆粒，周?chē)休^多游離紅細(xì)胞。 土鏡下可見(jiàn)數(shù)個(gè)紅細(xì)胞凝集在一起，周?chē)泻芏?游離紅細(xì)胞。 MF 混合凝集外觀(mixed field)

5、是指鏡下可見(jiàn)少數(shù)紅細(xì)胞凝集，而極大多數(shù)紅細(xì)胞仍呈分散分布。 一 表示陰性，鏡下未見(jiàn)凝集，紅細(xì)胞均勻分布。2.ABO血型的反定型（試管法）：、取3支試管，分別標(biāo)上A、B和O； 、在3支試管中分別加入2滴待測(cè)標(biāo)本的血清； 、將ABO標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞輕輕地充分混勻后，在A管中加入1滴A型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞，在B管中加入1滴B型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞，在O管中加入1滴O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞；、混勻后，對(duì)稱(chēng)放入離心機(jī)中進(jìn)行1000r/min離心1分鐘（或3400 r/min離心15秒）；、取出后，先觀察是否溶血（溶血可能是陽(yáng)性結(jié)果，或者是細(xì)菌污染），再輕輕搖動(dòng)試管，肉眼觀察有無(wú)凝集現(xiàn)象，肉眼不易分辨的用顯微鏡觀察；根據(jù)有無(wú)凝集現(xiàn)象判定結(jié)

6、果如下。注意凝集強(qiáng)度，此有助于A、B亞型、類(lèi)B或cisAB的發(fā)現(xiàn)。ABO血型A型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞B型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞A型B型O型AB型凝集強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn) （同ABO血型的試管法正定型）質(zhì)量控制和注意事項(xiàng)1、分型標(biāo)準(zhǔn)血清試劑必須為三證齊全的合格產(chǎn)品，質(zhì)量性能符合要求，且在有效期內(nèi)使用。試劑開(kāi)封后必須貼上注有開(kāi)封日期和開(kāi)封人的標(biāo)簽，使用后應(yīng)及時(shí)置于28專(zhuān)用冰箱中保存，以免細(xì)菌污染和變質(zhì)而影響試驗(yàn)結(jié)果。試劑開(kāi)封后有效期為一周。2、商用分型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞試劑必須為三證齊全的合格產(chǎn)品，質(zhì)量性能符合要求，且在有效期內(nèi)使用；自制分型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞試劑必須以3個(gè)健康者同型新鮮紅細(xì)胞混和，用生理鹽水洗滌 13次，以除卻

7、存在于血清中的抗體及可溶性抗原，再制成25%的紅細(xì)胞懸液備用。試劑開(kāi)封或制備后必須貼上注有開(kāi)封或制備日期和開(kāi)封人或制備人的標(biāo)簽，使用后應(yīng)及時(shí)置于28專(zhuān)用冰箱中保存，以免細(xì)菌污染和變質(zhì)而影響試驗(yàn)結(jié)果。試劑開(kāi)封或制備后有效期為一周。3、生理鹽水啟用后，有效期為二周。4、所有試劑在使用時(shí)，必須檢查是否有渾濁、變色、凝集等變質(zhì)現(xiàn)象；凡可疑者，必須更換新的試劑進(jìn)行檢測(cè)。若分型標(biāo)準(zhǔn)血清使用時(shí)間較長(zhǎng)后，最好用已知的ABO標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞檢查結(jié)果是否與已知的血型相符；若分型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞使用時(shí)間較長(zhǎng)后，最好用已知的分型標(biāo)準(zhǔn)血清檢查結(jié)果是否與已知的血型相符，以防標(biāo)準(zhǔn)血清或紅細(xì)胞制品污染、變質(zhì)失效而造成鑒定錯(cuò)誤。5、試管、

8、滴管和玻片必須清潔干燥，防止溶血。6、操作方法應(yīng)按規(guī)定進(jìn)行，一般應(yīng)先加血清，后加紅細(xì)胞懸液，以便容易核實(shí)是否漏加血清。7、IgM抗-A和抗-B與相應(yīng)紅細(xì)胞的反應(yīng)溫度以4為最強(qiáng)，但為了防止冷凝集現(xiàn)象的干擾，一般仍在室溫(2024)內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，37可使反應(yīng)減弱。8、離心時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，速度不宜過(guò)快或過(guò)慢，以防假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。用試管法進(jìn)行ABO血型的正定型時(shí)不能測(cè)出亞型（如AX），需延長(zhǎng)作用時(shí)間。9、在反定型試驗(yàn)中，如果受檢者的血清或血漿與O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，則需要添加自身對(duì)照試驗(yàn)。如果自身對(duì)照試驗(yàn)為陽(yáng)性，表明是自身冷凝集素導(dǎo)致。如果自身對(duì)照試驗(yàn)為陰性，則表明被檢者血清或血漿中可能存

9、在ABO系統(tǒng)以外其它系統(tǒng)的抗體干擾，此時(shí)需做其它相關(guān)試驗(yàn)加以解決上述定型問(wèn)題。10、對(duì)含有較多自身冷凝集素的受檢者，在使用標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行正定型時(shí)往往被誤定為AB型，遇到此種情況，需用37生理鹽水洗滌受檢者的紅細(xì)胞23次，以去除吸附在紅細(xì)胞上的冷凝集素，然后再鑒定血型。11、觀察時(shí)應(yīng)注意紅細(xì)胞呈特異性凝集、繼發(fā)性凝固以及緡錢(qián)狀排列的區(qū)別。對(duì)于可疑結(jié)果，必須更換所用的試劑，重新檢測(cè)。12、對(duì)于可能存在不完全抗原的時(shí)候，應(yīng)在各反應(yīng)中加入凝聚胺試劑，以檢驗(yàn)不完全抗原的存在。13、判斷結(jié)果后應(yīng)仔細(xì)核對(duì)、記錄，避免筆誤。14、25%紅細(xì)胞懸液的配制：先用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，再根據(jù)下表進(jìn)行紅細(xì)胞懸液的配制

10、。懸液濃度（%）壓積紅細(xì)胞（滴）鹽水（滴）2140(2ml)51 16 (0.8ml)臨床應(yīng)用用于檢驗(yàn)人的ABO血型歸屬。血型鑒定的影響因素及解決方法準(zhǔn)確的血型鑒定是臨床安全、有效輸血的重要保證之一，但影響血型鑒定結(jié)果的因素很多。如發(fā)現(xiàn)ABO正反定型結(jié)果不一致，應(yīng)先重復(fù)做1次試驗(yàn)。重復(fù)做試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，使用質(zhì)量合格的試劑，并細(xì)心觀察和解釋試驗(yàn)結(jié)果，就可解決明顯的問(wèn)題。對(duì)一些疑難問(wèn)題必須做如下進(jìn)一步研究： 1、標(biāo)本血標(biāo)本的采集錯(cuò)誤、稀釋和溶血。另從受檢者采集l份新鮮血液標(biāo)本，這樣可以糾正因污染或搞錯(cuò)樣本造成的不合。標(biāo)本一般要求離體后盡快實(shí)驗(yàn)，最長(zhǎng)不能超過(guò)3天，每次輸血后受血者和供血者

11、的血標(biāo)本應(yīng)在28保存7天?；颊叩乃幬锸褂糜袝r(shí)也對(duì)實(shí)驗(yàn)有一定影響，當(dāng)受血者使用肝素治療時(shí)，應(yīng)使用硫酸魚(yú)精蛋白對(duì)抗使標(biāo)本凝集；如果受血者使用右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等治療，應(yīng)注意將紅細(xì)胞洗滌。受檢者紅細(xì)胞上抗原位點(diǎn)過(guò)少(如亞型)或抗原性減弱(見(jiàn)于白血病或惡性腫瘤)，以及類(lèi)B或cisAB等。如疑為A抗原或B抗原減弱，則可將受檢紅細(xì)胞與抗A或抗B血清做吸收及放散試驗(yàn)，以及用受檢者唾液作A、B、H血型物質(zhì)測(cè)定（只對(duì)80HAB分泌型的人有用）。如受檢者為A型血而疑為有類(lèi)B抗原時(shí)，可用下列方法進(jìn)行鑒別：(1) 觀察細(xì)胞與抗A及抗B的凝集強(qiáng)度，與抗A的反應(yīng)要比與抗B的反應(yīng)強(qiáng)，這種區(qū)別用玻片法作試驗(yàn)更

12、為明顯；(2) 用受檢者紅細(xì)胞與自身血清作試驗(yàn)，血清中的抗B不凝集自身紅細(xì)胞上的類(lèi)B抗原；(3) 檢查唾液中是否有A、B物質(zhì)，如果是分泌型，可檢出A物質(zhì)而無(wú)B物質(zhì)；(4) 核對(duì)患者的診斷，類(lèi)B抗原的形成與結(jié)腸癌、直腸癌、革蘭陰性桿菌感染有關(guān)。受檢者血清中蛋白紊亂(高球蛋白血癥)，或?qū)嶒?yàn)時(shí)溫度過(guò)高，常引起紅胞呈緡錢(qián)狀排列。如試驗(yàn)結(jié)果紅細(xì)胞呈緡錢(qián)狀排列，加等滲鹽水l滴?；旌?，往往可使緡錢(qián)現(xiàn)象消失。注意不應(yīng)先加鹽水l滴于受檢者血清中而后和紅細(xì)胞做試驗(yàn)，以免使血清中抗體被稀釋。細(xì)菌污染或遺傳因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因。如發(fā)現(xiàn)多凝集現(xiàn)象，應(yīng)考慮由遺傳產(chǎn)生的Cad抗原活性；被細(xì)菌酶激活

13、的T或TK受體；或產(chǎn)生機(jī)制不太明了的Tn受體所引起。多凝集紅細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：(1)能被人和許多家兔的血清凝集；(2)能與大多數(shù)成年人的血清凝集，不管有無(wú)相應(yīng)的同種抗體。(3)不被臍帶血清凝集。(4)通常不與自身的血清凝集。(5)如有條件可用外源凝集素加以鑒別。 檢者血清中缺乏應(yīng)有的抗-A及或抗B抗體，如丙種球蛋白缺乏癥，老年人血清中抗體水平大幅度下降等。如果試驗(yàn)結(jié)果未見(jiàn)凝集，應(yīng)將細(xì)胞及血清試驗(yàn)至少在室溫和4放置30min，用顯微鏡檢查核實(shí)。血清中有意外抗體，如自身抗I，常引起干擾。用A1、A2、B、O紅細(xì)胞及自身紅細(xì)胞檢查受檢者血清。如果懷疑是抗I，用O型(或ABO相合的)臍血紅細(xì)胞檢查。各

14、種原因引起的紅細(xì)胞溶解，誤判為不凝集。部分溶血時(shí)，可溶性血型物質(zhì)中和了相應(yīng)的抗體。將紅細(xì)胞洗滌數(shù)次，配成25%生理鹽水細(xì)胞懸液，用抗A、抗B、抗Al，抗A十B及抗H做試驗(yàn)可以得到其它有用的信息。對(duì)受檢紅細(xì)胞作直接抗球蛋白試驗(yàn)，如結(jié)果呈陽(yáng)性，表示紅細(xì)胞已被抗體致敏。2、試劑運(yùn)輸、貯存等條件不適可導(dǎo)致試劑變質(zhì)失效，造成配血錯(cuò)誤。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行試劑外觀、效價(jià)等項(xiàng)目質(zhì)量控制。不同抗凝劑制備的標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞質(zhì)量也不同；另外，紅細(xì)胞懸液過(guò)濃或過(guò)淡，抗原抗體比例不適當(dāng)，使反應(yīng)不明顯，易誤判為陰性反應(yīng)。應(yīng)依據(jù)要求正確配制紅細(xì)胞濃度。分型血清效價(jià)太低、親和力不強(qiáng)，如抗A血清效價(jià)不高，可將A亞型誤定為O型、AB型誤定為B

15、型。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行試劑效價(jià)等項(xiàng)目質(zhì)量控制。 3、冷凝集素在ABO血型鑒定和交叉配血的過(guò)程中，冷凝集素是影響ABO血型正反不符和交叉配血不合的常見(jiàn)原因，尤其是在冬天氣溫較低時(shí)，某些病人血清中含有冷凝集素而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性。正常人血清中冷凝集素效價(jià)一般不高，且在4以下時(shí)才有活性。但由于人免疫系統(tǒng)的差異，在惡性腫瘤或病原體感染后有時(shí)冷反應(yīng)性自身抗體可異常增高，造成溶血性貧血。這種冷凝集素效價(jià)在4可高于1000，用37生理鹽水洗滌紅細(xì)胞，操作時(shí)再置于37水浴中輕輕搖動(dòng)可以排除冷凝集素的干擾。 4、自身免疫性溶血性貧血 紅細(xì)胞被自身抗體強(qiáng)烈致敏后將干擾ABO定型，且自身抗體的存在會(huì)導(dǎo)致交叉配血不合，選擇合適

16、的試驗(yàn)方法對(duì)紅細(xì)胞上結(jié)合的抗體做放散處理，確定抗體的特異性。如果抗體屬于同種抗體，則交叉配血時(shí)應(yīng)選取該抗原陰性的獻(xiàn)血者的血液。如果該抗體無(wú)法確定特異性，則交叉配血時(shí)要根據(jù)患者自身紅細(xì)胞與自身血清的對(duì)照反應(yīng)選取較弱反應(yīng)的獻(xiàn)血者血液，因?yàn)樽陨砜贵w的干擾而發(fā)生ABO正反定型不相符時(shí)，可用3745生理鹽水洗滌紅細(xì)胞三次，或者用放散后的紅細(xì)胞（放散方法需不破壞紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)），血清定型則可用洗滌或放散后的紅細(xì)胞將血清中的自身抗體吸收后再進(jìn)行。 5、弱凝集 血型試驗(yàn)是抗原抗體反應(yīng)，當(dāng)患者紅細(xì)胞上抗原異?；蜓逯写嬖贏BO血型以外的不規(guī)則抗體時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致減弱的或缺少的凝集反應(yīng)。抗原異常包括：亞型，這種亞型紅細(xì)

17、胞抗原性較弱，可以通過(guò)亞型定型試劑來(lái)具體定型。紅細(xì)胞抗原形成不足或敏感性降低，如新生兒、老年人及少數(shù)惡病質(zhì)患者。鑒定血型時(shí)要注意正反定型的結(jié)合，加用抗H和抗A，B型標(biāo)準(zhǔn)血清、A2紅細(xì)胞等檢查唾液中的血型物質(zhì)，必要時(shí)作吸收放散試驗(yàn)以確定。若血清中存在不規(guī)則抗體可在反定型用O細(xì)胞加以鑒定，有些亞型因?yàn)榭乖哪承┪稽c(diǎn)缺失，也會(huì)產(chǎn)生相對(duì)于缺失抗原位點(diǎn)的抗體，這些抗體的產(chǎn)生有助于亞型的判定。 6、細(xì)菌性凝集 常見(jiàn)有類(lèi)B凝集，A型或O型病人因大腸桿菌O86感染，從而使紅細(xì)胞上獲得類(lèi)B抗原，能與抗B抗體發(fā)生凝集，表現(xiàn)為B 或AB型。其不受溫度影響，病情好轉(zhuǎn)類(lèi)B凝集即消失。另外紅細(xì)胞被細(xì)菌或細(xì)菌酶污染，紅細(xì)胞

18、上的T抗原被激活，與供血者中抗T抗體發(fā)生凝集。此種凝集在4和37之間隨著溫度的升高凝集程度逐漸減弱，在37時(shí)最弱或消失。 7、混合外觀凝集現(xiàn)象 出現(xiàn)混合外觀凝集的情況時(shí)一般要核對(duì)標(biāo)本，必要時(shí)可重新抽取血樣?；颊咴诮谟羞^(guò)骨髓移植或輸血史、胎盤(pán)出血和白血病等應(yīng)在疾病恢復(fù)后再確定血型。其他原因如嵌合現(xiàn)象、A3亞型及Tn多凝集反應(yīng)等在定型時(shí)可幫助正確判斷血型。 8、不規(guī)則抗體及亞型 血型試驗(yàn)是抗原抗體反應(yīng)，當(dāng)患者血清中存在ABO型以外的IgM或IgG和IgM混合型不規(guī)則抗體時(shí)，必然會(huì)導(dǎo)致ABO正反定型不一致?？赏ㄟ^(guò)測(cè)定唾液中的血型物質(zhì)來(lái)鑒定ABO血型。由于受檢者紅細(xì)胞上有弱抗原，且抗原表達(dá)性特別弱，在紙片定型中很可能被錯(cuò)誤定型，另外抗A/抗B/抗AB血清的效價(jià)低或Ac/Bc/Oc等其他因素的影響，正反定型不相符，也可能被錯(cuò)定或無(wú)法確認(rèn)，應(yīng)用試管鹽水法鏡檢顯示抗-A/抗-B/抗-AB管呈弱的混合外觀，正反定型相符，且經(jīng)吸收放散試驗(yàn)進(jìn)一步確定相應(yīng)的亞型。由于某些亞型紅細(xì)胞與抗A，B血清呈現(xiàn)出特異性反應(yīng)，因此同時(shí)采用抗A，B血清，而在反定型時(shí)加入O細(xì)胞可以檢出部分不規(guī)則抗體。對(duì)ABO血型正反定型不一致的標(biāo)本，正定型時(shí)加入抗-H有助于檢測(cè)紅細(xì)胞表面H抗原的量，對(duì)鑒別亞型具有重要意義，同時(shí)有助于發(fā)現(xiàn)稀有血型，如孟買(mǎi)型等。 9、假凝集血清在室溫和37中，使紅細(xì)