AKTA蛋白純化系統(tǒng)操作

1、AKTA蛋白純化系統(tǒng)操作AKTA蛋白純化系統(tǒng)是當前蛋白純化工作經常用到的一組設備，自動化程度很高。AKTA系統(tǒng)依據不同的配置，可以分為AKTAEXPLORERAKTAPILOTAKTAPURIFIE萼多種型號的設備。以下以AKTAEXPLORE匏例簡單介紹AKTA蛋白純化系統(tǒng)的一般操作。1、認識AKTAAKTAexplorer是為方法開拓及研究應用而設計的全自動液相色譜系統(tǒng)。該色譜系統(tǒng)的分離裝置有三個主要組件，在底部平臺的左側整齊堆起（Fig1）。它們是：FIG1、AKTAEXPLORE在機?Pump-900為雙通道高效梯度泵系列。在AKTAexplorer100,流速范圍0.01-100ml

2、/min,壓力高達10Mpa（泵名為P-901）。在AKTAexplore10,流速范圍0.001-10ml/min,壓力高達25Mpa（泵名為P-903）。?MonitorUV-900,同時監(jiān)控190700nm范圍內高達3個波長的多波長紫外-可見（UV-Vis）監(jiān)測器。（針對部分AKTAPURIFIERL型，尚有UPC-900監(jiān)測器可供選擇，光源為汞燈光源，一次可以監(jiān)控一個波長，安裝濾光片后，可以在選擇的波長范圍內進行切換。）?MonitorpH/C-900,在線電導和pH監(jiān)測的組合監(jiān)測器。AKTAEXPLORER統(tǒng)的主要組成部件可以用模式圖表示（Fig2）。組成部件，如混合器、柱及不同的閥

3、安裝在右邊部分。打開裝閥的門可全部看到。柱被掛在裝閥的門的外側。分離裝置由UNICORN軟件控制。軟件安裝于一獨立的電腦主機之中，在電腦與色譜系統(tǒng)之間的通信由數(shù)據采集裝置CU950進行控制。2、一般操作2.1 開機按位于底部平臺前左側的ON/OFF按鈕，打開色譜系統(tǒng)，然后打開電腦電源。待儀器自檢完畢（CU950上面的3個指示燈完全點亮并不閃爍）。雙擊桌面上UNICORN圖標,進入操作界面。UNICORN的操作界面分為四個窗口（Fig3）Fig3Unicorn的操作界面2.2 準備工作溶液和樣品所有的工作溶液和樣品必須經過0.45的濾膜過濾，樣品也可高速離心后取上清備用。當緩沖液中含有有機溶劑（

4、如乙睛、甲醇），需在使用前用低頻超聲脫氣10min。2.3 清洗及管道準備首先將A泵的進液管道（A1）放入緩沖液或平衡液中，將B泵的進液管道（B1）放入高鹽溶液中，在systemcontrol窗口點擊工具欄內的manual,選擇pump-pumpwashexplorer,選中A1,B1管道為ON,execute。泵清洗將自動結束。（Fig4）2.4 安裝層析柱在manual里選擇pump-flowrate,輸入一定的低流速（Fig5）,insert;選擇Alarm&mon一alarmpressure,設置highalarm（輸入填料或層析柱的耐受壓力，以較低者為設置值，具體可在填料說明

5、書或層析柱說明書中查到），insert,execute（Fig6）.待InjectionValve的1號位管道流出水后接入柱子的柱頭，稍微擰緊后將柱下端的堵頭卸掉接入管道連上紫外流動池。Fig5AKTAExplorer的流速設定操作Fig&AKTAExplorer的限壓設定操作2.5 開始純化：1）在柱子平衡好之后（電導，pH的數(shù)值和變化趨勢穩(wěn)定）即開始上樣了。此時應將紫外調零（Fig7）,選擇Alarm&monfautozero,exectue。Fig7、AKTAExplorer的紫外調零操作2）具體上樣方式：AKTA系統(tǒng)的上樣方式比較靈活，可以根據具體樣品的條件進行上樣，包

6、括用樣品環(huán)上樣、用系統(tǒng)泵上樣、用樣品泵上樣等，這里以用系統(tǒng)泵上樣為例簡單介紹上樣過程。點擊pause,將A1放入樣品中，點擊countine,待樣品上完后，再將A1放入到平衡液中繼續(xù)清洗柱子。3）洗脫：上樣后用緩沖液盡量將穿透峰洗回基線。在manual里選擇pump一gradient,按照自己的工藝選擇targetB(100%)和length(10CV)(Fig8)。Fig&AKTAExplorer的洗脫條件設定操作4)設定收集：選擇Frafractionation_900,輸入每管收集體積，exectue(Fig9)。結束固定體積收集選擇Franfractionation_stop_

7、900,exectue(Fig10)。Fig3AKTAExplorer的組分收集設定操作Fig10、AKTAExplorer的組分收集停止設定操作5)清洗泵及卸下層析柱：將A1和B1入口放入純水中，啟動pumpwashpurifier功能沖洗A泵和B泵及整個管路。然后再將A1和B1入口放入20%乙醇中，同樣操作將乙醇沖滿整個管路保存。再給柱子一個慢流速，設置系統(tǒng)保護壓力，然后先拆柱子的下端，正在滴水的時候將堵頭擰上，再拆柱子的上端，最后擰上上端的堵頭。整個過程中應防止氣泡進入。6)關閉電源：從軟件控制系統(tǒng)的第一個窗口unicornmanager點擊退出，其他窗口不能單獨關閉。然后關閉AKTA主

8、機電源，關閉電腦電源。3、程序設定操作在methodeditor窗口點擊工具欄內的methodwizard,彈出窗口界面如Fig11所示，可以分別在mainselection>column以及columnposition三個下拉菜單中選擇所要用到的層析方法、所用到的層析柱的參數(shù)以及所安裝的層析柱在柱位選擇閥的位置，選好之后，點擊next按鈕進入下一步波長和溶液進口的設定（Fig12）,在此可以設定檢測的波長，針又AKTAEXPLORER!以一次選擇三個波長共同進行監(jiān)控，并在此設定A泵和B泵的溶液進口，設定好之后，點擊next,出現(xiàn)如Fig13所示窗口，可以在此設定對層析柱進行平衡的條件。

9、Fig11Fig12Fig13Fig14完成之后，點擊next出現(xiàn)Fig14的窗口，在此可以設定上樣的條件，可選擇的條件包括上樣的方式，如上樣環(huán)上樣以及樣品泵上樣，對上樣的體積也要進行設定。如果利用系統(tǒng)泵上樣，在此無法進行設置，不過可以利用A泵和B泵的兩個進口在后面的步驟中進行設置。在上步設置完成之后，點擊NEXT出現(xiàn)如Fig15所示窗口，這里是針對流穿組分收集所進行一些設置，針對安裝的不同的收集器，具體內容可能有些差異，這里顯示的界面是在安裝了Frac-950收集器之后所出現(xiàn)的界面，設置完成點擊NEXT出現(xiàn)如Fig16所示的窗口，設置目標組分收集的一些參數(shù)，點擊NEXT,出現(xiàn)如Fig17所示

10、的窗口，針對具體的洗脫條件可以進行設置。當全部設置完成之后，點擊finish,彈出Fig18所示的窗口，可以再一次對所進行的設置進行進一步的修改，完成之后點擊界L按鈕，完成程序存盤操作。至此完成洗脫程序的設定工作，在應用自動洗脫程序時，可在SYSTEMCONTROL點擊文件菜單欄中的FILRun,在彈出的對話框中選擇目標洗脫程序所在的位置并執(zhí)行，之后會依次彈出一些對話框，主要是再次確認程序的設置條件，并選擇洗脫結果文件的保存位置，全部設置完之后，洗脫將自動進行，結果將自動的保存在設定的文件夾中。*V4-Hgb/FIvvRHrmiihFmi<Il-*wV4-ahhie學a“k17rlitj

11、-Kh*L“hKLu+iLi.HE皿IL«A.U«L回Taxi£2CflFrac-TWIia町1nFig16Fig15TilLI-LV0Uta*KraktHVfl-IfS<hdfkffpPjTbJWILIril""1.MH|f®J|3%EDn-Hb0srQ.11L44«tmgy日EihHHpMlLIaULndisUhIi*四七”Fig17Fig184、結果的瀏覽與簡單處理在純化完成后，Unicorn軟件會自動的按照預先的設置保存結果文件，如果沒有指定，那么結果文件會保存于一個文件名以manualN開頭的文件中，N為系統(tǒng)

12、依次生成的一個1-10之間的數(shù)字。對于結果的瀏覽應在evaluation窗口（Fig19）中進行，打開文件及對文件進行普通編輯的菜單如Fig20所示。t-l*ir*VI-I；.iiq6，閨國巾拒FlM十11n.e(ifefli"HnpwYG.MiilS%dkED|nji4*33一CunCvw'JdkGe3"Si3-t<mijJFTT_WT.-.jv-1,r.£"P?廣二則.1%.Fig20純化結果普通編輯菜單這里已經選擇了一個純化文件，可以彈出如Fig21所示的操作菜單,打開后，在結果瀏覽窗口點擊鼠標右鍵，選才Iproperties,可以分

13、別對結果進行編輯，如改變曲線的顏色，設定橫軸或縱軸的顯示區(qū)間，進行文本文件的編輯等等。選擇或設置瀏覽內容3口人.J、Hradn.i'1.Y-AxiiXAxit:Carve：央止lablei3"i>:,在內行Ed.tText:瑞輯支本LavoutLibrary:保育瀏覽搟式CurwstyleandColcrnr：ll|-1棧服及領包Fig21CurcNimes;|11t?Yl：.|4、AKTA蛋白純化系統(tǒng)的日常維護4.1 每天，當實驗完成系統(tǒng)使用結束后，應盡可能避免保存于緩沖液中過夜，尤以高鹽濃度洗脫緩沖液為甚！假如，不能避免，則緊記次日盡早用SystemWashMethod完成以蒸儲水將系統(tǒng)徹底清洗，再予以保存或再更新使用其它緩沖液，再次投入使用進行實驗操作。用蒸播水將余下的緩沖液徹底沖洗出系統(tǒng)，這步驟至關重要。此舉不但可以避免緩沖液對系統(tǒng)造成腐蝕機會，甚或因使用高鹽濃度緩沖液保存過久造成鹽結晶等的堵塞，