ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌的育種、發(fā)酵及高產(chǎn)機制的初步生理解析

1、 - 聚賴氨酸產(chǎn)生菌的育種、發(fā)酵及高產(chǎn)機制的初步生理解析 - 聚賴氨酸（ -poly-L-lysine, -PL）是一種由 25-35 個 L- 賴氨酸單體通過 -COOH和-NH₂脫水縮合而成的天然高分子聚合物。由于其易溶于水、對熱穩(wěn)定、可被生物降解、抑菌譜廣泛、安全性高和臨床療效良好等優(yōu)點 , -PL 被作為食品防腐劑、 藥物載體、食療劑、乳化劑和水凝膠等在日本、韓國、美國和中國等國家廣泛應(yīng)用。本文以Streptomyces sp.G67為出發(fā)菌株 ,首先利用多輪復(fù)合誘變、基因組重排結(jié)合核糖體工程, 依次篩選出了的單重和多重抗性突變株菌 , 大

2、幅提高了 -PL 搖瓶產(chǎn)量 , 并從生理角度解釋了高產(chǎn)機制。隨后 , 構(gòu)建并比較了高產(chǎn)菌與原始菌的-PL 合成代謝途徑 , 進一步分析了高產(chǎn)機制。最終建立了一種具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的酸性pH 沖擊 - 溶氧調(diào)控策略（ PS-PAD）, 并考察了該策略在 5 L 補料 - 分批發(fā)酵過程中引起的生理變化。具體研究內(nèi)容如下 :（ 1）紫外（ UV）、常溫常壓等離子體（ARTP）和甲基磺酸乙酯（EMS）誘變?nèi)N方法中 ,ARTP和 EMS的誘變效果明顯好于 UV誘變 , 因此選擇這兩種方法對 G67進行復(fù)合誘變。六種作用于核糖體的抗生素中 , 只有與核糖體工程相關(guān)的鏈霉素、慶大霉素和利福霉素抗性能提高

3、-PL 產(chǎn)量 , 其中鏈霉素抗性（Str^r ）菌 -PL產(chǎn)量提高幅度最大 , 故選擇鏈霉素作為復(fù)合誘變的抗性標(biāo)記。經(jīng)過3 輪“復(fù)合誘變 +Str^r ”篩選 , 獲得了單重抗性高產(chǎn)菌 GS-1,搖瓶產(chǎn)量由 1.9g·L^-1 提高到 2.81 g·L^-1, 提高了 47.9%。擴增片段長度多態(tài)性（ AFLP）分析表明“復(fù)合誘變 +Str^r ”的育種方法

4、能增加突變株的基因多態(tài)性 , 促使其 -PL 產(chǎn)量的快速提高。（2）利用基因組重排結(jié)合慶大霉素抗性（Gen^r）選育多重抗性菌株。首先 , 采用 ARTP誘變構(gòu)建 “ Gen^r突變庫” , 經(jīng)過三輪遞推式基因組重排 , 獲得 Str^rGen^r 雙抗突變株 GSG-1,搖瓶產(chǎn)量為 3.56 g·L^-1, 較 G67提高了 87.3%。 AFLP分析表明“基因組重

5、排+Gen^r”育種方法比誘變更能促進突變株菌基因的多樣化。隨后 , 通過三輪核糖體工程育種, 進一步提高了雙抗突變株的利福霉素抗性（ Rif^r ） , 構(gòu)建了Str^rGen^rRif^r三抗突變株 GSGR-1,搖瓶產(chǎn)量為 4.23 g ·L^-1, 是 G67產(chǎn)量的 2.23 倍。（ 3）首先比較突變株與出發(fā)菌 G6

6、7在菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征、 -PL 搖瓶與 5 L 罐發(fā)酵水平、抗生素抗性與突變位點等方面的差異。隨后, 通過分析突變株在合成 -PL 時菌體的生理變化 , 包括菌體死活 , -PL 合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶活性及轉(zhuǎn)錄水平 , 從生理水平上初步闡釋突變株的高產(chǎn)機制。（4）對原始菌 S.albulus M-Z18和雙重抗性高產(chǎn)菌 Streptomyces sp.GSG-1進行全基因組測序和功能注釋, 利用 KEGG分析構(gòu)建了 -PL 合成代謝圖譜。隨后 ,比較 M-Z18 和 GSG-1在 -PL 合成代謝途徑與核糖體蛋白上的差異, 并推測了GSG-1的高產(chǎn)機制 :GSG-1 與 M-Z18 的 -

7、PL 生物合成途徑大體相同 , 由于乙酰-CoA 連接酶（）、葡萄糖脫氫酶（）、L-Lys 6- 氨基轉(zhuǎn)移酶（）和 L-Lys 氨基變位酶（）的缺失 , 促使 GSG-1的TCA循環(huán)通量增大 , 副產(chǎn)物（如 -D- 葡萄糖 , 酒精）合成量減少 ,L-Lys的分解途徑減弱。最終造成了 GSG-1中心代謝途徑的增強和胞內(nèi)L-Lys 的積累 , 以及 -PL產(chǎn)量的增加。在 5 L 發(fā)酵罐上進行了分批發(fā)酵實驗, 驗證了上述結(jié)論。（5）建立了 pH 沖擊- 溶氧調(diào)控（ pH shock-pH asisted DO control strategy,PS-PAD）策略 , 成功解決了突變株在補料 - 分

8、批發(fā)酵后期菌株呼吸活力減弱, -PL 產(chǎn)率快速下降的問題 , 大幅度提高了突變株的 5 L 罐補料 - 分批發(fā)酵水平。具體步驟是 : （ 1）預(yù)培養(yǎng)階段 :pH 被設(shè)定在 5.5 并維持 10 h;（2）pH沖擊階段 :pH 自然從 4.0 下降至 3.3,維持 5 h; （3）恢復(fù)階段 : 將 pH值設(shè)定為 3.8, 促進菌株快速合成 -PL。（4）補料階段溶氧上升時 , 通過微調(diào) pH（3.8-4.2 ）, 將溶氧控制在 15%-30%之間直至發(fā)酵結(jié)束。應(yīng)用該策略, 突變株 GSGR-1在 5 L 發(fā)酵罐的補料 - 分批發(fā)酵水平達到了 82.3 g·L^-1, 為目前文獻報道的最高水平。 為探索 PS-PAD策略對 -PL 合成代謝的影響 , 比較了 PS-PAD策略與恒定 pH策略下 GSGR-1的生理變化 , 發(fā)現(xiàn) PS-