β-苯丙氨酸變位酶基因工程菌的構(gòu)建及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1、- 苯丙氨酸變位酶基因工程菌的構(gòu)建及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化 - 苯丙氨酸變位酶屬于 MIO-依賴氨基變位酶 (MIO-dependent aminomutase), 可催化 - 苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為 - 苯丙氨酸 , 是目前最有效的抗癌藥物紫杉醇的重要前體物質(zhì)。 隨著癌癥在全球范圍內(nèi)發(fā)病率的逐年提升 , - 苯丙氨酸需求量也日益增加。 目前 , 在生產(chǎn)中大量獲取 - 苯丙氨酸的方法主要是化學(xué)拆分法和 Mannich 反應(yīng)法等 , 這些方法步驟復(fù)雜 , 產(chǎn)物難以純化 , 生產(chǎn)成本昂貴還會產(chǎn)生有毒有害的副產(chǎn)物。與這些方法相比 , 酶催化法有著高效、 快捷、安全的巨大優(yōu)勢。 - 苯丙氨酸變位酶作為可以高效催化生成

2、 - 苯丙氨酸的生物催化劑受到了越來越多的關(guān)注。本研究根據(jù) - 苯丙氨酸變位酶 PAM基因序列設(shè)計合成上下游引物 , 利用 PCR技術(shù)擴(kuò)增了目的基因 , 并將其和表達(dá)載體 pET-28a 連接 , 構(gòu)成了表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a-pam。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株 BL21 中, 篩選陽性菌株 , 并通過酶切檢測在菌株內(nèi)是否成功轉(zhuǎn)入目的基因條帶 , 得到一株基因重組菌。 通過對 IPTG 誘導(dǎo)劑的單因素試驗(yàn)確定了最佳誘導(dǎo)劑含量以及最佳誘導(dǎo)時間 , 并對重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。以 SDS-PAGE手段檢測了重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)并對重組酶進(jìn)行了純化。對重組酶的基本酶學(xué)性質(zhì) pH、溫度以及熱穩(wěn)定性進(jìn)行了

3、研究 , 確定了重組酶的最佳催化 pH為 9.0, 最佳催化溫度為 50 , 并對重組酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)其熱穩(wěn)定性較好。 利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對重組菌的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化 , 確定了最優(yōu)發(fā)酵條件為種齡 :12.8 h, 初始 pH:6.7, 發(fā)酵時間 :25.2 h 。在最優(yōu)發(fā)酵條件下 , 重組菌產(chǎn) PAM最大酶活可達(dá) 11.15 U/mL, 較優(yōu)化前提高了 128.9% 。在 3 L 發(fā)酵罐中對重組菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。 利用單因素試驗(yàn)確定了最佳溶氧為30%。分別比較了未添加任何補(bǔ)料的發(fā)酵方式 , 培養(yǎng) 20 h 時流加 30 mL 補(bǔ)料培養(yǎng)基的發(fā)酵方式以及培養(yǎng)30 h 時流加 40 mL 補(bǔ)料培養(yǎng)基的發(fā)酵方式。確定了補(bǔ)料發(fā)酵方式優(yōu)于未進(jìn)行補(bǔ)料的發(fā)酵方式, 并且對比得到在 20 h 時進(jìn)行流加補(bǔ)料的發(fā)酵方式優(yōu)于在30 h 時進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵的方式。以此方式進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵所得最高酶活