細(xì)胞RNA的提取及鑒定、RT-PCR檢測(cè)p53基因的表達(dá)

1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)題目：細(xì)胞RNA的提取及鑒定、RT-PCR僉測(cè)p53基因的表達(dá)報(bào)告人：張銓合作者：殷悅涵實(shí)驗(yàn)日期：一、實(shí)驗(yàn)原理1 .細(xì)胞RNA的提取及鑒定細(xì)胞內(nèi)RNA通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以核蛋白（RNR）的形式存在。分離、制備RNA時(shí)首先須破碎細(xì)胞，使RNP釋放到溶液中并與蛋白質(zhì)分離，然后將RNA同其他的細(xì)胞成分分離開(kāi)并保證RNA的完整性。Trizol法分離提取的RNA產(chǎn)率高、純度好且不易降解，它是一種總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA由于RNase能迅速降解RNA,所以需創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNase的環(huán)境，在各個(gè)環(huán)節(jié)避免它的污染。評(píng)價(jià)RNA質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)是RNA的均一性和完整性，采用紫外分光

2、光度法測(cè)定RNA的濃度和純度，純RNA的A260/280=,實(shí)驗(yàn)室條件下一般在之間，低于該值說(shuō)明有蛋白污染，需要進(jìn)一步抽提。2 .RT-PCR測(cè)p53基因的表達(dá)PCR是一種體外大量擴(kuò)增特異DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，利用已知序列作為引物，將兩引物之間的特定DNA片段進(jìn)行復(fù)制，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)是模板上特定DNA拷貝數(shù)呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)?；具^(guò)程為變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)往復(fù)進(jìn)行，每一輪過(guò)后特定的DNA片段的分子數(shù)增加一倍。RT-PCR等mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后再經(jīng)PCR進(jìn)行大量擴(kuò)增，實(shí)質(zhì)上是對(duì)mRNA的擴(kuò)增，常利用此技術(shù)克隆cDNA或分析某一特異基因在組織細(xì)胞中的表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)先以O(shè)ligo引物

3、來(lái)反轉(zhuǎn)錄合成細(xì)胞cDNA模板，然后采用p53特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析p53在兩種肺癌細(xì)胞（A549和H1299）中的表達(dá)水平。二、實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備材料：肺癌細(xì)胞A549（野生型）和H1299（p53缺失型）、p53引物、GAPDH引物試劑：Trizol試劑、氯仿、異丙醇、無(wú)RNase水、乙醇、PromegaRT-PC威齊I盒、2*TaqPCRmix、DNA染料：GoldView、5*TBE、6*上樣緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、瓊脂糖耗材：Ep管、吸頭、一次性手套、口罩設(shè)備：5415R型冷凍離心機(jī)、NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)、高壓消毒鍋、恒溫干燥箱、制冰機(jī)、

4、可調(diào)式取液器、PCRtZ、電泳儀、電泳槽、紫外檢測(cè)器、凝膠成像系統(tǒng)、冰箱三、實(shí)驗(yàn)步驟1 .細(xì)胞RNA的提取及鑒定（一）RNA提取取1*106個(gè)細(xì)胞與管加氯仿?lián)u勻f4C,12000rpm離心15min分層取上層水相入新的Ep管中加入等體積異丙醇，搖勻，室溫靜置10min-4C,12000rpm離心10min,RNA沉淀一棄上清，力口1ml75%乙醇洗滌沉淀一4C,12000rpm離心5min一棄上清，晾干，用30仙l無(wú)RNase水溶解沉淀（二）RNA濃度和純度測(cè)定取2ulRNA溶液，用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm波長(zhǎng)的OD值，并記錄Abs260/Abs280

5、比值及RNA濃度2 .RT-PC卷測(cè)p53基因的表達(dá)（一）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA預(yù)變性：取一支管加入樣品RNA2ng,以無(wú)水RNaseK補(bǔ)足體積至9l,70C,10min,立即置于冰上。每組做兩份模板不同的PCRK應(yīng)1.取兩只管，分別按下表加入試劑（20口體系，單位：pl）:試齊H1299組A549組2*TaqPCRmix1010p53上游引物11P53下游引物11無(wú)菌蒸儲(chǔ)水77H1299細(xì)胞cDNA模板1-A549細(xì)胞cDNA模板-12.設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù)為:94c預(yù)變性5min94c變性30s58c退火30s72c延伸30s共30個(gè)循環(huán)72c延伸5min（三）RT-PC嚴(yán)物鑒定:1 .配2%&

6、#174;脂糖凝膠：瓊脂糖2g叮BE100ml微波加熱融化；冷卻至60c左右，加入GoldView（DNA染料）5口混勻，灌膠2 .電泳：向水平電泳槽中加入叮BE至恰好浸沒(méi)凝膠約1mm左右取15仙1RT-PC產(chǎn)物上樣,100V電泳2030min結(jié)果觀察：用凝膠成像儀觀察并拍攝電泳結(jié)果，以DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（marker）為參照，分析PCR產(chǎn)物大小及p53在兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況。理論上，A549是p53野生型的細(xì)胞，正常表達(dá)p53,該樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，應(yīng)在390bp的位置出現(xiàn)擴(kuò)增條帶；而H1299是p53缺失型的細(xì)胞，不表達(dá)p53,在相應(yīng)位置沒(méi)有擴(kuò)增條帶。管家基因GAPDH作為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)部參

7、照，在兩種細(xì)胞中均有表達(dá)，電泳后在320bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 .細(xì)胞RNA的提取及鑒定提取到細(xì)胞RNA,用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其Abs260/Abs280為,濃度為祖g/口。2 .RT-PC卷測(cè)p53基因的表達(dá)同排另T本第MAKER五、實(shí)驗(yàn)討論1 .細(xì)胞RNA的提取及鑒定由于在RNA提取實(shí)當(dāng)中，RNA濃度較高，為叱g/口，導(dǎo)致在取2仙g的RNA時(shí)，只需取仙l的RNA溶液，移液器的精度不高，容易造成誤差，因此應(yīng)將溶液稀釋至1卜g/左右再取2仙g的RNA溶液。Abs260/Abs280為，說(shuō)明我們組提取的RNA較為純凈，提取步驟操作良好，幾乎沒(méi)有蛋白質(zhì)的污染，該溶液可以使用到RT-PCR的實(shí)驗(yàn)中。2 .RT-PC卷測(cè)p53基因的表達(dá)可以看到我們組A549細(xì)胞中在390bp的位置出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，H1299在390bp處沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，可說(shuō)明A549細(xì)胞中正常表達(dá)p53