‘紅葉’杜仲葉片呈色生理特性及關(guān)鍵基因篩選

1、紅葉杜仲葉片呈色生理特性及關(guān)鍵基因篩選杜仲 (Eucommia ulmoides Oliv.)屬杜仲科 , 僅 1 屬 1 種, 是中國重要的名貴經(jīng)濟(jì)樹種。紅葉杜仲 (Eucommia ulmoides Hongye) 葉片紅褐色 , 極具觀賞價(jià)值 , 且藥用價(jià)值突出 ,2009 年通過河南省林木良種審定。目前對(duì)紅葉杜仲生理特征及呈色規(guī)律研究較少。本論文以紅葉杜仲、 小葉杜仲 (Eucommia ulmoides Xiaoye ) 以及密葉杜仲 (Eucommia ulmoides Miye) 三個(gè)品種苗期的葉片為研究材料,對(duì)其表型性狀、 微觀構(gòu)造、 內(nèi)部各活性成分含量、 光合作用參數(shù)及葉綠素

2、熒光參數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定 , 揭示紅葉杜仲特殊葉色形成的直接原因; 通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出控制紅葉杜仲葉色形成的關(guān)鍵基因。主要研究結(jié)果如下:1. 紅葉杜仲的葉片正面暗紅色 , 背面綠色 , 其他品種的葉片正面和背面均為綠色;紅葉杜仲的柵欄組織呈現(xiàn)鮮紅色, 其他品種的柵欄組織為深綠色。 紅葉 杜仲的亮度(L 值) 為 28.17, 變紅度 (a* 值 ) 為 0.96, 變黃度 (b* 值) 為 2.69, 顏色指數(shù)為 5.54,達(dá)到深紅級(jí)別。紅葉杜仲葉綠素a 含量 (Ca) 為 1.10 mg·g-1, 葉綠素 b 含量 (Cb) 為 0.45mg·g-1, 類胡蘿卜素含量 (

3、CCar) 為 0.45 mg ·g-1, 總?cè)~綠素含量 (CT) 為 1.56mg·g-1, 花色苷含量 (CA) 為 0.30 mg ·g-1, 其 CCar、CA以及 CCar/CT均顯著高于密葉杜仲和小葉杜仲, 而紅葉杜仲和密葉杜仲間的Ca和 Cb及 Ca/Cb 及 CT均無顯著差異。高含量的花色苷是紅葉杜仲葉片呈現(xiàn)紅色的主要原因。 2. 紅葉杜仲葉片最大 , 其葉長、葉寬及葉面積分別為14.44 cm 、6.98 cm 和 77.34 cm2, 顯著高于小葉杜仲。紅葉杜仲的葉片厚度和柵欄組織厚度分別為431.67 m和 186.61 m,其中海綿組織厚度

4、顯著低于 小葉杜仲 , 但其柵欄組織厚度則顯著高于 小葉杜仲。紅葉杜仲黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高, 為 1.70%, 顯著高于其他 2 個(gè)品種 ; 綠原酸和京尼平苷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.47%和 0.29%, 其中綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其他2 個(gè)品種無顯著差異 , 但京尼平苷酸顯著低于密葉杜仲。3. 紅葉杜仲的光補(bǔ)償點(diǎn)為 23.96 mol·m-2·s-1, 光飽和點(diǎn)為 495.94 mol·m-2·s-1, 最大凈光合速率為 16.91 mol·m-2·s-1, 暗呼吸速率 1.67 mol·m-2·s-1, 初始斜率為 0.08

5、;小葉杜仲的光補(bǔ)償點(diǎn)為26.49 mol·m-2·s-1, 光飽和點(diǎn)為 521.92 mol· m-2·s-1, 最大凈光合速率為18.50 mol·m-2·s-1, 暗呼吸速率為 1.67 mol·m-2·s-1, 初始斜率為 0.07; 紅葉杜仲的溫度和各光合參數(shù)間存在顯著的線性回歸關(guān)系 , 回歸方程的決定系數(shù)為 0.480.96 。紅葉杜仲的最小熒光 (Fo) 為 0.36, 顯著低于小葉杜仲 , 而紅葉杜仲 Fv/Fm、Fv/Fo 及 659mol·m-2·s-1 光照條件下的初始熒光

6、(Fo ) 分別為0.81,4.18和 12.4012.50; 顯著高于小葉杜仲 ;2 個(gè)品種的光合作用參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)表明 , 紅葉杜仲利用中強(qiáng)光的能力高于小葉杜仲, 而強(qiáng)光的利用能力弱于 小葉 杜仲。 4.紅葉 杜仲葉色形成過程中 , 其 L 值由 32.89降至 28.45,a* 值由 -8.70 升至 1.03,b* 值由 13.35 降至 2.51,L 值、 a* 值及 b* 值在不同階段間均存在極顯著差異, 且其葉色各指標(biāo)的變化幅度遠(yuǎn)高于小葉杜仲。在紅葉杜仲葉色形成中, 其色素含量除了葉綠素a/ 葉綠素 b 是逐步降低外 , 其他指標(biāo)均為逐步上升 , 且各指標(biāo)在葉色形成的不同階

7、段間均存在極顯著差異 ; 花色苷含量從 0.22 mg·g-1 增至 1.91 mg·g-1, 增幅達(dá) 748.96%,增幅遠(yuǎn)高于小葉杜仲 ;PAL 酶活性在紅葉杜仲葉色形成各階段無顯著差異 , 而 CHI 酶活性在各階段存在顯著差異。葉片色差值與色素含量直接相關(guān),L 值、 a* 值及 b* 值與類胡蘿卜素含量、花色苷的含量及類黃酮含量成極顯著相關(guān);CHI 酶活性和杜仲葉片L 值、 a* 值、 b*值類胡蘿卜素含量、 花色苷含量及類黃酮含量間均存在顯著或者極顯著的相關(guān)關(guān)系 , 而 PAL酶活性與葉片色差值間則無顯著相關(guān)性。5. 本研究采用 RNA-seq技術(shù)對(duì)紅葉杜仲和小葉

8、杜仲的典型葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析, 共得到216,385,416 條 clean reads, 經(jīng)組裝得到 54,517 條 Unigene, 組裝的 N50為 1,377nt, 平均長度為 806.90 nt, 組裝效果較好。共有25,993 條 Unigene 得到注釋 , 注釋比例為 47.68%,其中 27,732 條基因能編碼蛋白序列 , 占總 Unigene 數(shù)量的50.87%。經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè) , 得到 5,854 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子 , 其中 bHLH為 614 個(gè),MYB轉(zhuǎn)錄因子為 569 個(gè) ,NAC為 460 個(gè) , 而 WD40蛋白僅有 60 個(gè)。 54517 條 Unigen

9、es 中共包含17010 個(gè)完整型 SSR位點(diǎn) , 占總 SSR位點(diǎn)的 96.28%。完整型 SSR位點(diǎn)共包含 67種重復(fù)基元 , 其中出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)基元類型為單核苷酸重復(fù)中的A/T(7747個(gè) ), 其次是 AG/CT(5039個(gè)) 和 AT/AT(850 個(gè)) 。從花色苷代謝途徑、類黃酮代謝途徑及類胡蘿卜素代謝途徑中共找到13 個(gè)SSR位點(diǎn)?；虿町惐磉_(dá)分析得到小葉杜仲與紅葉杜仲相比, 差異表達(dá)的基因有 3,904 個(gè), 其中 1,389 個(gè)上調(diào) ,2,515 個(gè)基因下調(diào)。其中 , 差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子 628 個(gè), 其中 MYB轉(zhuǎn)錄因子 26 個(gè),bHLH 轉(zhuǎn)錄因子 49 個(gè), 尚未發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的 WD40轉(zhuǎn)錄因子。通過 pathway 分析得到紅葉杜仲和小葉杜仲在花色苷合成途徑中差異表達(dá)的關(guān)鍵酶基因16 條, 其中類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶 (GT) 基因 9 個(gè), 二氫黃酮醇還原酶 (DFR)基因 5 個(gè), 黃烷酮 -3- 羥化酶 (F3H) 基因 1 個(gè), 類黃酮 3,5 羥化酶 (F3 5H)基因 1 個(gè)。在花色苷合成途徑中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子有3 個(gè) , 其中 2 個(gè) MYB轉(zhuǎn)錄因子 , 均為調(diào)控糖基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ;1 個(gè) b HLH轉(zhuǎn)錄因子。經(jīng)