細胞培養(yǎng)技術復習資料(全)題庫

1、名詞解釋：細胞組織培養(yǎng)：細胞（組織）培養(yǎng)是指從生物體內取出細胞（組織），模擬體內生理環(huán)境，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存、生長并維持其結構和功能的方法。二倍體細胞株：具有二倍體染色體數的細胞株。細胞組織培養(yǎng)選材：根據實驗目的、觀察指標確定所選組織器官。培養(yǎng)選材一般來自胚胎組織的培養(yǎng)物；比成體組織更易生存和生長。這主要是因為胚胎組織有更多的胚胎組織干細胞，它們具有更高的自我更新和多能分化能力。原代培養(yǎng)：一般指從組織中分離在體外生長至傳代之前的細胞培養(yǎng)。這種培養(yǎng)通常是異質性，生長緩慢，但比較能代表原組織的類型并表達原組織特性。缺點是在培養(yǎng)過程中會失去許多原組織的細胞。傳代細胞：原代細胞

2、生長物或細胞系生長到一定階段，分散成單個細胞，按一定比例接種于新的培養(yǎng)容器內稱之傳代。傳代細胞稱之細胞系，可分為兩類：有限細胞系和連續(xù)細胞系。傳代形成的具有各自生物特性或標志的細胞系稱之為細胞株。世代：指細胞經過一次分裂后完成后至下次分裂的過程。細胞富集：當細胞分離純化并不完全徹底，培養(yǎng)物中能達到以某種細胞為主（占絕大多數）的程度。細胞純化：是指從原代培養(yǎng)前成分混雜的異質性細胞懸液中或者從培養(yǎng)物中獲得單一類型細胞的過程。通過細胞分離和純化得到細胞株或系。傳代：也稱為再培養(yǎng)，把一瓶培養(yǎng)細胞全部或分成幾份再培養(yǎng)的過程。組織工程：組織工程是應用生命科學和工程學的原則及方法，在正確認識哺乳動物的正常及

3、病理兩種狀態(tài)下的組織結構與功能關系的基礎上，研究、開發(fā)用于修復、維護、促進人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興學科。Densityinhibition:密度抑制，由于細胞密度過大，培養(yǎng)液營養(yǎng)耗盡、代謝產物過多和生存空間消失所引起細胞增殖的抑制現象。消化液：在原代細胞培養(yǎng)和細胞傳代時，都要用消化液，最常用的是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二鈉（EDTA），其次是一些特殊的組織細胞培養(yǎng)用的各型膠原酶。在原代細胞培養(yǎng)中，使用消化液從組織塊中分離（散）出單個的細胞；在進行細胞傳代時，消化液使細胞脫離生長表面并離散成單個細胞。平衡鹽溶液（BSS）：集緩沖能力、生理鹽水的等滲性以及培養(yǎng)液的營

4、養(yǎng)供應特點于一體，兼具維持滲透壓、緩沖和調節(jié)溶液的酸堿度，同時供給細胞生存所需的能量和無機離子成分的作用，常用的BSS有PBS、Hanks等。清潔液：是一種不含磨蝕性物質，能迅速清除物品上污垢,分解臟污，令物品透明亮如的清潔用品。去分化：指已分化成熟的細胞和組織倒退分化，返回原始幼稚的狀態(tài)。但去分化并不意味著完全返回胚胎時期的原始細胞狀態(tài)，可重新表現出分化特點。接觸抑制：指細胞相互接觸后失去運動（移動）的現象。細胞融合：細胞融合是指兩個或更多個相同或不同細胞通過膜融合形成單個細胞的過程?？稍谧园l(fā)或人工誘導下發(fā)生。它可使兩個不同來源的細胞核在同一細胞中表達相應的功能，這樣的細胞稱異核體，若異核體

5、出現有絲分裂時，則可使兩個不同來源的細胞核的染色體匯聚，形成合并有親本的大核，這樣的細胞稱為雜種細胞或雜交細胞。轉化細胞系：通過某個轉化過程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細胞特點，而獲得無限增殖能力。轉化細胞系具有長期培養(yǎng)，倍增時間短，對培養(yǎng)條件和生長因子等要求較低的特點，適于大規(guī)模工業(yè)化生產。Stemcell:干細胞，是指一類具有自我更新能力和分化潛能的細胞。雜交瘤技術：又稱單克隆抗體制備技術。是指建立雜交瘤細胞系的技術，通常指B淋巴細胞雜交瘤技術，即將骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合，以建立可以分泌單一性抗體的雜交瘤細胞系的技術。雜交瘤細胞：指腫瘤細胞與體細胞融合形成的雜交細胞，它

6、既保留了腫瘤細胞無限繁殖的能力，有具有參與融合的體細胞的一些特征?？寺。褐竿ㄟ^一定方法獲得由單個細胞無性繁殖形成的細胞集落。單克隆抗體（McAb）：B淋巴細胞在抗原刺激下能增殖分化，轉變成產生抗體的漿細胞，若將單個產生特質性抗體的B淋巴細胞分離出來，使之在體外分化增殖，產生一大群即一個克隆的細胞，這樣便可得到大量的、結構相同的、均一的、針對抗原某一決定簇的抗體，這樣由一個克隆B淋巴細胞產生的抗體又稱為單克隆抗體。干細胞：干細胞是人體內最原始的細胞，它具有較強的再生能力，在干細胞因子和多種白細胞介素的聯合作用下可擴增出各類的細胞。其生物學特性有：1.多能性2.自我更新能力3、高度增殖能力群體倍增

7、時間：細胞指數增長期時，細胞群倍增所需的時間密度抑制（densityinhibition）：由于細胞密度過大，培養(yǎng)液營養(yǎng)耗盡、代謝產物過多和生存空間消失所引起細胞增殖的抑制現象生長基質：培養(yǎng)皿表面包被的這層能改善生長表面的特性，促進細胞粘附和貼壁的物質。即生長基質問答：1 簡述體外培養(yǎng)細胞的主要生物學特點。答：體外培養(yǎng)細胞的生物學特點：（1）去分化：體外培養(yǎng),分化特征逐漸減弱，使細胞結構與功能上的“可塑性”增大（2）貼壁鋪展：粘附于固相表面是錨定依賴性細胞生命活動的基本要求。細胞被接種到培養(yǎng)器皿內以后首先要發(fā)生粘附，是細胞培養(yǎng)以后能否成功的第一步.提供什么樣的生長表面是細胞能否成功粘附的主要因

8、素。鋪展是進行生命活動的一種基本的生長特點或生長行為鋪展狀況制約細胞的分裂增殖活動過程，細胞先由圓形變?yōu)閳A餅形（放射狀鋪展細胞）逐漸鋪開伸展成為扁平的極性細胞。極性細胞就是各種有機體細胞是在體外的特征性細胞形態(tài)（3）接觸抑制和密度依賴性生長抑制：細胞生長有密度抑制，血清可降低密度抑制，轉化細胞可降低密度抑制2 簡述成體干細胞的定義與特點。答：成體干細胞是指存在于一種已經分化組織中的未分化細胞，這種細胞能夠自我更新并且能夠特化形成組成該類型組織的細胞。成體干細胞存在于機體的各種組織器官中。成年個體組織中的成體干細胞在正常情況下大多處于休眠狀態(tài)，在病理狀態(tài)或在外因誘導下可以表現出不同程度的再生和更

9、新能力。包括造血干細胞、骨髓間質干細胞及神經干細胞。成體干細胞有以下幾個特點：（1）成體干細胞體積小，細胞器稀少，RNA含量較低，在增殖過程中處于相對靜止狀態(tài)，在組織結構中位置相對固定。（2） 成體干細胞數量很少，其基本功能是參與組織更新，創(chuàng)傷修復及維持機體內環(huán)境穩(wěn)定。（3） 成體干細胞常處于一個有干細胞細胞基質、對干細胞的增殖和分化起調控作用的各種信號分子的特定微環(huán)境或稱生物位中，取決于所在的微環(huán)境和自身的功能狀態(tài)。（4） 成干細胞沒有確定的來源。3 試比較天然和合成培養(yǎng)基的各自優(yōu)缺點。答：1、天然培養(yǎng)基：最初的體外細胞培養(yǎng)，均采用天然培養(yǎng)基。其主要取自動物體液或從動物組織中分離提取。天然培

10、養(yǎng)基（液）的種類很多，包括生物性體液（如血清、血漿）、組織浸液（胚胎浸液）、水解乳蛋白等。優(yōu)點：營養(yǎng)豐富，培養(yǎng)效果良好；缺點：成分復雜，來源受限，影響對某些實驗產物的提取和實驗結果的分析，易發(fā)生支原體污染。2、合成培養(yǎng)基：研究者模擬、借鑒細胞在體內生存生長所需物質的種類和數量，設計出類似體內環(huán)境而適宜細胞在體外生存的各種培養(yǎng)基。優(yōu)點：（1）標準化生產，組成成分及含量明確便于精密地測定培養(yǎng)的細胞與培養(yǎng)液內物質變化的情況。（2）便于控制和調整實驗設計并使培養(yǎng)條件標準化。（3）合成培養(yǎng)液中沒有不透明物質，使得培養(yǎng)的細胞形態(tài)清晰透明，便于觀察記錄。缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。4

11、.簡述細胞培養(yǎng)污染的種類及污染的預防措施。答：細胞污染可分為以下三類：物理性、化學性和生物性，物理污染：主要指溫度、放射線、振動和輻射等?；瘜W污染：主要指血清、培養(yǎng)液及試劑、水、培養(yǎng)用器皿和孵箱等。生物污染：主要指細菌、霉菌和酵母、支原體、病毒、細胞系交叉污染。預防的方法：1。從物品、用品消毒滅菌著手2。從操作者做起：（1）操作者責任心要強，要細心穩(wěn)重，操作技術要熟練。進無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規(guī)定穿隔離衣。（2）操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內打開瓶口，要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實驗完畢及時收拾，保持是鑰匙清

12、潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。3。早期留有充足的凍存儲備，可以復蘇早期凍存細胞使用。5 .試比較治療性克隆與體細胞重新編程。答：項目治療性克隆體細胞重新編程干細胞名稱ES細胞細胞來源供者卵母細胞和患者體細胞技術路徑將體細胞核移植到去核卵母細胞中，形成克隆囊胚后，分離并建立ES細胞系優(yōu)勢ES細胞技術有較豐富的經驗積累，無外源性基因污染主要問題卵母細胞去核技術待改進；克隆胚胎形成效率過低；建立hES細胞系的效率低，且不穩(wěn)定；hES細胞不分化狀態(tài)和多潛能性的條件待優(yōu)化；誘導hES細胞體外定向分化成熟的方案尚不完善；移植治療存在成瘤性風險iPS細胞患者體細胞利用體外基因轉染技術，將轉錄導入 到

13、體細胞核，篩選并建立iPS細胞系取材容易，操作方案相對簡單，技 術體系較穩(wěn)定細胞核重編程的具體過程和導入的 轉錄因子的作用機制不明；制備iPS 細胞的效率低；iPS細胞體外誘導 定向分化的研究經驗較少；逆轉錄 病毒和慢病毒載體導致腫瘤發(fā)生的 潛在風險；轉染基因可能給機體帶 來不利影響不存在倫理學爭議細胞替代治療理論上是最有希望的途徑具有潛在的應用前景倫理問題存在激烈的倫理學爭議其他可能用途制備疾病的新模型以研究發(fā)病機制、藥物篩選和鑒定藥物治療反應等6 .對新建細胞系或株的細胞確認試驗可采用哪些方法？列舉一種或以上方法并說明其原理。答：新建細胞系或株、細胞庫（MCB和WCB）和生產終末細胞應進行

14、鑒別試驗，以確認為本細胞，無其他細胞的交叉污染。細胞鑒別試驗的方法有多種，包括細胞形態(tài)、生物化學法（如同工酶試驗）、免疫學檢測（如HLA、種特異性抗血清）、細胞遺傳學檢測（如染色體核型、標記染色體檢測）、遺傳標志檢測（如DNA指紋圖譜、STR圖譜、基因組二核苷重復序列）等。7 簡述雜交瘤技術產生的三個技術關鍵。答：（1）.B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的特性：B淋巴細胞：接受抗原刺激后，能分泌針對該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。B淋巴細胞本身是一種終末分化細胞，通常不再進行細胞分裂，存活一段時間后便會死亡短命細胞骨髓瘤細胞：惡性增殖的轉化細胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠分裂和存活長命細胞。經

15、篩選與馴化，現已建立多種骨髓瘤細胞株沒有抗體分泌物。（ 2） .細胞融合技術：兩個不同基因型的細胞可形成一個雜種細胞?；具^程包括細胞融合形成異核體、異核體通過細胞有絲分裂進行核融合、最終形成單核的細胞稱為雜種細胞或雜交細胞。常用方法有生物方法：如仙臺病毒化學方法：如聚乙二醇（PEG）物理方法：如電融合。（ 3） .雜交瘤細胞的篩選：人工誘導細胞融合是一個隨機的過程，可能產生多種類型的細胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細胞。應根據其細胞特性來選擇適當的篩選方法（如酶缺陷、藥物抗性標記、營養(yǎng)缺陷、溫度敏感等）。B淋巴細胞：HGPRT+，TK+存活但短命骨髓瘤細胞：HGPRT一或TK一死亡雜交瘤細胞

16、：HGPRT+，TK+存活由此可見，HAT選擇培養(yǎng)基及補救合成途徑酶缺乏的突變細胞株的建立，是細胞融合后選擇出雜交細胞株的關鍵因素。8簡述體外培養(yǎng)癌細胞的三個顯著基本特征。答：腫瘤細胞與體內正常細胞相比，不論在體內或在體外，在形態(tài)、生長增殖、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。體外培養(yǎng)腫瘤細胞的三個顯著基本特征：永生性、不受控增殖性、致瘤性。（1）永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現為細胞可無限傳代而不凋亡。體外培養(yǎng)中的腫瘤細胞系（株）都表現有這種性狀。永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀，受不同基因調控。從一些具有永生性而無惡性的細胞系，如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等細胞可以證明。（2）

17、生長增殖（不受控增殖性）：失去接觸抑制，細胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。失去錨著依賴性，可在瓊脂、甲基纖維素等支撐物上生長。低血清要求，不依賴生長因子，因其可自分泌產生促增殖因子。癌細胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉化后的單個細胞培養(yǎng)時，形成集落（克隆）的能力比正常細胞強。（3）致瘤性。細胞接種同種動物或裸鼠后的致瘤性是客觀反映細胞惡性程度的指標。9.細胞培養(yǎng)目的與用途1. 藥物研究與開發(fā)（1） 新藥篩選:如化學合成藥物藥效研究,中藥有效成分篩選與鑒定等.（2） 疫苗研究與開發(fā):如病毒性疫苗的研究與開發(fā)（肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等）,腫瘤疫苗（多肽疫苗）等.（3） 基因工程藥物研究與開發(fā):如干擾

18、素研究與開發(fā),細胞生長因子研究與開發(fā)等.（4） 細胞工程藥物研究與開發(fā):生物活性多肽研究與開發(fā),人參皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究與開發(fā).（5） 單克隆抗體制備:包括診斷用單克隆抗體,治療用單克隆抗體.基礎研究(1) 藥物作用機理(2) 基因功能(3) 疾病發(fā)生機理2,生物制藥(1) 疫苗生產:如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),腫瘤疫苗(多肽疫苗)等.(2) 基因工程藥物生產:如在臨床醫(yī)學中具有治療價值的一些細胞生長因子如干擾素,粒細胞生長因子,胸腺肽等(3)診斷用和藥用單克隆抗體生產4 4)細胞工程藥物生產:生物細胞內的一些生物活性多肽,生物活性物質等10 .細胞培養(yǎng)基本條件1,合

19、適的細胞培養(yǎng)基養(yǎng)基合適的細胞培養(yǎng)基是體外細胞生長增殖的最重要的條件之一,培養(yǎng)基不僅提供細胞營養(yǎng)和促使細胞生長增殖的基礎物質,而且還提供培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境.2,優(yōu)質血清目前,大多數合成培養(yǎng)基都需要添加血清.血清是細胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一,含有細胞生長所需的多種生長因子及其它營養(yǎng)成分.3,無菌無毒細胞培養(yǎng)環(huán)境無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件.在體外培養(yǎng)的細胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物質污染,或者自身代謝物質積累,可導致細胞中毒死亡.因此,在體外培養(yǎng)細胞時,必須保持細胞生存環(huán)境無菌無毒,及時清除細胞代謝產物.4,恒定的細胞生長

20、溫度維持培養(yǎng)細胞旺盛生長,必須有恒定適宜的溫度.5,合適的氣體環(huán)境氣體是哺乳動物細胞培養(yǎng)生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和二氧化碳.細胞培養(yǎng)基種類與基本成分細胞培養(yǎng)基的種類很多,按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基(目前使用的培養(yǎng)基絕大部分是合成培養(yǎng)基),按其物質狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類.干粉培養(yǎng)基需由實驗者自己配制并滅菌,液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供,用戶可直接使用,非常方便.每種細胞都有其合適的培養(yǎng)基,11 .細胞凍存與復蘇要點與注意事項1、細胞凍存要點(1)冷凍過程要緩慢.需要冷凍保存的細胞先在4冰箱中放置30-60分鐘;然后轉入-20,放置30分鐘;然后再轉入-80放置16-1

21、8小時(或過夜);最后放入液氮中長期保存.有條件的地方,可用程控降溫儀,按每分鐘-1到-3速度降溫,一直到-80以下,然后直接放入液氮中長期保存.(2)凍存細胞必須處在對數生長期,活力大于90%,無微生物污染.(3)細胞濃度控制在：1M07-5M07/ml.(4)使用高濃度血清或蛋白保護劑.一般情況下,用于冷凍保存完全細胞生長培養(yǎng)液中血清濃度大于20%.(5)使用合適的細胞冷凍保護劑,以保護細胞在冷凍過程中免受冰晶破壞.目前,最常用的冷凍保護劑是DMSO(二甲基亞砜),使用終濃度為5-10%.但是,有些細胞系不能用DMSO作為冷凍保護劑,如人白血病細胞系HL-60.因為,DMSO能誘導HL-6

22、0細胞分化.在這種情況下,可選用其它冷凍保護劑,如甘油(glycele),羥乙基淀粉等.特別注意:(1)細胞在冷凍過程中在-20冰箱內放置時間不可超過1小時,以防止冰晶過大而破壞細胞.也可跳過-20這一步驟直接放入-80冰箱中,但這樣做細胞存活率要低一些.(2)DMSO稀釋時會釋放大量熱量.因此,DMSO不能直接加到細胞液中,必須事先配制.(3)DMSO必須是細胞培養(yǎng)級別的.新買的DMSO本身處于無菌狀態(tài),第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管或瓶中,4保存.避免反復凍融造成DMSO裂解產生有害物質.并可減少污染機會.如要過濾DMSO,必須選用耐DMSO的尼龍濾膜.細胞冷凍保存液主要成分:冷凍保

23、護劑,基礎培養(yǎng)液,血清或蛋白.常用細胞冷凍保存液:(1)10%DMSO+完全細胞生長培養(yǎng)液(20%血清+基礎培養(yǎng)液)(2)10%甘油+完全細胞生長培養(yǎng)液(20%血清+基礎培養(yǎng)液)懸浮細胞冷凍保存操作程序(液氮保存法):(1)取對數生長期細胞培養(yǎng)物,離心200-400g5分鐘.用粘附(貼壁)細胞冷凍保存操作程序(液氮保存法):2、冷凍保存細胞的解凍與復蘇要點:(1)快速解凍.凍存細胞從液氮中取出后,應立即放入37水浴中,輕輕搖動冷凍管,使其在1分鐘內全部融化(不要超過3分鐘).(2)解凍操作過程動作要輕.由于冷凍保存過的細胞變得非常脆弱,不僅解凍速度要快,而且動作要輕.一般情況下,解凍后的細胞可

24、直接接種到含完全生長培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng)(1ml凍存細胞液加入到25-30ml新鮮完全培養(yǎng)液中),24小時后再用新鮮完全培養(yǎng)替換舊培養(yǎng)液,以去除DMSO.如果,細胞對冷凍保護劑特別敏感,那么,解凍后的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑,然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中.特別注意:(1)解凍時務必注意安全,預防冷凍管爆裂.,要帶手套,用鑷子將細胞冷凍管從液氮中取出,放入37水浴中.切不可直接用手,以免凍傷.(2)冷凍管在水浴中解凍時,液面不可超過凍存管蓋面,否則,易發(fā)生污染.解凍冷凍保存細胞的離心方法:(1)從液氮中取出凍存的細胞,立即放入37水浴中快速解凍.(2)將1-2ml凍存

25、細胞液加入到25ml新鮮完全細胞生長培養(yǎng)液中,輕輕混勻.(3)用80g離心2-3分鐘,棄上清液.(4)用完全生長培養(yǎng)液輕輕懸浮細胞團,并計數細胞.(5)接種細胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度為3M05/ml.12.細胞傳代要點與注意事項( 1) 代方法貼壁細胞(1)洗掉舊培養(yǎng)液；( 2) 、用無鈣鎂PBS洗滌細胞一至二次；( 3) 、加入適量Trypsin-EDTA溶液方法一：37或溫室作用數分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓顆粒狀時，洗掉消化液，輕敲培養(yǎng)瓶邊緣使細胞自瓶壁脫落，然后加入適量的新鮮培養(yǎng)液，與脫落的細胞或細胞團塊混合均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養(yǎng)瓶中，依正常條件繼續(xù)培養(yǎng)之。方法二：37或室溫作用數分鐘，待細胞自瓶壁脫落后，加入適量含血