單個實驗室化學檢測方法的確認

1、單個實驗室化學檢測方法的確認單個實驗室化學檢測方法的確認National Association of Testing Authorities(NATA)概要概要 基本情況基本情況 單個實驗室方法確認的接受單個實驗室方法確認的接受 什么是確認方法？什么是確認方法？ 什么是方法確認？什么是方法確認？ 化學檢測方法確認需要十個步驟化學檢測方法確認需要十個步驟例如例如: 確認一個方法去檢測動物組織中抗生素的殘留確認一個方法去檢測動物組織中抗生素的殘留基本情況基本情況 NATA Technical Note 17 (new version) IUPAC Harmonized Guidelines fo

2、r Single Lab. Validation LGC (UK) In-house Method Validation a Guide for Chemical Laboratories標準方法標準方法 Organisation for International Standardisation (ISO) American Society for Testing Materials (ASTM) Association of Official Agricultural Chemists (AOAC) Standards Australia British StandardsPublicat

3、ion of Standard Methods a specialist, core business of the organisations concerned標準方法標準方法 要通過很多實驗室的合作研究來確認要通過很多實驗室的合作研究來確認.過程慢過程慢 在方法需要與方法建立之間有很長的時間滯后性在方法需要與方法建立之間有很長的時間滯后性方法驗證方法驗證Method Verification 沒有方法確認這么嚴格沒有方法確認這么嚴格 是否實驗室運行都得要專門的標準方法是否實驗室運行都得要專門的標準方法?單個實驗室方法確認的承認單個實驗室方法確認的承認 EU (Decision 2002/

4、657/EU) Codex Committees Methods of Analysis and Sampling Residues of Veterinary Drugs in Foods Pesticide Residues National Regulators APVMA AQIS FSANZ NRS States & Territories 貿(mào)易伙伴貿(mào)易伙伴Trading Partners 什么是確認方法什么是確認方法? 該方法被證明適用于該目的該方法被證明適用于該目的 使用該方法所測得結(jié)果可靠使用該方法所測得結(jié)果可靠; 結(jié)果合理可用于作決定結(jié)果合理可用于作決定什么是方法確認

5、什么是方法確認? 系統(tǒng)評價一個方法，提供客觀證據(jù)證明該方法能夠滿系統(tǒng)評價一個方法，提供客觀證據(jù)證明該方法能夠滿足特定檢測目標的需要。足特定檢測目標的需要。 證明該方法是符合證明該方法是符合NATA要求的。要求的。 方法確認方法確認16107893542VALIDATED METHOD61078935421步驟步驟1: 方法的具本要求方法的具本要求為特定明確用途的特殊需求為特定明確用途的特殊需求.需要對所發(fā)展的方法需要對所發(fā)展的方法的檢測對象有的具本要求。的檢測對象有的具本要求。什么是方法的需要什么是方法的需要? 你要檢測什么你要檢測什么? 在什么樣品基質(zhì)中在什么樣品基質(zhì)中? 你需要檢測到什么濃

6、度水平你需要檢測到什么濃度水平? 對結(jié)果你需要有多大可靠性對結(jié)果你需要有多大可靠性? 多少濃度范圍多少濃度范圍? 是否客戶還有其它特殊需要是否客戶還有其它特殊需要?例如：具本要求例如：具本要求: 動物組織中抗生素殘留檢測動物組織中抗生素殘留檢測自由自由化合物化合物 或或 結(jié)合化合物結(jié)合化合物?僅母體僅母體, 或母體加代謝物或母體加代謝物?特殊動物組織特殊動物組織, 如如. 豬的腎臟豬的腎臟調(diào)整檢測限調(diào)整檢測限, 所需的定量限（所需的定量限（ LOQ）?在定量限（在定量限（ LOQ）或）或 MRL值上的可接受的確證限值上的可接受的確證限?樣品里的預期濃度樣品里的預期濃度?所需的檢測周期所需的檢測

7、周期?多個的還是單個樣品多個的還是單個樣品?步驟步驟 1: 方法的具本要求方法的具本要求對這些具本要求的確認將根本定義方法的范圍對這些具本要求的確認將根本定義方法的范圍步驟步驟 1: 方法的具體要求方法的具體要求為了確認方法的具本要求為了確認方法的具本要求,還有哪些方法的工作特性還有哪些方法的工作特性需要發(fā)展呢需要發(fā)展呢?以下九個步驟以下九個步驟VALIDATED METHODDEVELOP SPECS6107893542步驟步驟 2: 方法選擇性方法選擇性在在(與樣品一起提取出的與樣品一起提取出的)干擾存在下檢測結(jié)果的準確性干擾存在下檢測結(jié)果的準確性目標目標: 沒有重大干擾沒有重大干擾 方法

8、內(nèi)在的選擇性變化方法內(nèi)在的選擇性變化 通過分析含有可能干擾的樣品來檢查通過分析含有可能干擾的樣品來檢查例如：方法選擇性例如：方法選擇性: 動物組織中抗生素的殘留檢測動物組織中抗生素的殘留檢測進行系列在日常檢測中可能碰到的樣品基質(zhì)試驗進行系列在日常檢測中可能碰到的樣品基質(zhì)試驗用交叉反應法檢查用交叉反應法檢查(如免疫測定法如免疫測定法)VALIDATED METHODDEVELOP SPECS61078954 SELECTIVITY3步驟步驟 3: 線性范圍線性范圍對方法而言是用一個計算模型去定義儀器響應與濃度對方法而言是用一個計算模型去定義儀器響應與濃度之間的關(guān)系之間的關(guān)系通常線性模型由圖表表示

9、通常線性模型由圖表表示測定線性范圍要求測定線性范圍要求: 6點校準標樣，每點重復測定兩次點校準標樣，每點重復測定兩次 在可能濃度的在可能濃度的0-150% 或或 50-150%嚴格評價數(shù)據(jù)嚴格評價數(shù)據(jù), 不要只依賴不要只依賴 r2 值值R2 = 0.984Response vs ConcentrationR2 = 0.98402468101214160102030405060CONCENTRATIONRESPONSE步驟步驟 3: 線性范圍線性范圍對方法而言是用一個計算模型去定義儀器響應與濃度對方法而言是用一個計算模型去定義儀器響應與濃度之間的關(guān)系之間的關(guān)系通常線性模型由圖表表示通常線性模型由

10、圖表表示測定線性范圍測定線性范圍: 6點校準標樣，每點重復測定兩次點校準標樣，每點重復測定兩次 在可能濃度的在可能濃度的0-150% 或或 50-150%嚴格評價數(shù)據(jù)嚴格評價數(shù)據(jù), 不要只依賴不要只依賴 r2 值值還要考慮可能的基質(zhì)效應還要考慮可能的基質(zhì)效應Response vs Concentration02468100246810CONCENTRATIONRESPONSEwith matrixwithout matrixResponse vs Concentration02468100246810CONCENTRATIONRESPONSE(additive effect)without m

11、atrixwith matrix 例如：線性范圍例如：線性范圍: 動物組織中抗生素殘留檢測動物組織中抗生素殘留檢測 所有方法應用的基本原則所有方法應用的基本原則 檢查所有目標化合物的線性檢查所有目標化合物的線性 范圍覆蓋期望濃度的范圍覆蓋期望濃度的 0150% 清楚基質(zhì)效應清楚基質(zhì)效應VALIDATED METHODDEVELOP SPECS6107895 SELECTIVITY LINEARITY4步驟步驟 4: 靈敏度靈敏度響應變化與濃度變化的比例響應變化與濃度變化的比例例如：靈敏度例如：靈敏度: 抗生素在動物組織中的殘留檢測抗生素在動物組織中的殘留檢測 可能每天變化可能每天變化 每天例行

12、檢查保證滿意的靈敏度每天例行檢查保證滿意的靈敏度 操作時帶入部分操作時帶入部分QC(質(zhì)量控制質(zhì)量控制)樣品樣品VALIDATED METHODDEVELOP SPECS610789 SELECTIVITY LINEARITY SENSITIVITY5步驟步驟 5: 精確度與準確度精確度與準確度兩部分內(nèi)容兩部分內(nèi)容;精確度精確度; 隨機誤差隨機誤差準確度準確度(真實度真實度); 系統(tǒng)誤差系統(tǒng)誤差 (與真值的偏離與真值的偏離)步驟步驟 5: 精確度與準確度精確度與準確度精確度精確度 重復測定間的預期符合水平重復測定間的預期符合水平精確度的不同測定方法精確度的不同測定方法; 可重復性可重復性 可重現(xiàn)

13、性可重現(xiàn)性 實驗室內(nèi)部的重現(xiàn)性實驗室內(nèi)部的重現(xiàn)性 (通常使用的最好反映通常使用的最好反映)通過對獨立準備的合適樣品組分重復分析來測定通過對獨立準備的合適樣品組分重復分析來測定 有典型分析濃度的真實樣品有典型分析濃度的真實樣品 添加回收添加回收 樣品樣品 步驟步驟5:精確度與準確度精確度與準確度 準確度準確度 檢測結(jié)果與真值的接近程度檢測結(jié)果與真值的接近程度 (或者與公認的參考值的接近程度或者與公認的參考值的接近程度)通過含有已知濃度的樣品的重復分析來測定通過含有已知濃度的樣品的重復分析來測定; 添加回收添加回收 樣品樣品或其它不常用方法或其它不常用方法;即通過與已知系統(tǒng)偏差的參考方法來比較即通

14、過與已知系統(tǒng)偏差的參考方法來比較 例如例如:準確度與精確度準確度與精確度: 動物組織中抗生素殘留檢測動物組織中抗生素殘留檢測 實驗室內(nèi)檢測的重現(xiàn)性實驗室內(nèi)檢測的重現(xiàn)性, 更適合用含有已知殘留的樣品來進行更適合用含有已知殘留的樣品來進行 回收率通常是重要的指標回收率通常是重要的指標 CRMs 或或 RMs 很難得到很難得到 需要依賴添加回收樣品需要依賴添加回收樣品 100% 的回收率并不能保證結(jié)果的真實性的回收率并不能保證結(jié)果的真實性 對樣品中含有已知殘留物的添加回收很重要對樣品中含有已知殘留物的添加回收很重要 可能的話通過可能的話通過PT? 確證回收率確證回收率VALIDATED METHOD

15、DEVELOP SPECS10789ACCURACY SELECTIVITY LINEARITYTRUENESS PRECISION SENSITIVITY6步驟步驟 6: 檢測限與定量限（檢測限與定量限（LOD & LOQ）檢測限檢測限能可靠檢測到的最低濃度能可靠檢測到的最低濃度 通常用在一種樣品基質(zhì)中的倍信噪比表示通常用在一種樣品基質(zhì)中的倍信噪比表示定量限定量限能檢測到的有可接受不確定度的最低濃度能檢測到的有可接受不確定度的最低濃度 通常通常,定量限是檢測限的倍定量限是檢測限的倍 沒必要對所有方法都要有確定的檢測限與定量限沒必要對所有方法都要有確定的檢測限與定量限步驟步驟 6: 檢

16、測限與定量限檢測限與定量限(LOD & LOQ)檢測限檢測限 標準溶液的信噪比標準溶液的信噪比(S/N)不是一個適當?shù)挠嬎銠z測限的方法不是一個適當?shù)挠嬎銠z測限的方法通過重復分析經(jīng)過所有測試步驟的樣品所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計而得通過重復分析經(jīng)過所有測試步驟的樣品所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計而得例：檢測限與定量限例：檢測限與定量限: 動物組織中抗生素殘留檢測動物組織中抗生素殘留檢測 非常重要典型的殘留檢測方法非常重要典型的殘留檢測方法 對確切的目標有詳細的要求對確切的目標有詳細的要求 對每一個的檢測對象有不同的檢測限與定量限對每一個的檢測對象有不同的檢測限與定量限 報告的結(jié)果表述為報告的結(jié)果表述為“未檢出未檢出”有重

17、要意義有重要意義NATA 要求對痕量有機物殘留進行確證要求對痕量有機物殘留進行確證 檢測限檢測限 = 能被有效檢測到與確證的最低濃度能被有效檢測到與確證的最低濃度 VALIDATED METHODDEVELOP SPECSLOD&LOQ1089ACCURACY SELECTIVITY LINEARITY SENSITIVITY7TRUENESS PRECISION步驟步驟 7: 線性范圍線性范圍方法的工作范圍，該方法下對結(jié)果有一個可接受的不確定方法的工作范圍，該方法下對結(jié)果有一個可接受的不確定度水平度水平 定量限定量限 線性校正范圍的高限（即最下限）線性校正范圍的高限（即最下限） 定量

18、限定量限 用在方法確認中的最低濃度用在方法確認中的最低濃度例：線性范圍例：線性范圍: 動物組織中抗生素殘留檢測動物組織中抗生素殘留檢測 定量限定量限 能可靠定量的最低濃度能可靠定量的最低濃度VALIDATED METHODDEVELOP SPECS10RANGE9LOD&LOQACCURACY SELECTIVITY LINEARITY SENSITIVITY8TRUENESS PRECISION步驟步驟 8: 方法適應性方法適應性方法中對微小變化的適應性方法中對微小變化的適應性 象象 pH, 溫度溫度, 流速流速,試劑濃度試劑濃度, 提取時間等的微小變化的影響提取時間等的微小變化的影

19、響. 方法的發(fā)展與實驗室內(nèi)重現(xiàn)性的研究將提醒化學家可能的潛方法的發(fā)展與實驗室內(nèi)重現(xiàn)性的研究將提醒化學家可能的潛在影響在影響 可能的影響可以通過一次或同時進行的仔細設(shè)計的試驗來評可能的影響可以通過一次或同時進行的仔細設(shè)計的試驗來評估估 介紹限制影響的控制方法介紹限制影響的控制方法例：方法適應性例：方法適應性: 動物組織中抗生素殘留檢測動物組織中抗生素殘留檢測 在方法發(fā)展中經(jīng)常在方法發(fā)展中經(jīng)常使用使用在方法發(fā)展和或確認中研究任何確定的影響在方法發(fā)展和或確認中研究任何確定的影響 必要的話必要的話, 介紹在可接受的限度內(nèi)減少影響的控制方法介紹在可接受的限度內(nèi)減少影響的控制方法 方法偏差方法偏差 方法修

20、正方法修正 內(nèi)標內(nèi)標VALIDATED METHODDEVELOP SPECS10RANGELOD&LOQACCURACY SELECTIVITY LINEARITY SENSITIVITY RUGGEDNESS9TRUENESS PRECISION步驟步驟 9: 計算不確定度計算不確定度與計算結(jié)果關(guān)聯(lián)的一個參數(shù)，用于表示所得結(jié)果的離差情與計算結(jié)果關(guān)聯(lián)的一個參數(shù)，用于表示所得結(jié)果的離差情況況ISO 17025 和和 NATA要求要求 方法的不確定度知識對結(jié)果的比較以及判定結(jié)果的合法性或方法的不確定度知識對結(jié)果的比較以及判定結(jié)果的合法性或調(diào)整檢測限都是必要的調(diào)整檢測限都是必要的 好的確認

21、結(jié)果會有一個合理的不確定度好的確認結(jié)果會有一個合理的不確定度 不確定度的估算對于檢測對象及其結(jié)果的使用應該是合理的不確定度的估算對于檢測對象及其結(jié)果的使用應該是合理的例例:方法不確定度估算方法不確定度估算: 抗生素在動物組織中的殘留抗生素在動物組織中的殘留 估算定量限及其相關(guān)控制濃度結(jié)果的不確定度估算定量限及其相關(guān)控制濃度結(jié)果的不確定度 對方法所檢測的每一個化合物者估算其結(jié)果的不確度對方法所檢測的每一個化合物者估算其結(jié)果的不確度VALIDATED METHODDEVELOP SPECS MURANGELOD&LOQACCURACY SELECTIVITY LINEARITY SENSI

22、TIVITY RUGGEDNESS10TRUENESS PRECISION步驟步驟 10: 溯源溯源檢測結(jié)果必須要溯源到一定的標準檢測結(jié)果必須要溯源到一定的標準,通常是通過完整的關(guān)系通常是通過完整的關(guān)系鏈溯源到國家或國際標準鏈溯源到國家或國際標準,所有的步驟都有相應的不確定度所有的步驟都有相應的不確定度 沒有計算不確定度無法溯源沒有計算不確定度無法溯源 方法確認對溯源而已是首要步驟方法確認對溯源而已是首要步驟以下是量值溯源圖以下是量值溯源圖Traceable Chemical Test ResultsPhysical MeasurementsChemical Measurements例例:溯源溯源: 動物組織中抗生素的殘留動物組織中抗生素的殘留 保證分析所用標準品都被檢定過保證分析所用標準