《DNA的粗提取與鑒定》教案

1、學(xué)習(xí)好資料歡迎下載DNA勺粗提取與鑒定【考試說明要求】1 .制備和應(yīng)用固定化酶（A）2 .酵母細(xì)胞的固定化（B）【課堂活動(dòng)】基礎(chǔ)回顧一、實(shí)驗(yàn)原理1. DNA的溶解性DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同,利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度（如2mol/L ）就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反（DNA在濃度為0.14mol/L的NaCl溶液中， 溶解應(yīng)最?。?，以達(dá)到分離目的。此外，DNA不溶于酒精溶液,但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離。2. DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對DNA沒有影響。大多數(shù)

2、蛋白質(zhì)不能忍受60800c的高溫，而DNA在80oC以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜,但對 DNA沒有影響。3. DNA的鑒定在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色,因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。二、實(shí)驗(yàn)材料的選取凡是含有DNA的生物材料都可以考慮, 但是使用DNA含量相對較高 的生物組織,成功的可能性更大， 如皿（原因：DNA含量豐富，材料易得，雞血細(xì)胞吸水易脹破）。若用動(dòng)物組織如豬肝，則需研磨。三、過程1 .破碎細(xì)胞，獲取含 DNA的濾液動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸儲(chǔ)水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先

3、用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋蔥的 DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨,過濾后收集研磨液。注息：為什么加入蒸儲(chǔ)水能使雞血細(xì)胞破裂？蒸儲(chǔ)水對于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌 的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂（細(xì)胞膜和核膜的破裂），從而釋放出DNA加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是 NaCl,有利于DNA的溶解。如果研磨不充分，會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的 DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不

4、到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？可能含有核蛋白、多糖和 RNA等雜質(zhì)。2 .去除濾液中的雜質(zhì)方案一的原理是 DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同； 方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì),不分解DNA ;方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。注息：為什么反復(fù)地溶解與析出DNA ,能夠去除雜質(zhì)？用高鹽濃度的溶液溶解 DNA能除去在高鹽中不能溶解白雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA就能夠除去與 DN夠解度不同的多種雜質(zhì)。方案二與方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取

5、的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DN府口蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA離（6075C的恒溫水浴保溫1015min）。3 . DNA的析出與鑒定將處理后的溶液過濾，加入與濾液體積 蟲管I、冷卻的酒精溶液，靜置23min,溶液中會(huì)出現(xiàn) 白色絲 狀物,這就是粗提取的 DNA 。用玻璃棒 沿一個(gè)方向攪拌,卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。取兩支20ml的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液5ml,將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管前善加入4ml的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜诜兴屑訜?min,待試管冷卻后，比較兩支

6、試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變 避。四、5號項(xiàng)一1.以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每 100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉防止血液凝固。2,加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫,不利于后續(xù)步驟地操作。加入酒精和 用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要 輕緩，以免DNA分子的斷裂，導(dǎo)致 DNA分子不能形成絮狀沉淀。3 .二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果。4 . DNA的溶解度與NaCl溶液濃度的關(guān)系：當(dāng)NaCl溶液濃度低于 0.14mol/L時(shí)，隨濃度的升高， DNA的溶解度降低；當(dāng) NaCl溶液濃度高于 0.14mol/L時(shí)，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。5 .盛放雞血細(xì)

7、胞液的容器，最好是塑料容器。雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA ,容易被玻璃容器吸附，由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會(huì)更少。因此，實(shí)驗(yàn)過程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過程的DNA的損失。診斷檢測1 .下列圖示中能反映 DNA溶解度與NaCl溶液濃度之間關(guān)系的是：0J4T*C 附心moi/L)a 140.14hC 1麗11/11 C0.14KhC 1銀度(ebdI/L)2 .在DNAg提取的實(shí)驗(yàn)過程中，得到白絲狀物主要成分就是DNA依據(jù)是A .絲狀物易溶于2mol/L的氯化鈉溶液中B.絲狀物溶解后，遇二苯胺 （沸水?。┳兯{(lán)色C .絲狀物

8、能在約為 O. 14mol/L氯化鈉溶液中析出D .加酒精可使溶解的絲狀物再被析出3 .在“DNA勺粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中，向5mL血細(xì)胞液中加入 20mL蒸儲(chǔ)水的目的是A.使血細(xì)胞破裂 B.防止血液凝固C. 析出DNA D. 使蛋白質(zhì)與 DN的離4 .在NaCl溶液中反復(fù)溶解、析出并過濾，就能除去DNA容液中的雜質(zhì)的理由不包括（）A .用高濃度鹽溶液溶解 DNA能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)B .用低濃度鹽溶液使 DNAW出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)C .反復(fù)操作就能夠除去與 DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)D .反復(fù)操作就能夠使各種雜質(zhì)變性而沉淀析出典例引路在采用雞血為材料對 DNA進(jìn)行粗提取的

9、實(shí)驗(yàn)中，如果需要進(jìn)一步提取雜質(zhì)較少的DNA可以依據(jù)的原理是（）A.在物質(zhì)的量濃度為 0.14 mol/L 的氯化鈉溶液中 DNA的溶解度最小B.DNA遇二苯胺在沸水浴的條件下會(huì)變成藍(lán)色C.DNA不溶于酒精而細(xì)胞中的一些物質(zhì)易溶于酒精D.質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的檸檬酸鈉溶液具有抗凝血作用有關(guān)DNA粗提取的操作，錯(cuò)誤的是A.向溶解DNA的燒杯中加蒸儲(chǔ)水的目的是漂洗DNA8. DNA和雜質(zhì)分子在95%的冷酒精中溶解度存在差異C.提取植物細(xì)胞DNA時(shí)需在研缽中加入洗滌劑和氯化鈉等試劑D,提取動(dòng)物細(xì)胞 DNA時(shí)可用雞血與蒸儲(chǔ)水混合后用玻璃棒攪拌步界具體措怖分析選材、制備四山刑泡液血+檸檬碓*1 用留

10、心機(jī)離心,再放 沐箱內(nèi)前置仃血紅細(xì)胞Jl郵胞都具 育細(xì)胞核*含火星DNAi 檸像的抗疑劑)使血 液分所叱第胞處丁底部提取的細(xì) 胞核物質(zhì)雞H細(xì)胞液+器蝴水,快速沿個(gè)方向攪拌pmin紗布過濾】川1細(xì)膽吸水漲破.快速 攪拌加速機(jī)細(xì)胞破裂3過濾得到畬染色質(zhì)的 謔液，流出細(xì)胞 膜.細(xì)胞 器等破碎結(jié)構(gòu)溶浦UN A浦海+的NriCl WJXWf) E紗布過濾承溶雜質(zhì)向鹽溶液溶解NA去 除不溶于高器溶液的雜 質(zhì)折出DMA的 粘倒物溶液+菸闌水.輕輕 攪拌析出建狀物(宜 至不再措加為止)”心溶液用當(dāng)于被稀伴到L 11nd L.這濃度 f DMA 的溶薪哽最低向析出過濾多層紗布過濾得到含DMA的黏稠物DNA知粥

11、物再溶靖2mol/L Nal l 溶液 20mL+匕述黏稠物 T解高微溶液溶解HNA.再 次去除不溶于高鹽溶液 的雜質(zhì)過濾用?層紗布過渡融液中A DNJ,去除不滯雜質(zhì)提取畬雜質(zhì)較少的DNA上述濾液+冷卻的 93 酒精 50ml.析出去除溶 發(fā)冷酒精的雜質(zhì)ON A鑒定絲狀物 t 0. OlSmol. LNaCl 溶液 5tnL +4mL二二蕨.沸水浴,對照組不加紇 狀物試管1和試管2的向 變量是心無蛙狀物因變 過為有無淺藍(lán)色出現(xiàn) 令6 015 mol. I. Na(l 清 液溶解DNA歸納總結(jié)1.雞血細(xì)胞的DNA提取2 .實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵 取材不用哺乳動(dòng)物的血細(xì)胞 (由于成熟紅細(xì)胞無細(xì)胞核)。(2)獲取

12、DNA時(shí)要向雞血細(xì)胞液加 入足量的蒸儲(chǔ)水，以便使細(xì)胞膜和核 膜破裂，把核內(nèi)物質(zhì)釋放出來。(3)實(shí)驗(yàn)中的攪拌，除最后一次攪拌外，其余攪拌均要朝一個(gè)方向。 并且， 在析出DNA、DNA再溶解和提取中， 各步驟攪拌都要輕緩，玻璃棒不要直 插燒杯底部，防止 DNA分子斷裂。3 .此實(shí)驗(yàn)過程中有幾次使用蒸儲(chǔ) 水？幾次過濾，幾次析出，幾次攪 拌？答：整個(gè)實(shí)驗(yàn)共“兩次蒸儲(chǔ)水，三次過濾，兩次析出”兩次蒸儲(chǔ)水第一次：細(xì)胞吸水脹破第二次：使DNA黏稠物析出三次過濾第一次：DNA存在于濾液里第二次：DNA被留在紗布上第三次：DNA存在于濾液里過濾時(shí)使用的紗布層數(shù)與需用濾液 或黏稠物有關(guān)，第二次要用其濾出的 黏稠物有

13、關(guān)，所以要使用多層紗布， 第一次和第三次均要用其濾液，使用的紗布為1 2層兩次析出第一次：用 0.14 mol /L的NaCl溶 液,含雜質(zhì)多第二次：用冷卻的95%的酒精4 .預(yù)冷的酒精溶液具有的優(yōu)點(diǎn)抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解。降低分子運(yùn)動(dòng)易于形成沉淀析出。低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。5 .評價(jià)：觀察彳提取的 DNA1色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)基本成功，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的DNA含量低，或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤，需要重新制備本實(shí)驗(yàn)提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)6 .酒精的使用觀察花生種 子子葉細(xì)胞脂

14、肪顆粒時(shí)，用體積分?jǐn)?shù)為50%的酒精洗去浮色葉綠體色素的提取和分離實(shí)驗(yàn)中，用無水酒精作有機(jī)溶劑提取色素制作洋蔥根尖細(xì)胞裝片時(shí)，用鹽酸和酒精的混和液對根尖進(jìn)行解離DNA粗提取過 程中，用體積分?jǐn)?shù)為 95%的冷卻酒精可以進(jìn)一步純化DNA70%勺酒精用于消毒，如果酒的制作變式訓(xùn)練（多選）下列 DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)操作中，經(jīng)離心或過濾后取上清液或?yàn)V液的有A.在新鮮雞血中加入適量的檸檬酸鈉，混合均勻后離心B.在盛有血細(xì)胞的塑料燒杯中加蒸儲(chǔ)水，快速攪拌后過濾C.在2mol/L的氯化鈉溶液 中放入絲狀物，輕輕攪拌后過濾D.在溶有DNA的氯化鈉溶液中緩緩加入蒸儲(chǔ)水，輕輕攪拌后過濾當(dāng)堂反饋1 .下列關(guān)于DNA粗提取

15、與鑒定的說法中，正確的是A.析出DNA時(shí)要緩慢地加蒸儲(chǔ)水，當(dāng)析出黏稠物時(shí)即不再加水B.在探究洗滌劑對植物細(xì)胞DNA提取的影響實(shí)驗(yàn)中，自變量是洗滌劑和食鹽C.提取的DNA溶解后加入二苯胺試劑即可染成藍(lán)色D.將含有DNA的濾液放在60 c75c的恒溫水浴箱中保溫后過濾，能去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)2 .（多）DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中，將含有一定雜質(zhì)的DNA絲狀物分別放入體積為 2mL的四種溶液中，經(jīng)攪拌后過濾，獲得 4種濾液，含DNA$少的是1蒸儲(chǔ)水中攪拌后過濾濾?夜E22mol / L 的 NaCl 溶液攪拌后過濾濾?夜F3O. 14mol/L 的 NaCl 溶液中攪拌后過濾濾?夜G4冷卻的95%的酒精溶

16、液中攪拌后過濾濾?夜HA.濾液E B .濾液FC.濾液G D .濾液H3 .在DNA勺粗提取與鑒定試驗(yàn)中，有兩次 DNA勺沉淀析出，其依據(jù)的原理是DNABNaCl的物質(zhì)的量的濃度為 O.1 4mol /L時(shí)，溶解度最低 DNAB冷卻的體積分?jǐn)?shù)為 95%的酒精中能 沉淀析出A .兩次都是B .兩次都是C.第一次是，第二次是D .第一次是，第二次是4 .（多選）有關(guān) DNA提取的操作，正確的是A.盛放雞血細(xì)胞液的容器最好是塑料容器B.將雞血細(xì)胞液與蒸儲(chǔ)水混合，用玻璃棒沿一個(gè)方向快速攪拌，釋放 DNAC.向溶解DNA勺燒杯中加蒸儲(chǔ)水的目的是漂洗DNAD.用漏斗和濾紙過濾析出的 DNA得到DNA占稠物

17、5 .在DNA粗提取實(shí)驗(yàn)中，為得到含 DNA的黏稠物，某同學(xué)進(jìn)行了如下操作：在新鮮雞血中加入適量的檸檬酸鈉，經(jīng)離心后，除去血漿留下血細(xì)胞備用。取510mL血細(xì)胞放入50mL的塑料燒杯中，并立即注入 20mid . 015mol/L的氯化鈉溶液，快速攪拌5min后經(jīng)濾紙過濾，取得其濾液。濾液中加人40mL2mol/L的氯化鈉溶液，并用玻璃棒一個(gè)方向快速攪拌lmin。上述溶液中緩緩加人蒸儲(chǔ)水，同時(shí)用玻璃棒沿一個(gè)方向不停地輕輕攪拌，同時(shí)加蒸儲(chǔ)水，直到溶液中出現(xiàn)絲狀物為止，再進(jìn)行過濾而得到含DNA的黏稠物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是：所得含 DNA的黏稠物極少，導(dǎo)致下一步實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。請指出并改正該同學(xué)的實(shí)驗(yàn)操作上的

18、三個(gè)錯(cuò)誤：（3分）（標(biāo)明濃度）；提取含雜質(zhì)較少的 DNA的（2分）DNA ,而用動(dòng)物的肝臟組織作為（2）按正確操作提取和過濾黏稠物后，再溶解黏稠物所用的溶劑為方法是。（3）鑒定DNA的試劑是試劑，DNA鑒定時(shí)對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置方法為。（4）采用?；蜓虻难鹤鰧?shí)驗(yàn)，取材方便，但即使正確操作也無法提取到 實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好，原因是，實(shí)驗(yàn)中最好增加一步驟為。（10分）（1） 0. 015mol/L的氯化鈉溶液應(yīng)改為蒸儲(chǔ)水；濾紙應(yīng)改為紗布； 直到溶液中出現(xiàn)絲狀物為止應(yīng)改 為直到溶液中絲狀物不再增加為止( 每項(xiàng)1分)(2) 2mol/L的NaCl溶液加入冷卻的、體積分?jǐn)?shù)為 95%的酒精(3)二苯胺向試管中只加0. 015mol/L的NaCl溶液和二苯胺試劑，不加 DNA ,沸水浴(4)哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核研磨提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)將制備好的雞血細(xì)胞液5 mL10mL注入到50 mL燒杯中。向燒杯中加入蒸儲(chǔ)水20 mL,同時(shí)用玻璃棒充分?jǐn)嚢?5 min